BR112021005626A2 - mutante de proteína l1 de papilomavírus humano de tipo 51 - Google Patents

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Jie Chen
Ying Gu
Jun Zhang
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Abstract

A presente invenção refere-se a uma proteína L1 de HPV5 mutante ou uma variante da mesma, uma sequência codificadora da mesma, um método de preparação para a mesma e uma partícula similar a vírus que contém a mesma, em que a proteína ou a variante e a partícula similar a vírus da mesma são capazes de induzir a anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV51 e HPV69 ou HPV51, HPV69 e HPV26). A presente invenção também se refere ao uso da proteína e da partícula similar a vírus supracitadas para a preparação de uma composição farmacêutica ou uma vacina, em que a composição farmacêutica ou a vacina pode ser usada para prevenir infecções por pelo menos dois tipos de HPV e doenças causadas por infecções, tais como câncer cervical e condiloma acuminado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MU- TANTE DE PROTEÍNA L1 DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO DE TIPO 51".
[001] O pedido se baseia em e reivindica o benefício de priorida- de do pedido Chinês Nº 201811122822.1, depositado em 26 de se- tembro de 2018, cujas descrições são incorporadas ao presente do- cumento a título de referência na íntegra. Campo Técnico
[002] O pedido refere-se ao campo da virologia molecular e imu- nologia. Em particular, a invenção refere-se a uma proteína L1 de HPV51 mutante (ou uma variante da mesma), uma sequência que co- difica a mesma, um método para a preparação da mesma e uma partí- cula similar a vírus que compreende a mesma, em que a proteína (ou uma variante da mesma)) e a partícula similar a vírus pode induzir à geração de anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV51 e HPV69, ou HPV51, HPV69 e HPV26) e, portanto, pode ser usada para prevenir a infecção pelos ditos pelo me- nos dois tipos de HPV, e uma doença causada por esta infecção, tal como câncer do colo do útero e condiloma acuminado. A invenção re- fere-se ainda ao uso da proteína e da partícula similar a vírus na fabri- cação de uma composição farmacêutica ou uma vacina para prevenir a infecção pelos ditos pelo menos dois tipos de HPV e uma doença causada pela dita infecção, tal como câncer do colo do útero e con- diloma acuminado. Técnica antecedente
[003] O papilomavírus humano (HPV) causa principalmen- te verrugas na pele e nas mucosas. Os tipos de HPV são divididos em tipos de alto risco e tipos de baixo risco, dependendo de sua associa- ção com a tumorigênese. Dentre eles, a infecção por tipos de HPV de alto risco demonstrou ser a principal causa de câncer genital, incluindo câncer do colo do útero em mulheres; e os tipos de HPV de baixo risco causam principalmente condiloma acuminado. A maneira mais eficaz de prevenir e controlar a infecção pelo HPV é tomar vacinas contra o HPV, particularmente vacinas contra tipos de HPV de alto risco que causam câncer do colo do útero.
[004] A proteína L1 da cápside principal do HPV tem a caracterís- tica de se automontar em partículas similares a vírus (Virus-Like Parti- cle, VLP) ocas. VLP de HPV tem uma estrutura icosaédrica simétri- ca composta por 72 pentâmeros da proteína L1 da cápside principal (Doorbar, J. e P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61 (9): 2793-9). A VLP de HPV é altamente similar ao HPV natural em termos de estrutura, retém a maioria dos epítopos neutralizantes do vírus natural e pode induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci USA 89 (24): 12180-4).
[005] Os estudos existentes mostram que as VLPs de HPV indu- zem principalmente à geração de anticorpos neutralizantes contra o mesmo tipo de HPV, produzem imunidade protetora contra o mesmo tipo de HPV e têm apenas um baixo efeito protetor cruzada entre al- guns tipos de HPV altamente homólogos (Sara L. Bissett, Giada Mat- tiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32: 6548-6555). Portanto, as vacinas exis- tentes contra o HPV têm uma faixa de proteção muito limitada. Em ge- ral, a VLP de apenas um tipo de HPV pode ser usada para prevenir a infecção pelo mesmo tipo de HPV. Neste caso, se for necessário am- pliar a faixa de proteção das vacinas contra o HPV, a única maneira é adicionar VLPs de mais tipos de HPV nas vacinas. Atualmente, as va- cinas contra o HPV comercialmente disponíveis, incluindo Gardasil (a qual é uma vacina quadrivalente contra HPV16, 18, 6 e 11) e Gar- dasil9 (a qual é uma vacina 9-valente contra HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 e 58) da Merck e Cervarix (a qual é uma vacina bivalente contra HPV16 e 18) da GSK, são preparadas ao combinar VLPs de vários tipos de HPV. No entanto, tal solução aumentaria muito o custo de produção das vacinas contra o HPV e poderia causar problemas de segurança em virtude de aumento da dose imunizante.
[006] Portanto, é urgente na técnica desenvolver partículas simi- lares ao vírus do HPV capazes de induzir à geração de anticorpos neutralizantes protetores contra vários tipos de HPV, de modo a pre- venir a infecção por vários tipos de HPV e uma doença causada pela infecção, tal como câncer do colo do útero e condiloma acuminado, de forma mais econômica e eficaz. Conteúdo da Invenção
[007] O pedido se baseia, pelo menos em parte, na descoberta surpreendente dos inventores: após a substituição de um segmento específico da proteína L1 do Papilomavírus Humano (HPV) de Tipo 51 pelo segmento correspondente da proteína L1 de um segundo tipo de HPV (tal como HPV69), a proteína L1 de HPV51 mutante assim obtida pode induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV51 e o segundo tipo de HPV (tal como HPV69) em orga- nismos, e seu efeito protetor é comparável àquele de uma mistura de VLPs de HPV51 e VLP do segundo tipo de HPV, seu efeito protetor contra HPV51 é comparável àquele da VLP de HPV51 individualmente e seu efeito protetor contra o segundo tipo de HPV (tal como HPV69) é comparável àquele da VLP do segundo tipo de HPV individualmente.
[008] Além disso, com base na substituição acima, outro segmen- to específico da proteína L1 de HPV51 pode ser ainda substituído pelo segmento correspondente da proteína L1 de um terceiro tipo de HPV (tal como HPV26) e a proteína L1 de HPV51 mutante que tem substi- tuições duplas assim obtida pode induzir à geração de anticorpos neu- tralizantes de alta titulação contra HPV51, o segundo tipo de HPV (tal como HPV69) e o terceiro tipo de HPV (tal como HPV26), e seu efeito protetor é comparável àquele de uma mistura de VLPs de HPV51, VLP do segundo tipo de HPV e VLP do terceiro tipo de HPV.
[009] Portanto, em um aspecto, o pedido fornece uma proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma em que, comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem, a proteína L1 de HPV51 mutante tem as seguintes mutações: (1) truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem; e a mutação conforme de- finido em (2)(a), (2)(b), (2)(c) ou (2)(d): (2) (a) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem; (2) (b) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem; (2) (c) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem; (2)(d) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem, e a variante difere da proteína L1 de HPV51 mutante ape- nas quanto a uma substituição (de preferência substituição conservati- va), adição ou eliminação de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17) aminoácidos e retém a função da proteína L1 de HPV51 mutante, ou seja, a capacidade de induzir à geração de anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV51 e HPV69).
[010] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação conforme definido em (1) e (2)(a) e, opcionalmente, tem ainda uma mutação conforme definido em (3)(b).
[011] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação conforme definido em (1) e (2)(b) e, opcionalmente, tem ainda uma mutação conforme definido em (3)(c).
[012] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação conforme definido em (1) e (2)(c) e, opcionalmente, ainda tem uma mutação conforme definido em (3)(a) ou (3)(b).
[013] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação conforme definido em (1) e (2)(d) e, opcionalmente, tem ainda uma mutação conforme definido em (3)(b).
[014] As mutações conforme definido em (3)(a), (3)(b) ou (3)(c) são as seguintes: (3)(a) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem; (3)(b) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoáci- dos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem; (3)(c) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoáci- dos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem;
[015] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem 9 aminoácidos truncados no N-término comparado com a proteína
L1 de HPV51 de tipo selvagem.
[016] Em algumas modalidades, o segundo tipo de HPV de tipo selvagem é HPV69. Em algumas modalidades, os resíduos de amino- ácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (2)(a), são resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (2)(b), são resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (2)(c), são resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. Em algumas modali- dades, os resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (2)(d), são resíduos de aminoácidos nas posi- ções 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[017] Em algumas modalidades, o terceiro tipo de HPV de tipo selvagem é HPV26. Em algumas modalidades, os resíduos de amino- ácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (3)(a), são resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (3)(b), são resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes, conforme descrito em (3)(c), são resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[018] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 1.
[019] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 2.
[020] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 22.
[021] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 17.
[022] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 18.
[023] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 19.
[024] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 20.
[025] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 350-362 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 21.
[026] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 56.
[027] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 57.
[028] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 58.
[029] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 59.
[030] Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos nas posições 348-360 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem têm uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 60.
[031] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 4, 5, 6 ou 7.
[032] Em algumas modalidades, a proteína L1 de HPV51 mutante tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 23, 27, 28, 41 ou 45.
[033] Em outro aspecto, o pedido fornece um ácido nucleico iso- lado que codifica a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, conforme descrito acima. Em outro aspecto, o pedido fornece um vetor que compreende o ácido nucleico isolado. Em algumas mo- dalidades, o ácido nucleico isolado de acordo com o pedido tem uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 12, 13, 14 ou 15.
[034] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado de acordo com o pedido tem uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 32, 36, 37, 49 ou 53.
[035] Vetores úteis para a inserção de um polinucleotídeo de inte- resse são bem conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitações, vetores de clonagem e vetores de expressão. Em uma modalidade, os vetores são, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, etc.
[036] Em outro aspecto, o pedido refere-se ainda a uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico isolado ou o vetor con- forme descrito acima. A célula hospedeira inclui, porém sem limita- ções, células procariotas, tais como células de E. coli, e células euca- riotas, tais como células de levedura, células de inseto, células de plantas e células de animais (tais como células de mamíferos, por exemplo, células de camundongo, células humanas, etc.). A célula hospedeira de acordo com o pedido também pode ser uma linhagem de células, tal como células 293T.
[037] Em outro aspecto, o pedido refere-se a uma partícula simi- lar a vírus HPV que compreende ou consiste na proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma de acordo com o pedido.
[038] Em algumas modalidades preferidas, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoáci- dos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem compa- rado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substi- tuição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[039] Em algumas modalidades preferidas, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoáci- dos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem compa- rado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substi- tuição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[040] Em algumas modalidades preferidas, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoáci- dos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem compa-
rado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substi- tuição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[041] Em algumas modalidades preferidas, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoáci- dos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem compa- rado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substi- tuição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[042] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo sel- vagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resí- duos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114- 146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[043] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína
L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[044] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[045] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170 -181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições
114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[046] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 0-15 aminoácidos, por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos, no N-terminal da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259 -289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[047] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[048] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[049] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[050] Em algumas modalidades preferidas, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N- término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[051] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[052] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de
HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resí- duos de aminoácidos nas posições 173-181 de a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[053] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resí- duos de aminoácidos nas posições 51-60 de a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[054] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resí- duos de aminoácidos nas posições 114-146 de a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[055] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem um truncamento de 9 aminoácidos no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem e uma substituição dos resíduos de aminoá- cidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem e uma substituição dos resí- duos de aminoácidos nas posições 114-146 de a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[056] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 4, 5, 6 ou 7.
[057] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido compreende a proteína L1 de HPV51 mutante que tem uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 23, 27, 28, 41 ou 45.
[058] Em outro aspecto, o pedido refere-se ainda a uma compo- sição que compreende a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma vari- ante da mesma, o ácido nucleico isolado, o vetor, a célula hospedeira ou a partícula similar a vírus HPV. Em algumas modalidades preferi- das, a composição compreende a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma de acordo com o pedido. Em algumas moda- lidades preferidas, a composição compreende a partícula similar a ví- rus HPV de acordo com o pedido.
[059] Em outro aspecto, o pedido refere-se ainda a uma compo- sição farmacêutica ou vacina que compreende a partícula similar ao vírus HPV de acordo com o pedido e, opcionalmente, um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica ou vacina de acordo com o pedido pode ser usada para prevenir a in- fecção pelo HPV ou uma doença causada através de infecção pelo HPV, tal como câncer do colo do útero e condiloma acuminado.
[060] Em algumas modalidades, a partícula similar a vírus HPV está presente em uma quantidade eficaz para prevenir a infecção pelo HPV ou uma doença causada através de infecção pelo HPV. Em al- gumas modalidades, a infecção pelo HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, pelo menos uma infecção selecionada a partir do grupo que consiste em infecção pelo HPV51, infecção pelo HPV69 e infecção pelo HPV26). Em algumas modalidades, a doença causada através de infecção pelo HPV é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer do colo do útero, condiloma acuminado e qualquer combinação dos mesmos.
[061] A composição farmacêutica ou vacina de acordo com o pe- dido pode ser administrada por meio de métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, porém sem limitações, oralmente ou através de injeção. No pedido, uma via de administração particularmente preferi- da é injeção.
[062] Em algumas modalidades preferidas, a composição farma- cêutica ou vacina de acordo com o pedido é administrada na forma de uma unidade de dosagem. Por exemplo, porém sem limitações, cada dosagem unitária contém 5 µg-80 µg, de preferência 20 µg-40 µg de partícula similar a vírus HPV.
[063] Em outro aspecto, o pedido refere-se a um método para preparar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma conforme descrito acima que compreende expressar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma em uma célula hospedeira e, em seguida, recuperar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma va- riante da mesma a partir de uma cultura da célula hospedeira.
[064] Em algumas modalidades preferidas, a célula hospedeira é
E. coli.
[065] Em algumas modalidades preferidas, o método compreen- de as etapas de: expressar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma em E. coli e, em seguida, obter a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma por meio de purificação de um sobrenadante do lisato de E. coli. Em algumas modalidades prefe- ridas, a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma é recuperada do sobrenadante do lisato de E. coli por meio de cromato- grafia (por exemplo, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de hidroxiapatita e/ou cromatografia de interação hidrofóbica).
[066] Em outro aspecto, o pedido refere-se a um método para preparar uma vacina que compreende combinar a partícula similar ao vírus do HPV de acordo com o pedido com um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[067] Em outro aspecto, o pedido refere-se a um método para prevenir a infecção pelo HPV ou uma doença causada através de in- fecção pelo HPV que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade profilaticamente eficaz da partícula similar a vírus HPV ou a composição farmacêutica ou vacina de acordo com o pedido. Em uma modalidade preferida, a infecção pelo HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção pelo HPV51, infecção pelo HPV69 e/ou infecção pelo HPV26). Em outra modalidade preferi- da, a doença causada através de infecção pelo HPV inclui, porém sem limitações, câncer do colo do útero e condiloma acuminado. Em outra modalidade preferida, o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano.
[068] Em outro aspecto, o pedido refere-se ainda ao uso da pro- teína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma ou a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido na fabricação de uma composição farmacêutica ou vacina para prevenir infecção pelo HPV ou uma doença causada através de infecção pelo HPV. Em uma mo- dalidade preferida, a infecção pelo HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção pelo HPV51, infecção pelo HPV69 e/ou infecção pelo HPV26). Em outra modalidade preferida, a doença causada através de infecção pelo HPV inclui, porém sem limi- tações, câncer do colo do útero e condiloma acuminado.
[069] Em outro aspecto, o pedido refere-se ainda à proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma ou a partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido para a prevenção de infecção pelo HPV ou uma doença causada através de infecção pelo HPV. Em uma modalidade preferida, a infecção pelo HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção pelo HPV51, infecção pelo HPV69 e/ou infecção pelo HPV26). Em outra modalidade preferida, a doença causada através de infecção pelo HPV inclui, porém sem limi- tações, câncer do colo do útero e condiloma acuminado. Definições de Termos no Pedido
[070] No pedido, a menos que especificado de outra forma, os termos científicos e técnicos usados no presente documento têm os significados geralmente compreendidos por aqueles versados na téc- nica. Além disso, as operações em laboratório de cultura de células, genética molecular, química de ácidos nucleicos e imunologia usadas no presente documento são as operações de rotina amplamente em- pregadas nos campos correspondentes. Entretanto, a fim de compre- ender melhor o pedido, as definições e explicações dos termos rele- vantes são fornecidas a seguir.
[071] De acordo com o pedido, o termo "um segundo tipo de HPV de tipo selvagem" refere-se a um tipo de HPV de tipo selvagem dife- rente de HPV51. No pedido, um segundo tipo de HPV de tipo selva- gem é, de preferência, HPV69 de tipo selvagem.
[072] De acordo com o pedido, o termo "um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem" refere-se a um tipo de HPV de tipo selvagem dife- rente de HPV51 e do segundo tipo de HPV de tipo selvagem. No pedi- do, um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem é, de preferência, HPV26 de tipo selvagem.
[073] De acordo com o pedido, a expressão "posições corres- pondentes" refere-se às posições equivalentes das sequências que estão sendo comparadas quando as sequências estão alinhadas de forma otimizada, ou seja, as sequências são alinhadas para obter uma maior porcentagem de identidade.
[074] De acordo com o pedido, o termo "proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem" refere-se à proteína L1 da cápside principal de ocor- rência natural no papilomavírus humano de tipo 51 (HPV51). A se- quência da proteína L1 do HPV51 de tipo selvagem é bem conhecida na técnica e pode ser encontrada em bancos de dados públicos (tal como Nº de Acesso ACV88631.1, ALJ32930.1, CRH69903.1 e AJS10540.1 no banco de dados NCBI).
[075] No pedido, quando uma sequência de aminoácidos da pro- teína L1 de HPV51 de tipo selvagem é mencionada, ela é descrita por meio de referência à sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácidos nas posi- ções 52-60 de uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem" refere-se aos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 do polipeptídeo con- forme apresentado em SEQ ID NO: 1. No entanto, aqueles versados na técnica entenderão que o HPV51 de tipo selvagem pode incluir vá- rios isolados e pode haver diferença na sequência de aminoácidos da proteína L1 entre vários isolados. Além disso, aqueles versados na técnica entenderão que, embora possa haver diferença na sequência, as sequências de aminoácidos da proteína L1 têm uma identidade muito alta (geralmente mais de 95 %, por exemplo, mais de 96 %, mais de 97 %, mais de 98 % ou mais de 99 %) entre diferentes isola-
dos de HPV51 e têm substancialmente a mesma função biológi- ca. Portanto, no pedido, o termo "proteína L1 de HPV51 de tipo selva- gem" inclui não apenas a proteína conforme apresentado em SEQ ID NO: 1, mas também a proteína L1 de vários isolados de HPV51 (tal como a proteína L1 de HPV51 conforme apresentado em Nº de Aces- so ACV88631.1, ALJ32930.1, CRH69903.1 e AJS10540.1). Além dis- so, quando um fragmento de sequência de uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem é descrito, ele inclui não apenas o fragmento de se- quência de SEQ ID NO: 1, mas também o fragmento de sequência correspondente de uma proteína L1 de vários isolados de HPV51. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem" inclui os resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de SEQ ID NO: 1 e o fragmento cor- respondente de uma proteína L1 de vários isolados de HPV51.
[076] De acordo com o pedido, o termo "proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem" refere-se à proteína L1 da cápside principal de ocor- rência natural no papilomavírus humano tipo 69 (HPV69). A sequência da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem é bem conhecida na técni- ca e pode ser encontrada em bancos de dados públicos (tais como o Nº de Acesso AHV83654.1, ALJ32844.1 e ALJ32828.1 no banco de dados NCBI).
[077] No pedido, quando uma sequência de aminoácidos da pro- teína L1 de HPV69 de tipo selvagem é mencionada, ela é descrita por meio de referência à sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 2. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácidos nas posi- ções 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem" refere-se aos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 do polipeptídeo con- forme apresentado em SEQ ID NO: 2; a expressão "resíduos de ami- noácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem" refere-se aos resíduos de aminoácidos nas posições 170-
183 do polipeptídeo conforme apresentado em SEQ ID NO: 2. No en- tanto, aqueles versados na técnica entenderão que o HPV69 de tipo selvagem pode incluir vários isolados e pode haver diferença na se- quência de aminoácidos da proteína L1 entre vários isolados. Além disso, aqueles versados na técnica entenderão que, embora possa haver diferença na sequência, as sequências de aminoácidos da pro- teína L1 têm uma identidade muito alta (geralmente mais de 95 %, por exemplo, mais de 96 %, mais de 97 %, mais de 98 % ou mais de 99 %) entre diferentes isolados de HPV69 e têm substancialmente a mesma função biológica. Portanto, no pedido, o termo "proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem" inclui não apenas a proteína conforme apre- sentado em SEQ ID NO: 2, mas também a proteína L1 de vários isola- dos de HPV69 (tal como a proteína L1 de HPV69 conforme apresenta- do em AHV83654. 1, ALJ32844.1 e ALJ32828.1). Além disso, quando um fragmento de sequência de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem é descrito, ele inclui não apenas o fragmento de sequência de SEQ ID NO: 2, mas também o fragmento de sequência corresponden- te de uma proteína L1 de vários isolados de HPV69. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma pro- teína L1 de HPV69 de tipo selvagem" inclui os resíduos de aminoáci- dos nas posições 52-60 de SEQ ID NO: 2 e o fragmento correspon- dente de uma proteína L1 de vários isolados de HPV69.
[078] De acordo com o pedido, o termo "proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem" refere-se à proteína L1 da cápside principal de ocor- rência natural no papilomavírus humano tipo 26 (HPV26). A sequência da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem é bem conhecida na técni- ca e pode ser encontrada em bancos de dados públicos (tais como o Nº de Acesso NP041787.1, AHY96046.1 e AHY96053.1 no banco de dados NCBI).
[079] No pedido, quando uma sequência de aminoácidos da pro-
teína L1 de HPV26 de tipo selvagem é mencionada, ela é descrita por meio de referência à sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 22. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácidos nas posi- ções 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem" refere-se a resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 do polipeptídeo con- forme apresentado em SEQ ID NO: 22; a expressão "resíduos de ami- noácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem" refere-se a resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 do polipeptídeo conforme apresentado em SEQ ID NO: 22. No entan- to, aqueles versados na técnica entenderão que o HPV26 de tipo sel- vagem pode incluir vários isolados e pode haver diferença na sequên- cia de aminoácidos da proteína L1 entre vários isolados.
Além disso, aqueles versados na técnica entenderão que, embora possa haver di- ferença na sequência, as sequências de aminoácidos da proteína L1 têm uma identidade muito alta (geralmente mais de 95 %, por exem- plo, mais de 96 %, mais de 97 %, mais de 98 % ou mais de 99 %) en- tre diferentes isolados de HPV26 e têm substancialmente a mesma função biológica.
Portanto, no pedido, o termo "proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem" inclui não apenas a proteína conforme apresentado em SEQ ID NO: 22, mas também a proteína L1 de vários isolados de HPV26 (tal como a proteína L1 de HPV26 conforme apresentado em NP041787. 1, AHY96046.1 e AHY96053.1). Além disso, quando um fragmento de sequência de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selva- gem é descrito, ele inclui não apenas o fragmento de sequência de SEQ ID NO: 22, mas também o fragmento de sequência correspon- dente da proteína L1 de vários isolados de HPV26. Por exemplo, a ex- pressão "resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteí- na L1 de HPV26 de tipo selvagem" inclui os resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da SEQ ID NO: 22 e o fragmento correspondente da proteína L1 de vários isolados de HPV26.
[080] De acordo com o pedido, a expressão "fragmentos de se- quência correspondentes" ou "fragmentos correspondentes" refere-se aos fragmentos que estão localizados em posições equivalentes das sequências que estão sendo comparadas quando as sequências estão alinhadas de forma otimizada, ou seja, as sequências estão alinhadas para obter uma porcentagem mais alta de identidade.
[081] De acordo com o pedido, a expressão "truncamento de X aminoácidos no N-término" ou "tem X aminoácidos truncados no N- término" refere-se à substituição dos resíduos de aminoácidos das po- sições 1 a X no N-término de uma proteína por um resíduo de metioni- na codificado por um códon iniciador (para iniciar a tradução da proteí- na). Por exemplo, uma proteína L1 de HPV51 que tem 9 aminoácidos truncados no N-término refere-se a uma proteína resultante da substi- tuição dos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 9 no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por um resíduo de metioni- na codificado por um códon iniciador.
[082] De acordo com o pedido, o termo "variante" refere-se a uma proteína, cuja sequência de aminoácidos tem substituição (de preferência substituição conservativa), adição ou eliminação de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) aminoácidos ou tem uma identi- dade de pelo menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 %, compa- rado com a proteína L1 de HPV51 mutante de acordo com o pedido (por exemplo, a proteína conforme apresentado em SEQ ID NO: 5 ou 6) e que retém uma função da proteína L1 de HPV51 mutante de acordo com o pedido. No pedido, o termo "função da proteína L1 de HPV51 mutante" refere-se a uma capacidade de induzir à geração de anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV51 e HPV69). O termo "identidade" refere-se a uma me- dida de similaridade entre as sequências de nucleotídeos ou sequên- cias de aminoácidos. Em geral, as sequências foram alinhadas para obter uma correspondência máxima. "Identidade" tem significados bem conhecidos na técnica e pode ser calculada por meio de um algoritmo publicado (tal como BLAST).
[083] De acordo com o pedido, o termo "identidade" refere-se ao grau de correspondência entre dois polipeptídeos ou entre dois ácidos nucleicos. Quando duas sequências para comparação têm a mesma subunidade monomérica de bases ou aminoácidos em um determina- do local (por exemplo, cada uma das duas moléculas de DNA tem uma adenina em um determinado local ou cada um dos dois polipeptídeos tem uma lisina em um determinado local), as duas moléculas são idên- ticas no local. A porcentagem de identidade entre duas sequências é uma função do número de locais idênticos compartilhados pelas duas sequências sobre o número total de locais para comparação ×
100. Por exemplo, se 6 de 10 locais de duas sequências coincidem, estas duas sequências têm uma identidade de 60 %. Por exemplo, as sequências de DNA: CTGACT e CAGGTT compartilham uma identi- dade de 50 % (3 de 6 locais são correspondentes). Em geral, a com- paração de duas sequências é conduzida de maneira a produzir iden- tidade máxima. Tal alinhamento pode ser conduzido, por exemplo, usando um programa de computador, tal como o programa Align (DNAstar, Inc.) o qual se baseia no método de Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usan- do uma tabela de resíduos de peso PAM120 e com uma penalidade por extensão de lacuna de 12 e uma penalidade por lacuna de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre duas sequências de amino- ácidos pode ser determinada pelo algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)), o qual foi incorporado no programa
GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250 e com um pe- so por lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso por extensão de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[084] Conforme usado no presente documento, o termo "substi- tuição conservativa" refere-se a substituições de aminoácidos que não afetariam ou alterariam de forma desvantajosa as propriedades essen- ciais de uma proteína/polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos. Por exemplo, uma substituição conservativa pode ser introduzida por meio de métodos convencionais conhecidos na técni- ca, tais como mutagênese sítio dirigida e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácidos conservativas incluem substitui- ções em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resí- duo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar, por exemplo, um resíduo física ou funcionalmente similar (tal como que tem tama- nho, forma, carga ou propriedade química similares, incluindo a capa- cidade de formação de ligação covalente ou ligação de hidrogênio, etc.) ao resíduo de aminoácido correspondente. Famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais bási- cas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos com cadei- as laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos com cadeias laterais polares não carregadas (por exem- plo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína e triptofano), aminoácidos com cadeias laterais não polares (por exem- plo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina e metioni- na), aminoácidos com cadeias laterais β-ramificadas (tais como treoni- na, valina e isoleucina) e aminoácidos com cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina). Portanto, em geral, uma substituição conservativa refere-se a uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente por outro resíduo de ami- noácido da mesma família de cadeias laterais. Métodos para identificar substituições conservativas de aminoácidos são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180- 1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10): 879- 884 (1999); e Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997), os quais são incorporados ao presente documento a título de referência).
[085] De acordo com o pedido, o termo "E. coli" refere-se a um sistema de expressão que consiste em E. coli (cepa) e um vetor, em que a E. coli (cepa) é derivada de cepas comercialmente disponíveis incluindo, porém sem limitações: ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3) e BLR (DE3).
[086] De acordo com o pedido, o termo "vetor" refere-se a uma ferramenta transportadora de ácido nucleico que pode ter um polinu- cleotídeo inserido na mesma. Quando o vetor permite a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo inserido no mesmo, o vetor é denominado vetor de expressão. O vetor pode ter os elementos de material genético transportados expressos em uma célula hospedeira através de transformação, transdução ou transfecção na célula hospe- deira. Vetores são bem conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém sem limitações, plasmídeos, fagos, cosmídeos, etc.
[087] De acordo com o pedido, o termo "um veículo e/ou excipi- ente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo e/ou excipi- ente que é farmacológica e/ou fisiologicamente compatível com um indivíduo e ingredientes ativos que são bem conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edita- do por Gennaro A.R., 19ª ed. Pensilvânia: Mack Publishing Company, 1995) incluindo, porém sem limitações: reguladores de pH, tensoati- vos, adjuvantes e intensificadores de força iônica. Por exemplo, regu- ladores de pH incluem, porém sem limitações, tampões de fosfa-
to; tensoativos incluem, porém sem limitações: tensoativos catiônicos, tensoativos aniônicos ou tensoativos não iônicos, por exemplo, Tween- 80; adjuvantes incluem, porém sem limitações, adjuvante de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio) e adjuvante de Freund (por exemplo, adjuvante completo de Freund); e os intensificadores de for- ça iônica incluem, porém sem limitações, NaCl.
[088] De acordo com o pedido, o termo "um valor efetivo" refere- se a um valor que pode efetivamente atingir a finalidade pretendi- da. Por exemplo, uma quantidade eficaz para prevenir uma doença (tal como infecção pelo HPV) refere-se a uma quantidade eficaz para pre- venir, suprimir ou retardar a ocorrência de uma doença (tal como in- fecção pelo HPV). A determinação de tal quantidade eficaz está ao alcance daqueles versados na técnica.
[089] De acordo com o pedido, o termo "cromatografia" inclui, po- rém sem limitações: cromatografia de troca iônica (tal como cromato- grafia de troca catiônica), cromatografia de interação hidrofóbica, cro- matografia absorvente (tal como cromatografia de hidroxiapatita), cro- matografia de filtração em gel (cromatografia de exclusão em gel) e cromatografia de afinidade.
[090] De acordo com o pedido, o termo "sobrenadante do lisato" refere-se a uma solução produzida através das seguintes etapas: as células hospedeiras (tal como E. coli) são rompidas em um tampão de lise e as substâncias insolúveis são, então, removidas da solução lisa- da que contém as células hospedeiras rompidas. Vários tampões de lise são bem conhecidos na técnica incluindo, porém sem limitações, tampões de Tris, tampões de fosfato, tampões de HEPES, tampões de MOPS, etc. Além disso, a ruptura de uma célula hospedeira pode ser realizada por meio de métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém sem limitações, ruptura em homogeneiza- dor, tratamento ultrassônico, trituração, extrusão em alta pressão, tra-
tamento com lisozima, etc. Métodos para remover substâncias insolú- veis também são bem conhecidos por aqueles versados na técnica incluindo, porém sem limitações, filtração e centrifugação. Efeitos Benéficos do Pedido
[091] Estudos mostram que, embora haja uma determinada pro- teção cruzada entre o HPV51 e outro(s) tipo(s) de HPV (tais como HPV69 e/ou HPV26), esta proteção cruzada é muito baixa, geralmente abaixo de um por cento, até um milésimo do nível de proteção de VLP do mesmo tipo de HPV. Portanto, um indivíduo vacinado com a vacina contra HPV51 ainda tem um alto risco de ser infectado por outro(s) ti- po(s) de HPV (tais como HPV69 e/ou HPV26).
[092] O pedido fornece uma proteína L1 de HPV51 mutante e uma partícula similar a um vírus HPV formada pela mesma. A partícula similar a vírus HPV de acordo com o pedido pode conferir proteção cruzada significativa contra HPV51 e outro(s) tipo(s) de HPV (tais co- mo HPV69 e/ou HPV26). Especialmente, na mesma dose imunizante, a partícula similar ao vírus do HPV de acordo com o pedido pode indu- zir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV51 e HPV69, ou HPV51, HPV69 e HPV26) em organismos, e seu efeito é comparável àquele de uma mistura de VLPs de vários tipos de HPV (por exemplo, uma mis- tura de VLPs de HPV51 e VLP de HPV69, ou uma mistura de VLPs de HPV51, VLP de HPV69 e VLP de HPV26). Portanto, a partícula similar ao vírus HPV de acordo com o pedido pode ser usada para prevenir a infecção por pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV51 e HPV69, ou HPV51, HPV69 e HPV26) ao mesmo tempo, bem como doenças associadas à infecção, e tem efeitos técnicos significativa- mente benéficos. Isto tem vantagens particularmente significativas em termos de aumento da faixa de proteção das vacinas contra o HPV e redução dos custos de produção das vacinas contra o HPV.
[093] As modalidades do pedido são ainda descritas em detalhes com referência aos desenhos e exemplos. No entanto, aqueles versa- dos na técnica entenderão que os desenhos e exemplos a seguir se destinam apenas a ilustrar o pedido, em vez de definir o escopo do pedido. De acordo com a descrição detalhada dos desenhos e modali- dades preferidas a seguir, várias finalidades e vantagens do pedido são evidentes para aqueles versados na técnica. Descrição dos Desenhos
[094] A Figura 1A mostra o resultado de SDS-PAGE das proteí- nas mutantes purificadas no Exemplo 1. Linha 1:marcador de peso molecular de proteína; Linha 2: HPV51N9 (proteína L1 de HPV51 com 9 aminoácidos truncados no N-término); Linha 3: HPV69N0 (proteína L1 de HPV69 de comprimento total do tipo selvagem); Linha 4: H51N9- 69T1 (a proteína mutante conforme apresentado em SEQ ID NO: 4); Linha 5: H51N9-69T2 (a proteína mutante conforme apresentado em SEQ ID NO: 5); Linha 6: H51N9-69T3 (a proteína mutante conforme apresentado em SEQ ID NO: 6); Linha 7: H51N9-69T4 (a proteína mu- tante conforme apresentado em SEQ ID NO: 7); Linha 8: H51N9-69T5 (a proteína mutante conforme apresentado em SEQ ID NO: 8). O re- sultado mostrou que, após purificação cromatográfica, as proteínas mutantes H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 e H51N9-69T5 atingiram uma pureza de cerca de 90 %.
[095] As Figuras 1B a 1D mostram o resultado de SDS- PAGE das proteínas mutantes purificadas H51N9-69T2-26S1, H51N9- 69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3- 26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9- 69T4-26S5 no Exemplo 1. Os resultados de SDS-PAGE mostraram que, após purificação cromatográfica, as proteínas mutantes atingiram uma pureza relativamente alta de cerca de 80-90 %.
[096] A Figura 2A mostra o resultado de Western Blot das proteí- nas mutantes H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 e H51N9-69T5 preparadas no Exemplo 1, conforme determinado usando um anticorpo 4B3 de largo espectro contra a proteína L1 de HPV. Linha 1: marcador de peso molecular de proteína; Linha 2: HPV51N9 (proteína L1 de HPV51 com 9 aminoácidos truncados no N- término); Linha 3: HPV69N0 (proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem de comprimento total); Linha 4: H51N9-69T1; Linha 5: H51N9-69T2; Linha 6: H51N9-69T3; Linha 7: H51N9-69T4; Linha 8: H51N9-69T5. O resultado mostrou que as proteínas mutantes H51N9-69T1, H51N9- 69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 e H51N9-69T5 podem ser especifi- camente reconhecidas pelo anticorpo de amplo espectro 4B3.
[097] As Figuras 2B a 2D mostram o resultado de Western Blot das proteínas mutantes H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9- 69T3-26S2, H51N9- 69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4- 26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 preparadas no Exemplo 1, conforme determinado usando um anticor- po de amplo espectro 4B3 contra a proteína L1 de HPV. Os resultados mostraram que, após purificação cromatográfica, as proteínas mutan- tes podem ser especificamente reconhecidas pelo anticorpo de amplo espectro 4B3.
[098] A Figura 3 mostra os resultados das amostras que compre- endem a proteína mutante H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 ou H51N9-69T5, conforme analisado por meio de croma- tografia em peneira molecular. Os resultados mostraram que o primei- ro pico de proteína das amostras que compreende a proteína mutan- te H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 ou H51N9- 69T5 apareceu em torno de 13-14 min, o que era comparável àquele da VLP de HPV51N9. Isto mostrou que as proteínas mutantes H51N9-
69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 e H51N9-69T5 foram capazes de montagem em VLPs com um tamanho uniforme.
[099] A Figura 4 mostra os resultados das amostras que compre- endem a proteína mutante H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9- 69T2-26S3, H51N9-69T2-26S69 -26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9- 69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3- 26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 ou H51N9-69T4-26S5, conforme analisado por meio de cromatografia em peneira molecular. Os resultados mostra- ram que o primeiro pico de proteína destas VLPs mutantes apareceu em torno de 13-14 min, o que era comparável àquele da VLP de HPV51N9. Isto mostrou que estas proteínas mutantes H51N9-69T1- 26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9- 69T3-26S1, H51N9-69T3-26S1 69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9- 69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 foram todas capazes de montagem em VLPs com um tamanho uniforme. As VLPs formadas pela proteína mutante H51N9-69T1-26S4 ou H51N9-69T1-26S5 tinham um tamanho não uniforme.
[0100] A Figura 5 mostra os resultados da análise de velocidade de sedimentação de VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4. Os resultados mostraram que os coeficientes de sedimentação de VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 foram 148S, 135S, 117S e 131S, respectivamente. Isto mostrou que as pro- teínas mutantes H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3 e H51N9- 69T4 foram todas capazes de montagem em partículas similares a ví- rus que eram similares à VLP de tipo selvagem (VLP de HPV51N9,
123S) em termos de tamanho e morfologia.
[0101] A Figura 6 mostra os resultados da análise de velocidade de sedimentação da VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T1- 26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2- 26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T3-26S1, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S4, VLP de H51N9-69T3- 26S5, VLP de H51N9-69T4-26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5. Os resultados mos- traram que os coeficientes de sedimentação de VLP de H51N9-69T1- 26S2, VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9-69T2- 26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T3-26S1, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3- 26S4, VLP de H51N9-69T3-26S5, VLP de H51N9-69T4-26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9- 69T4-26S5 foram 148S, 130S, 131S, 130S, 135S, 140S, 135S, 144S, 133S, 131S, 161S, 140S, 137S, 132S, 126S e 48S, respectivamente, em que a VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9- 69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S5 tinham baixa uniformidade e tinham dois tamanhos diferentes.
[0102] A Figura 7 mostra as fotografias de microscopia de trans- missão eletrônica (Transmission Electron Microscopy, TEM) (tiradas com ampliação de 100.000X, Barra = 0,1 µm) de várias amostras de VLP, em que A mostra a fotografia por TEM da VLP de HPV51N9; B mostra a fotografia por TEM da VLP de H51N9-69T1; C mostra a foto- grafia por TEM da VLP de H51N9-69T2; D mostra a fotografia por TEM da VLP de H51N9-69T3; E mostra a fotografia por TEM da VLP de H51N9-69T4; F mostra a fotografia por TEM da VLP de H51N9-69T5;
G mostra a fotografia por TEM da VLP de HPV69N0. Os resultados mostraram que a VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 e VLP de H51N9-69T5 eram simi- lares à VLP de HPV51N9 e que estas proteínas mutantes foram capa- zes de montagem em VLPs com um raio de cerca de 25 nm.
[0103] A Figura 8 mostra as fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (tiradas com ampliação de 100.000X, Barra = 0,1 µm) de várias amostras de VLP, em que A mostra as fotografias por TEM da VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4 e VLP de H51N9-69T1-26S5; B mostra as fotografias por TEM da VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9- 69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4 e VLP de H51N9-69T2-26S5; C mostra as fotografias por TEM da VLP de H51N9-69T3-26S1, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S4 e VLP de H51N9- 69T3-26S5; D mostra as fotografias por TEM da VLP de H51N9-69T4- 26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5. Os resultados mostraram que, exceto quanto à proteína mutante H51N9-69T1-26S4, as outras proteínas mutantes foram capazes de montagem em VLPs com um raio de cerca de 25 nm.
[0104] A Figura 9 mostra os resultados da identificação de VLP de HPV26N0, em que A mostra o resultado de VLP de HPV26N0 confor- me analisado por meio de cromatografia em peneira molecular; B mos- tra os resultados da análise da velocidade de sedimentação de VLP de HPV26N0; C mostra a fotografia por TEM da VLP de HPV26N0.
[0105] As Figuras 10A e 10B mostram os resultados da titulação de anticorpos neutralizantes no soro de camundongos após vacinação dos camundongos com VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3, VLP de H51N9-69T4 e VLP de H51N9-69T5. Figura 10A: Adjuvante de alumínio do grupo 1 (na dose imunizante de
5,0 μg, usando adjuvante de alumínio); Figura 10B: Adjuvante de alu- mínio do grupo 2 (em uma dose imunizante de 1 μg, usando adjuvante de alumínio). O resultado mostrou que a VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 podem, ca- da uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titula- ção contra HPV51 em camundongos, e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV51N9 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69 mista na mesma dose, e foram significati- vamente maiores do que aqueles da VLP de HPV69N0 individualmen- te na mesma dose. A VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV69 em camundongos, e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69 mista na mesma dose, e foram significativamente mai- ores do que a VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose. Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 tinham boa imunogenicidade cru- zada e proteção cruzada contra HPV51 e HPV69.
[0106] As Figuras 11A e 11B mostram os resultados da titulação de anticorpos neutralizantes no soro de camundongos após vacinação dos camundongos com VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9- 69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3- 26S4 e VLP de H51N9-69T3-26S5. Figura 11A: Adjuvante de alumínio do grupo 1 (na dose imunizante de 5,0 μg, usando adjuvante de alu- mínio); Figura 11B: Adjuvante de alumínio do grupo 2 (em uma dose imunizante de 1 μg, usando adjuvante de alumínio). O resultado mos- trou que a VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S2 podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV51 em camun- dongos, e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV51N9 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose, e foram significativa- mente maiores do que aqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e aqueles da VLP de HPV26N0 individualmente na mesma dose. A VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9- 69T3-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticor- pos neutralizantes de alta titulação contra HPV69 em camundongos, e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose. A VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9- 69T3-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticor- pos neutralizantes de alta titulação contra HPV26 em camundongos, e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV26N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose. Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S2 tinham boa imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV51, HPV69 e HPV26.
[0107] As Figuras 12A e 12B mostram os resultados da titulação de anticorpos neutralizantes no soro de camundongos após vacinação dos camundongos com VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9- 69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T-26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9- 69T4-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5. Figura 12A: Adjuvante de alumínio do grupo 1 (na dose imunizante de 5,0 μg, usando adjuvante de alumínio); Figura 12B: Adjuvante de alumínio do grupo 2 (na dose imunizante de 1 μg, usando adjuvante de alumínio). O resultado mos- trou que a VLP de H51N9-69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S2 podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV51 em camundongos, e seus efeitos proteto- res eram comparáveis àqueles da VLP de HPV51N9 individualmente e da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose, e foram sig- nificativamente maiores do que aqueles da de VLP de HPV69N0 indi- vidualmente e aqueles da VLP de HPV26N0 individualmente na mes- ma dose. A VLP de H51N9-69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutrali- zantes de alta titulação contra HPV69 em camundongos, e seus efei- tos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV69N0 indivi- dualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose. A VLP de H51N9- 69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV26 em camundongos, e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV26N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose, e foram significativa- mente maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose. Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S2 tinham boa imunogenicidade cruzada e prote- ção cruzada contra HPV51, HPV69 e HPV26. Informação Sobre Sequências
[0108] Algumas das sequências envolvidas no pedido são forneci- das na Tabela 1 a seguir.
Tabela 1: Descrição das sequências
SEQ ID Descrição NO: 1 proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem, L1 de HPV51 proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem, HPV69L1, ou 2 seja, HPV69N0 a proteína L1 de HPV51 que tem 9 aminoácidos trunca- 3 dos no N-término, HPV51N9 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos 4 truncados no N-término e que compreende o segmento 1 da proteína L1 de HPV69, H51N9-69T1 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos 5 truncados no N-término e que compreende o segmento 2 da proteína L1 de HPV69, H51N9-69T2 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos 6 truncados no N-término e que compreende o segmento 3 da proteína L1 de HPV69, H51N9-69T3 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos 7 truncados no N-término e que compreende o segmento 4 da proteína L1 de HPV69, H51N9-69T4 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos 8 truncados no N-término e que compreende o segmento 5 da proteína L1 de HPV69, H51N9-69T5 9 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 1 10 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 2 11 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 3 12 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 4 13 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 5 14 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 6 15 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 7 16 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 8 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 17 52-60 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem, ou se- ja, segmento 1 da proteína L1 de HPV69 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 18 125-147 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem, ou seja, segmento 2 da proteína L1 de HPV69 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 19 170-183 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem, ou seja, segmento 3 da proteína L1 de HPV69
SEQ ID Descrição NO: a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 20 261-291 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem, ou seja, segmento 4 da proteína L1 de HPV69 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 21 350-362 da proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem, ou seja, segmento 5 da proteína L1 de HPV69 22 proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem, L1 de HPV26 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 1 23 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 2 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T1-26S2 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 1 24 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 3 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T1-26S3 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 1 25 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 4 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T1-26S4 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 1 26 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 5 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T1-26S5 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 3 27 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 1 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T3-26S1 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 3 28 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 2 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T3-26S2 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 3 29 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 4 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T3-26S4 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 3 30 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 5 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T3-26S5 31 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 22 32 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 23
SEQ ID Descrição NO: 33 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 24 34 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 25 35 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 26 36 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 27 37 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 28 38 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 29 39 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 30 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 2 40 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 1 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T2-26S1 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 2 41 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 3 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T2-26S3 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 2 42 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 4 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T2-26S4 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 2 43 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 5 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T2-26S5 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 4 44 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 1 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T4-26S1 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 4 45 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 2 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T4-26S2 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 4 46 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 3 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T4-26S3 a proteína L1 de HPV51 mutante que tem 9 aminoácidos truncados no N-término e que compreende o segmento 4 47 da proteína L1 de HPV69 e o segmento 5 da proteína L1 de HPV26, H51N9-69T4-26S5 48 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 40
SEQ ID Descrição NO: 49 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 41 50 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 42 51 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 43 52 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 44 53 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 45 54 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 46 55 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 47 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 56 51-60 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem, ou se- ja, segmento 1 da proteína L1 de HPV26 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 57 114-146 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem, ou seja, segmento 2 da proteína L1 de HPV26 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 58 173-181 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem, ou seja, segmento 3 da proteína L1 de HPV26 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 59 259-289 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem, ou seja, segmento 4 da proteína L1 de HPV26 a sequência dos resíduos de aminoácidos nas posições 60 348-360 da proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem, ou seja, segmento 5 da proteína L1 de HPV26 Sequência 1 (SEQ ID NO: 1) : MALWRTNDSKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITL- GHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYN- PDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRI- ANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKL- GSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS- SSSSSSAKRKRVKK.
Sequência 2 (SEQ ID NO: 2) : MALWRTSDSKVYLPPTPVSRVVSTDEYVTRTGIYYYAGSSRLLTL- GHPYFPIPKSGSTAEIPKVSAYQYRVFRVHLPDPNKFGLPDPQLYN- PETERLVWACVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKLDDTENSHLATA- NADTDNRDNVCVDNKQTQLCIIGCTPPLGEHWGVG- TVCKNAQSQVQRGDCPPLELISSVIEDGDMIDTGFGAMDFTALQAT- KCDVPLDINQSICKYPDYLKMSADTYGNSMFFFLRREQLFARHFFN- KAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMVTS- DAQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTCVDTTRSTNL- TISTVSAQSASATFKPSDYKQFIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTDVMA- YIHTMNSTILENWNFGLTLPPTASLEDAYRFIKNSATT- CQRDAPAQPKEDPFSKLKFWDVDLKEKFSIDLDQFPLGRKFMLQA- GIQRRPKLGTKRPASSLSASSSSTTRKKRKLTK. Sequência 3 (SEQ ID NO: 3) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG- NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKL- GSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 4 (SEQ ID NO: 4) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPI- PKSGSTAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG-
NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKL- GSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 5 (SEQ ID NO: 5) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKLDDTENSHLATA- NADTDNRDNVCVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKL- GSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 6 (SEQ ID NO: 6) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG- NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGVG- TVCKNAQSQVQRGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAAL- QATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQI- FARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPI-
ESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQL- FITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEE- YELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLE- DAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLD- QFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK. Sequência 7 (SEQ ID NO: 7) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG- NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPV- PVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 8 (SEQ ID NO: 8) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG- NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKL- GSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTASAQSASAT- FKPSDFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK.
Sequência 9 (SEQ ID NO: 9) : ATGGCCCTGTGGAGGACCAACGACAGCAAGGTGTACCTG- CCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACA- TCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGG- CTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCA- GCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACA- GGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGG- CCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGG- CTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAG- CCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAG- TACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACG- CCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCA- GACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAG- CACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTG- CCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCG- TGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCG- CCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTG- CCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTAC- CTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTT- CCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAA- CAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTA- CATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTA- CATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGA- CAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCA- GGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCAT- CACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAG- CACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAAC- TTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAG- TTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGG-
TGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAG- TGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAG- GACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCA- GAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAG- TACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTG- GACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGG- TGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCG- CTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGA-
AGAGGGTGAAGAAGTAA Sequência 10 (SEQ ID NO: 10) : ATGGCTCTGTGGCGTACCTCTGACTCTAAAGTTTACCTGCCG- CCGACCCCGGTTTCTCGTGTTGTTTCTACCGACGAATACGTTAC- CCGTACCGGTATCTACTACTACGCTGGTTCTTCTCGTCTGCTGA- CCCTGGGTCACCCGTACTTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTAC- CGCTGAAATCCCGAAGGTCTCTGCTTACCAGTACCGGGTATT- CCGTGTCCACCTGCCGGACCCGAACAAATTCGGTCTGCCGGAC- CCGCAGCTGTACAATCCAGAAACCGAACGTCTGGTTTGGGCTTG- CGTTGGTGTCGAGGTCGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGG- TCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACAC- CGAAAACTCTCACCTGGCTACCGCTAACGCTGACACCGACAAC- CGTGACAACGTTTGCGTTGACAACAAACAGACCCAGCTGTGCAT- CATCGGTTGCACCCCGCCGCTGGGTGAACACTGGGGTGTCGG- TACCGTTTGCAAAAACGCTCAGTCTCAGGTTCAGCGTGGTGAC- TGCCCGCCGCTGGAACTGATCTCTTCTGTTATCGAAGACGGTGA- CATGATCGACACCGGTTTCGGTGCTATGGACTTCACCGCTCTG- CAGGCTACCAAATGCGACGTTCCGCTGGACATCAACCAGTCTA- TCTGCAAATACCCCGACTACCTGAAAATGTCTGCTGACACC- TACGGTAACTCTATGTTCTTCTTCCTGCGTCGTGAACAGCTGTT- CGCTCGTCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTG- TTCCGGTTTCTATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCG-
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CCGTAAAAAACGTAAACTGACCAAATAA Sequência 11 (SEQ ID NO: 11) : ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGG- CCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGA- TCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAG- CGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG-
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TAA Sequência 12 (SEQ ID NO: 12) : ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGG- TCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGAC-
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TAA Sequência 13 (SEQ ID NO: 13) : ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCG- TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCAC- CGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGAC- CCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAG- CATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGG- CTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAA- CAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCAC- CAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCAC- CTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAG- GAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCAC-
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AGAGGGTGAAGAAGTAA Sequência 16 (SEQ ID NO: 16) : ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG-
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TAA Sequência 17 (SEQ ID NO: 17) :
IPKSGSTAE Sequência 18 (SEQ ID NO: 18) :
LDDTENSHLATANADTDNRDNVC Sequência 19 (SEQ ID NO: 19) :
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FFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTS Sequência 21 (SEQ ID NO: 21) :
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QFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK Sequência 30 (SEQ ID NO: 30) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR-
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QFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK Sequência 31 (SEQ ID NO: 31) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 22 ATGGCTCTGTGGCGTACCTCTGACTCTAAAGTTTACCTGCCG- CCGACCCCGGTTTCTCGTGTTGTTAACACCGACGAATACGTTAC- CCGTACCGGTATCTACTACTACGCTGGTTCTTCTCGTCTGCTGA- CCCTGGGTCACCCGTACTTCTCTATCCCGAAAACCGGTCA- GAAAGCTGAAATCCCGAAAGTTTCTGCTTACCAGTACCGTGTTTT- CCGTGTTCACCTGCCGGACCCGAACAAATTCGGTCTGCCGGAC- CCGCAGCTGTACAACCCGGACACCGAACGTCTGGTTTGGG- CTTGCGTTGGTGTTGAAGTTGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTA- TCGGTCTGTCTGGTCACCCGCTGTTCAACAAACTGGACGACAC- CGAAAACTCTCACCTGGCTACCGTTAACGCTGACACCGACAAC- CGTGACAACGTTTCTGTTGACAACAAACAGACCCAGCTGTGCAT- CATCGGTTGCACCCCGCCGCTGGGTGAACACTGGGG-
TAT CGGTACCATCTGCAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACT GCCCGCCGCTGGAACTGATCTCTTCTATCATCGAAGACGGTGA- CATGATCGACACCGGTTTCGGTGCTATGGACTTCACCGCTCTG- CAGGCTACCAAATCTGACGTTCCGATCGACATCTCTCAGTCTAC- CTGCAAATACCCGGACTACCTGAAAATGTCTGCTGACACC- TACGGTAACTCTATGTTCTTCTTCCTGCGTCGTGAACAGCTGTT- CGCTCGTCACTTCTACAACAAAGCTGGTGCTGTTGGTGACGCTA- TCCCGACCACCCTGTACATCAAAGGTGCTGAATCTGGTCG- TGAACCGCCGACCTCTTCTATCTACTCTGCTACCCCGTCTGGTTC- TATGGTTACCTCTGACGCTCAGCTGTTCAACAAACCGTACTGG- CTGCAGCGTGCTCAGGGTCACAACAACGGTATCTGCTGGGG- TAACCAGCTGTTCGTTACCTGCGTTGACACCACCCGTTCTAC- CAACCTGACCATCTCTACCCTGTCTGCTGCTTCTGCTTCTAC- CCCGTTCAAACCGTCTGACTACAAACAGTTCATCCGTCACGG- TGAAGAATACGAACTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAAATCAC- CCTGACCACCGACGTTATGGCTTACATCCACCTGATGAACGCTT- CTATCCTGGAAGACTGGAACTTCGGTCTGACCCTGCCGCCGAC- CGCTTCTCTGGAAGACGCTTACCGTTTCATCAAAAACTCTGCTAC- CACCTGCCAGCGTAACGCTCCGCCGGTTCCGAAAGAAGACCCG- TTCCAGAAATTCAAATTCTGGGACGTTGACCTGAAAGAAAAATT- CTCTATCGACCTGGACCAGTTCCCGCTGGGTCGTAAATTCATG- CTGCAGGCTGGTATCCAGCGTCGTCCGAAACTGGGTAC- CAAACGTCCGCTGTCTTCTACCTCTTCTTCTACCAAACG-
TAAAAAACGTAAACTGACCAAATAA Sequência 32 (SEQ ID NO: 32) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 23 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGG- TCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGAC- CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTATCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGTTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTCTG-
TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCAC- CGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGAC- CCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAG- CATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGG- CTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAA- CAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCAC- CAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCAC- CTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAG- GAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCAC- CCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGAC- CCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTG- CCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGA- ACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGG- CCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGA- CCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCG- CCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGA- AGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAG- CTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAG-
TAA Sequência 33 (SEQ ID NO: 33) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 24 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG-
TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGG- TCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGAC- CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGG- CCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGA- TCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAG- CGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTATCGGTACCATCTG- CAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCAC- CGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGAC- CCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAG- CATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGG- CTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAA- CAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCAC- CAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCAC- CTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAG- GAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCAC- CCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGAC- CCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTG- CCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGA- ACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGG- CCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGA- CCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCG- CCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGA- AGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAG- CTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAG-
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TAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTAG Sequência 35 (SEQ ID NO: 35) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 26 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCGATCCCGAAATCTGGTTCTACCGCTGAAATCCCGAAGG- TCTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGAC- CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGG- CCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGA- TCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAG-
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TAA Sequência 36 (SEQ ID NO: 36) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 27 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG-
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FLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK Sequência 44 (SEQ ID NO: 44) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITL- GHPYFSIPKTGQKAEIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYN- PDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRI- ANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV-
PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPV- PVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 45 (SEQ ID NO: 45) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGIGLSGHPLFNKLDDTENS- HLATVNADTDNRDNVSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTT- CKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDV- PLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAG- TIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT- FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 46 (SEQ ID NO: 46) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG- NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTICKNTQT- QRGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPV- PVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPT-
FTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILE- QWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYK- FWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSAS-
SSSSSSAKRKRVKK Sequência 47 (SEQ ID NO: 47) : MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPL- PKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDR- LVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANG- NAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPV- PPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDIS- QSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHFFNKAGTIGDPV- PVSMYIKGAGQGREPPTTSIYSATPSGSMITSDSQIFNK- PYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTA- SAASASTPFKPSDFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAY- LHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQK- DTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRK-
FLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK Sequência 48 (SEQ ID NO: 48) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 40 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCTCTATCCCGAAAACCGGTCAGAAAGCTGAAATCCCGAAAG- TTTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGAC- CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCG- TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG-
CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCAC- CGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGAC- CCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAG- CATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGG- CTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAA- CAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCAC- CAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCAC- CTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAG- GAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCAC- CCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGAC- CCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTG- CCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGA- ACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGG- CCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGA- CCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCG- CCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGA- AGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAG- CTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAG-
TAA Sequência 49 (SEQ ID NO: 49) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 41 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC-
TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCG- TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTATCGGTACCATCTG- CAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCAC- CGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGAC- CCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAG- CATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGG- CTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAA- CAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCAC- CAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCAC- CTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAG- GAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCAC- CCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGAC- CCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTG- CCCC CCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGA ACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGG- CCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGA- CCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCG- CCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGA- AGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAG- CTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAG-
TAA Sequência 50 (SEQ ID NO: 50) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 42 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCG- TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TTCTACAACAAAGCTGGTGCTGTTGGTGACGCTATCCCGACCAC- CCTGTACATCAAAGGTGCTGAATCTGGTCGTGAACCGCCGAC- CTCTTCTATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCA- GCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGG- CCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTT-
CATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCAT- CAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAG- CAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTG- CAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGG- TGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAG- TGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAG- GACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCA- GAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAG- TACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTG- GACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGG- TGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCG- CTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGA-
AGAGGGTGAAGAAGTAA Sequência 51 (SEQ ID NO: 51) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 43 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTGTCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGCTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTGCG- TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC-
CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCAC- CGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGAC- CCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAG- CATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGG- CTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAA- CAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCAC- CAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTGCTTCTGCTTCTAC- CCCGTTCAAACCGTCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGG- CGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGAT- CACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGAC- CCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTG- CCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGA- ACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGG- CCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGA- CCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCG- CCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGA- AGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAG- CTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAG-
TAA Sequência 52 (SEQ ID NO: 52) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 44 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCTCTATCCCGAAAACCGGTCAGAAAGCTGAAATCCCGAAAG- TTTCTGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGAC- CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC-
CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGG- CCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGA- TCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAG- CGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTC- TATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCA- CATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAG- CGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGG- CCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTT- CATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCAT- CAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAG- CAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTG- CAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGG- TGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAG- TGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAG- GACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCA- GAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAG- TACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTG- GACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGG- TGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCG- CTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGA- AGAGGGTGAAGAAGTAA
Sequência 53 (SEQ ID NO: 53) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 45 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGTATCGGTCTGTCTGGTCAC- CCGCTGTTCAACAAACTGGACGACACCGAAAACTCTCACCTGGC- TACCGTTAACGCTGACACCGACAACCGTGACAACGTTTCTG- TTGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG- CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTC- TATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCA- CATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAG- CGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGG- CCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTT- CATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCAT- CAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAG- CAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTG- CAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGG- TGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAG-
TGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAG- GACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCA- GAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAG- TACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTG- GACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGG- TGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCG- CTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGA-
AGAGGGTGAAGAAGTAA Sequência 54 (SEQ ID NO: 54) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 46 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGG- CCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGA- TCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAG- CGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTATCGGTACCATCTG- CAAAAACACCCAGACCCAGCGTGGTGACTGCCCGCCGCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTC- TATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCA-
CATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAG- CGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGG- CCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTT- CATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCAT- CAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAG- CAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTG- CAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGG- TGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAG- TGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAG- GACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCA- GAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAG- TACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTG- GACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGG- TGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCG- CTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGA-
AGAGGGTGAAGAAGTAA Sequência 55 (SEQ ID NO: 55) : A sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 47 ATGAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCG- TGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTAC- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTAC- TTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGG- TGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGA- CCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAAC- CCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGA- GGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGG- CCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGA- TCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAG- CGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCG- CCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTG-
CAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAG- CTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACAC- CGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCAC- CAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAG- TACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACA- GCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCAC- TTCTTCAACAAAGCTGGTACCATCGGTGACCCTGTTCCGGTTTC- TATGTACATCAAAGGTGCTGGTCAGGGTCGTGAACCGCCGACCA- CATCCATCTACTCTGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAG- CGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGG- CCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTT- CATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCAT- CAGCACCGCCTCTGCTGCTTCTGCTTCTACCCCGTTCAAACCG- TCTGACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAG- CTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCAC- CGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTG- GAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAG- CCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAG- CTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGAC- CCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGA- GAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAG- TTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGG- CCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAG-
CAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA Sequência 56 (SEQ ID NO: 56) :
SIPKTGQKAE Sequência 57 (SEQ ID NO: 57) :
IGLSGHPLFNKLDDTENSHLATVNADTDNRDNV Sequência 58 (SEQ ID NO: 58) :
ICKNTQTQR
Sequência 59 (SEQ ID NO: 59) :
FYNKAGAVGDAIPTTLYIKGAESGREPPTSS Sequência 60 (SEQ ID NO: 60) :
SAASASTPFKPSD Modos Específicos de Execução do Pedido
[0109] O presente pedido é ainda descrito por meio de referência aos exemplos a seguir, em que os exemplos são usados apenas com a finalidade de ilustrar o presente pedido, em vez de limitar o presente pedido.
[0110] A menos que indicado de outra forma, os métodos experi- mentais de biologia molecular e os ensaios imunológicos usados no presente pedido são realizados substancialmente de acordo com os métodos descritos em Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Labo- ratory Manual (Segunda Edição), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 e F.M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Bio- logy, 3ª Edição, John Wiley & Sons, Inc., 1995; e as enzimas de restri- ção são usadas sob as condições recomendadas pelos fabrican- tes. Aqueles versados na técnica entenderão que os exemplos são usados para ilustrar o presente pedido, mas não se destinam a limitar o escopo de proteção do presente pedido. Exemplo 1. Expressão e purificação de proteínas L1 de HPV51 mutantes Construção de vetores de expressão
[0111] Montagem de Gibson (Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA mo- lecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6: 343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318) foi usada para construir o vetor de expres- são que codifica a proteína L1 de HPV51 mutante que compreende um segmento específico da proteína L1 de HPV69 e/ou um segmento es- pecífico da proteína L1 de HPV26. Em suma, um fragmento curto que compreende mutações e um fragmento longo que não compreende nenhuma mutação foram primeiro obtidos por meio de PCR e o siste- ma de montagem de Gibson foi, então, usado para unir os dois frag- mentos para formar um anel.
[0112] O modelo inicial usado compreendia o plasmídeo pTO-T7- HPV51N9C (que codifica a proteína L1 de HPV51 que tem 9 aminoá- cidos truncados no N-término, abreviado como 51L1N9 na Tabela 2), o plasmídeo pTO-T7-HPV69N0C (que codifica a proteína L1 de HPV69 de comprimento completo, abreviado como 69L1N0 na Tabela 2) e o plasmídeo pTO-T7-HPV26N0C (que codifica a proteína L1 de HPV26 de comprimento total; abreviado como 26L1N0 na Tabela 2). Os mo- delos e iniciadores para cada PCR foram apresentados na Tabela 2 e as condições de amplificação para PCR para amplificar o fragmento curto foram as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 10 min; 25 ciclos (desnaturação a 94 °C durante 50 s, recozimento em uma de- terminada temperatura durante um determinado período de tempo e extensão a 72 °C durante 1 min); e extensão final a 72 °C durante 10 min. As condições de amplificação para PCR para amplificar o frag- mento longo foram as seguintes: desnaturação a 94 °C durante 10 min; 25 ciclos (desnaturação a 94 °C durante 50 seg., hibridização em uma determinada temperatura durante um determinado período de tempo e extensão a 72 °C durante 7,5 min); e extensão final a 72 °C durante 10 min. A temperatura e o tempo de hibridização foram lista- dos na Tabela 2. As sequências dos iniciadores de PCR usados foram listadas na Tabela 3. O produto de amplificação foi submetido à eletro- forese, o fragmento de interesse foi, então, recuperado usando o kit DNA Extraction (BEYOTIME, Cat. Nº D0033) e sua concentração foi determinada. O fragmento curto e o fragmento longo obtidos por meio de amplificação foram misturados a uma proporção molar de 2:1 (um volume total de 3 μL) e 3 μL de 2x Gibson Assembly Master Mix (ad-
quirida a partir da NEB, contendo exonuclease T5, DNA polimerase Phusion, DNA ligase Taq) foram, então, adicionados e reagidos a 50 °C durante 1 h.
[0113] O produto montado (6 μL) foi usado para transformar 40 μL de E. coli ER2566 competente (adquirido a partir da New England Bio- labs) preparada por meio do método de cloreto de cálcio. A E. coli transformada foi espalhada em meio LB sólido (componentes do meio LB: Peptona 10 g/L, pó de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L, o mesmo de- pois) que contém canamicina (em uma concentração final de 25 μg/mL, o mesmo depois) e foi submetida à cultura estática a 37 °C du- rante 10-12 h até que colônias individuais pudessem ser observadas claramente. A colônia individual foi coletada e inoculada em um tubo que contém 4 mL de meio LB líquido (contendo canamicina) e cultiva- da com agitação a 220 rpm durante 10 h a 37 °C e, em seguida, 1 mL de solução bacteriana foi retirado e armazenado a -70 °C. Os plasmí- deos foram extraídos da E. coli e o iniciador T7 foi usado para sequen- ciar as sequências nucleotídicas dos fragmentos de interesse inseridos nos plasmídeos. O resultado do sequenciamento mostrou que as se- quências nucleotídicas dos fragmentos de interesse inseridos nos plasmídeos construídos (vetores de expressão) eram SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, respectivamente, e suas sequências de aminoácidos codificadas eram SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 e 47, respectivamente (as proteínas corresponden- tes foram designadas como H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9- 69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9- 69T3-26S2, H51N9-69T3-269S5 H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2- 26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S569T, respectivamente).
[0114] A proteína mutante H51N9-69T1 difere da HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da pro- teína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. A proteína mutante H51N9-69T2 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. A proteína mutante H51N9-69T3 difere de HPV51N9 por: substituição dos resí- duos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 170- 183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. A proteína mu- tante H51N9-69T4 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem. A proteína mutante H51N9-69T5 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 348-359 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 350-362 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem.
[0115] A proteína mutante H51N9-69T1-26S2 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoáci- dos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selva- gem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0116] A proteína mutante H51N9-69T1-26S3 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoáci- dos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selva- gem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0117] A proteína mutante H51N9-69T1-26S4 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoáci- dos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selva- gem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0118] A proteína mutante H51N9-69T1-26S5 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoáci- dos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selva- gem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 348-359 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 348-360 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0119] A proteína mutante H51N9-69T3-26S1 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0120] A proteína mutante H51N9-69T3-26S2 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0121] A proteína mutante H51N9-69T3-26S4 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0122] A proteína mutante H51N9-69T3-26S5 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 348-359 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 348-360 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0123] A proteína mutante H51N9-69T2-26S1 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0124] A proteína mutante H51N9-69T2-26S3 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0125] A proteína mutante H51N9-69T2-26S4 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0126] A proteína mutante H51N9-69T2-26S5 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 348-359 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 348-360 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0127] A proteína mutante H51N9-69T4-26S1 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel-
vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0128] A proteína mutante H51N9-69T4-26S2 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0129] A proteína mutante H51N9-69T4-26S3 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
[0130] A proteína mutante H51N9-69T4-26S5 difere de HPV51N9 por: substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoá- cidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo sel- vagem e uma substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 348-359 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem pelos resíduos de aminoácidos nas posições 348-360 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem.
Tabela 2. Modelos de PCR e iniciadores para a construção de vetores de expressão Temperatu- Iniciador a Iniciador a ra/ Modelo Produtos montante jusante Tempo de recozimento GV- H51N9- GV- H51N9- Fragmento longo de 51L1N9 56 °C/50 s 69T1 -F 69T1 -R H51N9-69T1 GV- H51N9- GV- H51N9- Fragmento longo de 51L1N9 56 °C/50 s 69T2 -F 69T2 -R H51N9-69T2 GV- H51N9- GV- H51N9- Fragmento longo de 51L1N9 56 °C/50 s 69T3 -F 69T3 -R H51N9-69T3 GV- H51N9- GV- H51N9- Fragmento longo de 51L1N9 56 °C/50 s 69T4 -F 69T4 -R H51N9-69T4 GV- H51N9- GV- H51N9- Fragmento longo de 51L1N9 56 °C/50 s 69T5 -F 69T5 -R H51N9-69T5 G- H51N9- G- H51N9- Fragmento curto de 69L1N0 56 °C/30 s 69T1 -F 69T1 -R H51N9-69T1 G- H51N9- G- H51N9- Fragmento curto de 69L1N0 56 °C/30 s 69T2 -F 69T3 -R H51N9-69T3 G- H51N9- G- H51N9- Fragmento curto de 69L1N0 56 °C/30 s 69T3 -F 69T3 -R H51N9-69T3 G- H51N9- G- H51N9- Fragmento curto de 69L1N0 56 °C/30 s 69T4 -F 69T4 -R H51N9-69T4 G- H51N9- G- H51N9- Fragmento curto de 69L1N0 56 °C/30 s 69T5 -F 69T5 -R H51N9-69T5 Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T1-26S2- 69T1-26S2- 56 °C/30 s H51-69T1-26S2
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T1-26S2- 69T1-26S2- 56 °C/50 s 69T1 H51-69T1-26S2
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T1-26S3- 69T1-26S3- 56 °C/30 s H51-69T1-26S3
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T1-26S3- 69T1-26S3- 56 °C/50 s 69T1 H51-69T1-26S3
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T1-26S4- 69T1-26S4- 56 °C/30 s H51-69T1-26S4
F R
Temperatu- Iniciador a Iniciador a ra/ Modelo Produtos montante jusante Tempo de recozimento Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T1-26S4- 69T1-26S4- 56 °C/50 s 69T1 H51-69T1-26S4
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T1-26S5- 69T1-26S5- 56 °C/30 s H51-69T1-26S5
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T1-26S5- 69T1-26S5- 56 °C/50 s 69T1 H51-69T1-26S5
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T3-26S1- 69T3-26S1- 56 °C/30 s H51-69T3-26S1
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T3-26S1- 69T3-26S1- 56 °C/50 s 69T3 H51-69T3-26S1
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T3-26S2- 69T3-26S2- 56 °C/30 s H51-69T3-26S2
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T3-26S2- 69T3-26S2- 56 °C/50 s 69T3 H51-69T3-26S2
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T3-26S4- 69T3-26S4- 56 °C/30 s H51-69T3-26S4
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T3-26S4- 69T3-26S4- 56 °C/50 s 69T3 H51-69T3-26S4
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T3-26S5- 69T3-26S5- 56 °C/30 s H51-69T3-26S5
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T3-26S5- 69T3-26S5- 56 °C/50 s 69T3 H51-69T3-26S5
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T2-26S1- 69T2-26S1- 56 °C/30 s H51-69T2-26S1
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T2-26S1- 69T2-26S1- 56 °C/50 s 69T2 H51-69T2-26S1
R F
Temperatu- Iniciador a Iniciador a ra/ Modelo Produtos montante jusante Tempo de recozimento Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T2-26S3- 69T2-26S3- 56 °C/30 s H51-69T2-26S3
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T2-26S3- 69T2-26S3- 56 °C/50 s 69T2 H51-69T2-26S3
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T2-26S4- 69T2-26S4- 56 °C/30 s H51-69T2-26S4
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T2-26S4- 69T2-26S4- 56 °C/50 s 69T2 H51-69T2-26S4
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T2-26S5- 69T2-26S5- 56 °C/30 s H51-69T2-26S5
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- H51-69T2-26S5 69T2-26S5- 69T2-26S5- 56 °C/50 s 69T2 longo fragmento
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T4-26S1- 69T4-26S1- 56 °C/30 s H51-69T4-26S1
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T4-26S1- 69T4-26S1- 56 °C/50 s 69T4 H51-69T4-26S1
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T4-26S2- 69T4-26S2- 56 °C/30 s H51-69T4-26S2
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T4-26S2- 69T4-26S2- 56 °C/50 s 69T4 H51-69T4-26S2
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T4-26S3- 69T4-26S3- 56 °C/30 s H51-69T4-26S3
F R Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T4-26S3- 69T4-26S3- 56 °C/50 s 69T4 H51-69T4-26S3
R F Frag-H51- Frag-H51- Fragmento curto de 26L1N0 69T4-26S5- 69T4-26S5- 56 °C/30 s H51-69T4-26S5
F R
Temperatu- Iniciador a Iniciador a ra/ Modelo Produtos montante jusante Tempo de recozimento Vetor-H51- Vetor-H51- H51- Fragmento longo de 69T4-26S5- 69T4-26S5- 56 °C/50 s 69T4 H51-69T4-26S5
R F Tabela 3: Sequências dos iniciadores usados (SEQ ID NO: 61-144)
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: GV- H51N9- 61 GTAGGGGTGGCCCAGGGTGATCAG 69T1 -F GV- H51N9- 62 GCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGG 69T1 -R GV- H51N9- 63 CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA 69T2 -F GV- H51N9- 64 ACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCA 69T2 -R GV- H51N9- CTCGCCGATGGGGGGGGCGCAG- 65 69T3 -F CCGATGATGCACAGCTG GV- H51N9- CCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCA- 66 69T3 -R GGACGGCGACA GV- H51N9- 67 GTGCCTGGCGAAGATCTGCTCCCT 69T4-F GV- H51N9- 68 GCCACCCCCAGCGGCAGCATGATC 69T4 -R GV- H51N9- 69 GGCGGTGCTGATGGTCAGGTTGGT 69T5-F GV- H51N9- 70 ACTTCAAGCAGTACATCAGGCACG 69T5-R G- H51N9- CTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTT- 71 69T1-F CCCGATCCCGAAATCTGGT G- H51N9- CCTGAACACCCTGTACTGGAAGGCAGA- 72 69T1-R GACCTTCGGGATTTCAGC G- H51N9- TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGG- 73 69T2-F TCGTGGTCAGCCGCTG G- H51N9- TGATGCACAGCTGGGTCTGCTTGTTGT- 74 69T2-R CAACGCAAACGTTGTCAC G- H51N9- GGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCAC- 75 69T3-F TGGGGTGTCGGTACCGTT
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: G- H51N9- TCACGCTGCTCACCAGCTCCAGGGG- 76 69T3-R CGGGCAGTCACCACGCTGAA G- H51N9- AGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTT- 77 69T4-F CTTCAACAAAGCTGGTACC G- H51N9- GATCATGCTGCCGCTGGGGGTGGCAGAG- 78 69T4-R TAGATGGATGTGGTCGG G- H51N9- ACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTG- 79 69T5-F CTCAGTCTGCTTCTGCT G- H51N9- CGTGCCTGATGTACTGCTTGAAGTCAGA- 80 69T5-R CGGTTTGAAGGTAGCAG Frag-H51- TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGG- 81 69T1-26S2-
TCGTGGTCAGCCGCTGGGT
F Frag-H51- GGGGGCGCAGCCGATGATGCACAG- 82 69T1-26S2-
CTGGGTCTGTTTGTTGTCAAC
R Vetor-H51- 83 69T1-26S2- CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
R Vetor-H51- CTGTGCATCATCGGCTGCG- 84 69T1-26S2-
CTCCCCCCATCG
F Frag-H51- ATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGG- 85 69T1-26S3-
TGAACACTGGGGTATCGGT
F Frag-H51- GCCGTCCTGGATCACGCTGCTCACCAG- 86 69T1-26S3-
TTCCAGCGGCGGGCA
R Vetor-H51- 87 69T1-26S3- GATGGGGGGGGCGCAGCCGATGAT
R Vetor-H51- 88 69T1-26S3- GTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGC
F Frag-H51- TACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGCG- 89 69T1-26S4-
TCGTGAACAGATCTTCGCTCGTCAC F
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: Frag-H51- GCTGTCGCTGGTGATCATGCTGCCAGA- 90 69T1-26S4-
CGGGGTAGCAGAGTAGAT
R Vetor-H51- 91 69T1-26S4- GTGGAAGAACATGCTGTTGCCGTA
R Vetor-H51- 92 69T1-26S4- GGCAGCATGATCACCAGCGACAGC
F Frag-H51- TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTC- 93 69T1-26S5-
TACCAACCTGACCATCTCTACCGCG
F Frag-H51- CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATT- 94 69T1-26S5-
CTTCACCGTGACGGATGTACTGT TTGAA
R Vetor-H51- 95 69T1-26S5- GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
R Vetor-H51- 96 69T1-26S5- GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
F Frag-H51- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCAC- 97 69T3-26S1-
CCTGGGTCACCCGTAC
F Frag-H51- CACCCTGAACACCCTGTACTGGAAAGCA- 98 69T3-26S1-
GAAACTTTCGGGAT
R Vetor-H51- 99 69T3-26S1- GATCAGCCTGCTGCTGCCGGCGTA
R Vetor-H51- 100 69T3-26S1- TTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTG
F Frag-H51- TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGG- 101 69T3-26S2-
TCGTGGTCAGCCGCTGGGT
F Frag-H51- GGGGGCGCAGCCGATGATGCACAG- 102 69T3-26S2-
CTGGGTCTGTTTGTTGTCAAC R
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: Vetor-H51- 103 69T3-26S2- CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
R Vetor-H51- CTGTGCATCATCGGCTGCG- 104 69T3-26S2-
CTCCCCCCATCG
F Frag-H51- TACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGCG- 105 69T3-26S4-
TCGTGAACAGATCTTCGCTCGTCAC
F Frag-H51- GCTGTCGCTGGTGATCATGCTGCCAGA- 106 69T3-26S4-
CGGGGTAGCAGAGTAGAT
R Vetor-H51- 107 69T3-26S4- GTGGAAGAACATGCTGTTGCCGTA
R Vetor-H51- 108 69T3-26S4- GGCAGCATGATCACCAGCGACAGC
F Frag-H51- TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTC- 109 69T3-26S5-
TACCAACCTGACCATCTCTACC
F Frag-H51- CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATT- 110 69T3-26S5-
CTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
R Vetor-H51- 111 69T3-26S5- GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
R Vetor-H51- 112 69T3-26S5- GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
F Frag-H51- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCAC- 113 69T2-26S1-
CCTGGGTCACCCGTAC
F Frag-H51- CACCCTGAACACCCTGTACTGGAAAGCA- 114 69T2-26S1-
GAAACTTTCGGGAT
R Vetor-H51- 115 69T2-26S1- GATCAGCCTGCTGCTGCCGGCGTA
R
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: Vetor-H51- 116 69T2-26S1- TTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTG
F Frag-H51- ATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGG- 117 69T2-26S3-
TGAACACTGGGGTATCGGT
F Frag-H51- GCCGTCCTGGATCACGCTGCTCACCAG- 118 69T2-26S3-
TTCCAGCGGCGGGCA
R Vetor-H51- 119 69T2-26S3- GATGGGGGGGGCGCAGCCGATGAT
R Vetor-H51- 120 69T2-26S3- GTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGC
F Frag-H51- TACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGCG- 121 69T2-26S4-
TCGTGAACAGATCTTCGCTCGTCAC
F Frag-H51- GCTGTCGCTGGTGATCATGCTGCCAGA- 122 69T2-26S4-
CGGGGTAGCAGAGTAGAT
R Vetor-H51- 123 69T2-26S4- GTGGAAGAACATGCTGTTGCCGTA
R Vetor-H51- 124 69T2-26S4- GGCAGCATGATCACCAGCGACAGC
F Frag-H51- TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTC- 125 69T2-26S5-
TACCAACCTGACCATCTCTACC
F Frag-H51- CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATT- 126 69T2-26S5-
CTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
R Vetor-H51- 127 69T2-26S5- GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
R Vetor-H51- 128 69T2-26S5- GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
F
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: Frag-H51- TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCAC- 129 69T4-26S1-
CCTGGGTCACCCGTAC
F Frag-H51- CACCCTGAACACCCTGTACTGGAAAGCA- 130 69T4-26S1-
GAAACTTTCGGGAT
R Vetor-H51- 131 69T4-26S1- GATCAGCCTGCTGCTGCCGGCGTA
R Vetor-H51- 132 69T4-26S1- TTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTG
F Frag-H51- TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGG- 133 69T4-26S2-
TCGTGGTCAGCCGCTGGGT
F Frag-H51- GGGGGCGCAGCCGATGATGCACAG- 135 69T4-26S2-
CTGGGTCTGTTTGTTGTCAAC
R Vetor-H51- 135 69T4-26S2- CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
R Vetor-H51- CTGTGCATCATCGGCTGCG- 136 69T4-26S2-
CTCCCCCCATCG
F Frag-H51- ATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGG- 137 69T4-26S3-
TGAACACTGGGGTATCGGT
F Frag-H51- GCCGTCCTGGATCACGCTGCTCACCAG- 138 69T4-26S3-
TTCCAGCGGCGGGCA
R Vetor-H51- 139 69T4-26S3- GATGGGGGGGGCGCAGCCGATGAT
R Vetor-H51- 140 69T4-26S3- GTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGC
F Frag-H51- TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTC- 141 69T4-26S5-
TACCAACCTGACCATCTCTACC F
SEQ Nome do ID Sequência do iniciador (5'-3') iniciador NO: Frag-H51- CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATT- 142 69T4-26S5-
CTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
R Vetor-H51- 143 69T4-26S5- GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
R Vetor-H51- 144 69T4-26S5- GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
F Expressão das proteínas mutantes em larga escala
[0131] As soluções de E. coli que compreendem o plasmídeo re- combinante pTO-T7-H51N9-69T1, pTO-T7-H51N9-69T2, pTO-T7- H51N9-69T3, pTO-T7-H51N9-69T4, pTO-T7-H51N9-69T5, H51N9 - 69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1- 26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2 -26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9- 69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4- 26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5, respectivamente, ar- mazenadas a -70 °C foram inoculadas em 100 mL de meio líquido LB que contém canamicina e incubadas a 200 rpm e 37 °C durante cerca de 8 h. Em seguida, a cultura foi transferida para 500 mL de meio LB que contém canamicina (1 mL de solução bacteriana foi transferida) e foi posteriormente incubada. Quando a concentração bacteriana atin- giu uma OD600 de cerca de 0,6, a temperatura da cultura foi reduzida para 25 °C e 500 μL de IPTG foram adicionados a cada frasco de cul- tura. A incubação foi posteriormente realizada durante 8 h. Após o término da incubação, as bactérias foram coletadas por meio de centri- fugação. Forma obtidas bactérias que expressam as proteínas H51N9- 69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9- 69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T2 - 26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5,
H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9- 69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4- 26S5, respectivamente. Ruptura de bactérias que expressam as proteínas mutantes
[0132] As bactérias obtidas acima foram ressuspensas em uma proporção de 1 g de bactérias para 10 mL de tampão de lise (tampão de Tris a 20 mM, pH de 7,2, NaCl a 300 mM). As bactérias foram rom- pidas usando um dispositivos ultrassônico durante 30 min. A solução de lise que contém as bactérias rompidas foi centrifugada a 13500 rpm (30000 g) durante 15 min e o sobrenadante (isto é, o sobrenadante das bactérias rompidas) foi obtido. Purificação cromatográfica da proteína mutante
[0133] Equipamento: Sistema de cromatografia de líquido prepara- tiva AKTA Explorer 100 produzido pela GE Healthcare (ou seja, a Amershan Pharmacia Co. antigamente).
[0134] Meio cromatográfico: SP Sepharose 4 Fast Flow (GE Heal- thcare Co.), CHT-II (adquirido a partir da Bio-RAD) e Butil Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Co.).
[0135] Os tampões que contêm diferentes concentrações de NaCl usados no protocolo de eluição a seguir foram preparados ao mistu- rar Tampão A e Tampão B em uma determinada proporção.
[0136] Tampões: Tampão A (tampão de fosfato a 20 mM, pH de 8,0, DTT a 20 mM); e Tampão B (tampão de fosfato a 20 mM, pH de 8,0, DTT a 20 mM, NaCl a 2M).
[0137] Amostra: Os sobrenadantes de bactérias rompidas que contêm H51N9-69T1 e H51N9-69T3, respectivamente, conforme obti- do acima. Protocolo de eluição:
[0138] (1) Purificação por troca catiônica do sobrenadante de bac- térias rompidas por SP Sepharose 4 Fast Flow: A amostra foi carrega-
da na coluna, as proteínas indesejadas foram, então, eluídas com um tampão que contém NaCl a 400 mM (80 % de Tampão A + 20 % de Tampão B), seguido pela eluição da proteína de interesse com um tampão que contém NaCl a 800 mM (60 % de Tampão A + 40 % de Tampão B) e a fração eluída com o tampão que contém NaCl a 800 mM foi coletada;
[0139] (2) Purificação cromatográfica da fração de eluição obtida na etapa (1) por CHTII (cromatografia em hidroxiapatita): A fração de eluição obtida na etapa (1) foi diluída de modo que a concentração de NaCl diminuísse para 0,5 M; a amostra foi carregada na coluna, as proteínas indesejadas foram, então, eluídas com um tampão que con- tém NaCl a 500 mM (75 % de Tampão A + 25 % de Tampão B), segui- do pela eluição da proteína de interesse com um tampão que contém NaCl a 1000 mM (50 % de tampão A + 50 % de tampão B) e a fração eluída com o tampão que contém NaCl a 1000 mM foi coletada;
[0140] (3) Purificação cromatográfica da fração de eluição obtida na etapa (2) por HIC (cromatografia de interação hidrofóbica): A amos- tra foi carregada na coluna, as proteínas indesejadas foram, então, eluídas com um tampão que contém NaCl a 1000 mM, seguido por eluição da proteína de interesse com um tampão que contém NaCl a 200 mM (90 % de Tampão A + 10 % de Tampão B) e a fração eluída com o tampão que contém NaCl a 200 mM foi coletada.
[0141] 150 μL da fração de eluição obtida na etapa (3) foram adi- cionados a 30 μL de 6x Tampão de Carregamento ( 1 L dos quais con- tinha 300 ml de TB a 6,8 1M, 600 ml de glicerol a 100 %, 120 g de SDS, 6 g de azul de bromofenol e 50 ml de β-mercaptoetanol). A solu- ção resultante foi bem misturada e incubada em banho-maria a 80 °C durante 10 min. 10 µl da amostra resultante foram, então, submetidos a SDS-PAGE a 10 % a 120 V durante 120 min; e as bandas eletroforé- ticas foram coradas com azul brilhante de Coomassie. O resultado ele-
troforético é mostrado nas Figuras 1A, 1B, 1C e 1D. O resultado mos- trou que, após as etapas de purificação acima, as proteínas H51N9- 69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9- 69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-269- 69T1-26S4, H51N9-69T1-26S4 -26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9- 69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3- 26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9- 69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 tinham uma pureza de cerca de 90 %.
[0142] Através de métodos similares, a proteína HPV51N9 foi pre- parada e purificada usando E. coli e o plasmídeo pTO-T7- HPV51N9C; A proteína HPV69N0 foi preparada e purificada usando E. coli e o plasmídeo pTO-T7-HPV69L1N0C; e a proteína HPV26N0 foi preparada e purificada usando E. coli e o plasmídeo pTO-T7- HPV26L1N0C. Ensaio Western blot das proteínas mutantes
[0143] As proteínas H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S1, H51N9-69T1-26S1, H51N9- 69T1-26S1, H51N9-69T1-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2- 26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S669T, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 purificadas por meio do mé- todo acima foram submetidas à eletroforese. Após a eletroforese, o ensaio Western Blot foi realizado usando um anticorpo de amplo es- pectro 4B3 contra a proteína L1 de HPV e o resultado é mostrado nas Figuras 2A, 2B, 2C e 2D. O resultado mostrou que as proteínas mutan- tes H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9- 69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S569T,
H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9- 69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3- 26S569T3-26S5, H51N9-69T3-26S569 -69T4-26S1, H51N9-69T4- 26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 podem ser especifica- mente reconhecidas pelo anticorpo de amplo espectro 4B3. Exemplo 2: Montagem de partículas similares ao vírus HPV e de- tecção morfológica de partículas Montagem de partículas similares a vírus HPV
[0144] Um determinado volume (cerca de 2 ml) da proteí- na H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9- 69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-51N26S4, H51N9-69T1-51N26S4, 69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2- 26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-69T3 26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 foi diali- sado contra (1) 2 L de tampão de armazenamento (tampão de fosfato de sódio a 20 mM, pH de 6,5, NaCl a 0,5 M); (2) 2 L de tampão de re- naturação (fosfato de sódio a 50 mM, pH de 6,0, CaCl 2 a 2 mM, MgCl2 a 2 mM, NaCl a 0,5 M); e (3) tampão de fosfato de sódio a 20 mM, pH de 7,0, NaCl a 0,5 M, sucessivamente. A diálise foi realizada em cada um dos três tampões durante 12h.
[0145] Através de métodos similares, as proteínas HPV51N9, HPV69N0 e HPV26N0 foram montadas em VLP de HPV51N9, VLP de HPV69N0 e VLP de HPV26N0, respectivamente. Análise cromatográfica em peneira molecular
[0146] A amostra dialisada foi submetida à análise cromatográfica EM peneira molecular através do 1120 Compact LC High Performance Liquid Chromatographic System (Agilent Technologies), em que a co- luna analítica usada foi TSK Gel PW5000 × 17,8 × 300 mm. O resulta- do da análise de VLP de HPV26N0 foi mostrado na Figura 9, os resul-
tados da análise de outras amostras foram mostrados nas Figuras 3 e
4. Os resultados mostraram que o primeiro pico de proteína das amos- tras que compreende a proteína H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9- 69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1- 26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9- 69T3-26S2, H51N9-69T3-26S269 69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9- 69T4-26S5 apareceram em torno de 13-14 min, o que foi comparável àquele da VLP de HPV51N9. Isto mostrou que, exceto quanto às pro- teínas mutantes H51N9-69T1-26S4 e H51N9-69T1-26S5, as outras proteínas mutantes H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9- 69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-69T1 H51N9-69T1-26S3, H51N9- 69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2- 26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T 69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 e H51N9-69T4-26S5 foram to- das capazes de montagem em VLPs com um tamanho uniforme. As VLPs formadas pela proteína mutante H51N9-69T1-26S4 ou H51N9- 69T1-26S5 tinham um tamanho não uniforme. Análise de velocidade de sedimentação
[0147] O dispositivo para análise da velocidade de sedimentação foi a Ultracentrífuga Analítica Beckman XL-A, equipada com sistema de inspeção óptica e rotor An-50Ti e An-60Ti. Os coeficientes de se- dimentação de VLP de HPV51N9, HPV69N0 VLP, VLP de H51N9- 69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3, VLP de H51N9- 69T4, VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2- 26S1, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T3-26S1, VLP de H51N9-69T3-
26S2, VLP de H51N9-69T3-26S4, VLP de H51N9-69T3-26S5, VLP de H51N9-69T4-26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9-69T4- 26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5 foram analisados por meio do mé- todo de sedimentação. O resultado da análise de VLP de HPV26N0 foi mostrado na Figura 9, os resultados da análise de outras amostras fo- ram mostrados nas Figuras 5 e 6. Os resultados mostraram que os coeficientes de sedimentação de VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3, VLP de H51N9-69T4, VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1- 26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2- 26S5, VLP de H51N9-69T3-26S1, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S4, VLP de H51N9-69T3-26S5, VLP de H51N9-69T4- 26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5 foram 148S, 135S, 117S, 131S, 148S, 130S, 131S, 130S, 135S, 140S, 135S, 144S, 133S, 131S, 161S, 140S, 137S, 132S, 126S e 48S, respectivamente, em que a VLP de H51N9-69T1- 26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9- 69T3-26S5 tinham pobre uniformidade e tinham dois tamanhos dife- rentes. Teste morfológico de partículas similares a vírus
[0148] Uma amostra de 100 μL que compreende VLP foi observa- da através de um microscópio de transmissão eletrônico (TEM). O dis- positivo usado foi um microscópio de transmissão eletrônico de 100 kV fornecido pela JEOL Ltda. (ampliação de 100.000X). Em suma, 13,5 μL de amostra foram corados negativamente com ácido fosfotúngstico a 2 % (pH de 7,0), fixados em uma grade de cobre revestida de carbo- no e, então, observados por TEM. As fotografias por TEM da VLP de HPV26N0 foram mostradas na Figura 9 e as fotografias por TEM de outras amostras foram mostradas nas Figuras 7 e 8. Os resultados mostraram que, exceto quanto à VLP de H51N9-69T1-26S4, as outras VLPs, VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9- 69T3, VLP de H51N9-69T4, VLP de H51N9-69T5, VLP de H51N9- 69T1-26S2, VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T3- 26S1, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S4, VLP de H51N9-69T3-26S5, VLP de H51N9-69T4-26S1, VLP de H51N9-69T4- 26S2, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5 eram similares à VLP de HPV51N9 e tinham um raio de cerca de 25 nm. Exemplo 3: Avaliação 1 da titulação de anticorpos neutralizantes no soro de camundongos vacinados com partículas similares a vírus
[0149] Neste experimento, as partículas similares a vírus usadas foram VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9- 69T3, VLP de H51N9-69T4 e VLP de H51N9-69T5.
[0150] Neste experimento, o cronograma de vacinação foi mostra- do na Tabela 4. Todos os camundongos (camundongos BalB/c fêmeas com 6 semanas de idade) foram divididos em 2 grupos: Grupo 1 com adjuvante de alumínio (em uma dose imunizante de 5 μg, usando ad- juvante de alumínio), Grupo 2 com adjuvante de alumínio (na dose imunizante de 1 μg, usando adjuvante de alumínio). Cada grupo foi dividido em 8 subgrupos. Os subgrupos de controle 1 e 2 foram vaci- nados com VLP de HPV51N9 individualmente e VLP de HPV69N0 in- dividualmente, respectivamente, o subgrupo de controle 3 foi vacinado com a VLP de HPV51/HPV69 mista (ou seja, uma mistura de VLPs de HPV51N9 e VLP de HPV69N0, em uma determinada dose imunizan- te para cada VLP). Os subgrupos experimentais 1, 2, 3, 4 e 5 foram vacinados com VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de
H51N9-69T3, VLP de H51N9-69T4 e VLP de H51N9-69T5, respecti- vamente.
[0151] Nos grupos com adjuvante de alumínio 1-2, 5 camundon- gos/subgrupo foram vacinados através de injeção intraperitoneal em uma dose imunizante de 5 μg e 1 μg, respectivamente, e um volume de injeção de 1 mL. Todos os camundongos foram submetidos à pri- meira vacinação na semana 0 e, em seguida, à vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Na semana 8, a amostra de sangue foi coletada via coleta de sangue orbital e as titulações de anti- corpos contra HPV51 e HPV69 no soro foram analisadas. Os resulta- dos da análise foram mostrados nas Figuras 10A e 10B. O resultado mostrou que a VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 podem, cada uma, induzir à gera- ção de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV51 em camundongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV51N9 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69 mista na mesma dose e foram significativamente maio- res do que aqueles da VLP de HPV69N0 individualmente na mesma dose. A VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9-69T2, VLP de H51N9- 69T3 e VLP de H51N9-69T4 também podem, cada uma, induzir à ge- ração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV69 em camundongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69 mista na mesma dose e foram significativamente maio- res do que a VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose.
[0152] Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T1, VLP de H51N9- 69T2, VLP de H51N9-69T3 e VLP de H51N9-69T4 tinham boa imuno- genicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV51 e HPV69.
Tabela 4. Cronograma de vacinação Antígeno Procedimento Dose Grupo para vaci- Adjuvante Número de vacinação imunizante nação (semana) adjuvante VLP de de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 HPV51N9 nio adjuvante VLP de de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 HPV69N0 nio VLP de adjuvante 5 μg para HPV51/HPV de alumí- 5 0, 2, 4 cada VLP 69 nio VLP de adjuvante Grupo 1 H51N9- de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 com adju- 69T1 nio vante de VLP de adjuvante alumínio H51N9- de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 69T2 nio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 69T3 nio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 69T4 nio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 5 μg 5 0, 2, 4 69T5 nio adjuvante VLP de de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 HPV51N9 nio adjuvante VLP de de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 HPV69N0 nio Grupo 2 VLP de adjuvante com adju- 1 μg para HPV51/HPV de alumí- 5 0, 2, 4 vante de cada VLP 69 nio alumínio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 69T1 nio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 69T2 nio
Antígeno Procedimento Dose Grupo para vaci- Adjuvante Número de vacinação imunizante nação (semana) VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 69T3 nio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 69T4 nio VLP de adjuvante H51N9- de alumí- 1 μg 5 0, 2, 4 69T5 nio Exemplo 4: Avaliação 2 da titulação de anticorpos neutralizantes no soro de camundongos vacinados com partículas similares a vírus
[0153] Neste experimento, as partículas similares a vírus usadas foram VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1-26S5, VLP de H51N9-69T3- 26S1, V51-26S1 VLP, H51N9-669, VLP de H51N9-69T3-26S4 e VLP de H51N9-69T3-26S5.
[0154] Neste experimento, o cronograma de vacinação foi mostra- do na Tabela 5. Todos os camundongos (camundongos BalB/c fêmeas de 6 semanas de idade) foram divididos em 2 grupos: Grupo 1 com adjuvante de alumínio (em uma dose imunizante de 5 μg, usando ad- juvante de alumínio), Grupo 2 com adjuvante de alumínio (na dose imunizante de 1 μg, usando adjuvante de alumínio). Cada grupo foi dividido em 12 subgrupos. Os subgrupos de controle 1, 2 e 3 foram vacinados com VLP de HPV51N9 individualmente, VLP de HPV69N0 individualmente e VLP de HPV26N0 individualmente, respectivamente, o subgrupo de controle 4 foi vacinado com a mistura de VLPs de HPV51/HPV69/HPV26 (ou seja, uma mistura de VLP de HPV51N9, VLP de HPV69N0 e VLP de HPV26N0, em uma determinada dose imunizante para cada VLP). Os subgrupos experimentais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 foram vacinados com VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de
H51N9-69T1-26S3, VLP de H51N9-69T1-26S4, VLP de H51N9-69T1- 26S5, VLP de H51N9-69T3-26S1, VLP de H51N9-69T3-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S4 e VLP de H51N9-69T3-26S5, respectivamente.
[0155] Nos grupos com adjuvante de alumínio 1-2, 5 camundon- gos/subgrupo foram vacinados através de injeção intraperitoneal em uma dose imunizante de 5 μg e 1 μg, respectivamente, e um volume de injeção de 1 mL. Todos os camundongos foram submetidos à pri- meira vacinação na semana 0 e, em seguida, submetidos à vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Na semana 8, a amostra de sangue foi coletada via coleta de sangue orbital e as titula- ções de anticorpos contra HPV51, HPV69 e HPV26 no soro foram analisadas. Os resultados da análise foram mostrados nas Figu- ras 11A e 11B. O resultado mostrou que a VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S2 podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV51 em camundongos e seus efeitos protetores eram com- paráveis àqueles da VLP de HPV51N9 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose e foram significa- tivamente maiores do que aqueles da VLP de HPV69N0 individual- mente e aqueles da VLP de HPV26N0 individualmente na mesma do- se. A VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV69 em camun- dongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose e foram significativamen- te maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose. A VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3- 26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV26 em camundongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV26N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose e foram significativamen- te maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose.
Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T3-26S2 tinham boa imunoge- nicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV51, HPV69 e HPV26. Tabela 5. Cronograma de vacinação Procedi- Dose mento de Antígeno para Núme- Grupo Adjuvante imuni- vacina- vacinação ro zante ção (se- mana) VLP de adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 HPV51N9 alumínio VLP de adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 HPV69N0 alumínio VLP de adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 HPV26N0 alumínio VLP de 5 μg para adjuvante de HPV51/HPV69/H cada 5 0, 2, 4 alumínio PV26 VLP VLP de H51N9- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S2 alumínio Grupo 1 VLP de H51N9- adjuvante de com adju- 5 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S3 alumínio vante de VLP de H51N9- adjuvante de alumínio 5 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S4 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S5 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S1 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S2 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S4 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S5 alumínio
Procedi- Dose mento de Antígeno para Núme- Grupo Adjuvante imuni- vacina- vacinação ro zante ção (se- mana) VLP de adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 HPV51N9 alumínio VLP de adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 HPV69N0 alumínio VLP de adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 HPV26N0 alumínio VLP de 1 μg para adjuvante de HPV51/HPV69/H cada 5 0, 2, 4 alumínio PV26 VLP VLP de H51N9- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S2 alumínio Grupo 2 VLP de H51N9- adjuvante de com adjuv 1 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S3 alumínio ante de VLP de H51N9- adjuvante de alumínio 1 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S4 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 69T1-26S5 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S1 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S2 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S4 alumínio VLP de H51N9- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 69T3-26S5 alumínio Exemplo 5: Avaliação 3 da titulação de anticorpos neutralizantes no soro de camundongos vacinados com partículas similares a vírus
[0156] Neste experimento, as partículas similares a vírus usadas foram VLP de H51N9-69T2-26S1, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T4- 26S1, VLP de H51N9-69T, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S5.
[0157] Neste experimento, o cronograma de vacinação foi mostra- do na Tabela 6. Todos os camundongos (camundongos BalB/c fêmeas de 6 semanas de idade) foram divididos em 2 grupos: Grupo 1 com adjuvante de alumínio (em uma dose imunizante de 5 μg, usando ad- juvante de alumínio), Grupo 2 com adjuvante de alumínio (na dose imunizante de 1 μg, usando adjuvante de alumínio). Cada grupo foi dividido em 12 subgrupos. Os subgrupos de controle 1, 2 e 3 foram vacinados com VLP de HPV51N9 individualmente, VLP de HPV69N0 individualmente e VLP de HPV26N0 individualmente, respectivamente, o subgrupo de controle 4 foi vacinado com VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista (isto é, uma mistura de VLP de HPV51N9, VLP de HPV69N0, HPV69N0 e VLP de HPV26N0, em uma determinada dose imunizante para cada VLP). Os subgrupos experi- mentais 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 foram vacinados com VLP de H51N9- 69T2-26S1, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T2-26S4, VLP de H51N9-69T2-26S5, VLP de H51N9-69T4-26S1, VLP de H51N9-69T4-26S2, VLP de H51N9-69T4-26S3 e VLP de H51N9- 69T4-26S5, respectivamente.
[0158] Nos grupos com adjuvante de alumínio 1-2, 5 camundon- gos/subgrupo foram vacinados através de injeção intraperitoneal em uma dose imunizante de 5 μg e 1 μg, respectivamente e um volume de injeção de 1 mL. Todos os camundongos foram submetidos à primeira vacinação na semana 0 e, em seguida, à vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Na semana 8, a amostra de sangue foi coletada via coleta de sangue orbital e as titulações de anticorpos contra HPV51, HPV69 e HPV26 no soro foram analisados. Os resulta- dos da análise foram mostrados nas Figuras 12A e 12B. O resultado mostrou que a VLP de H51N9-69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4- 26S2 podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizan- tes de alta titulação contra HPV51 em camundongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV51N9 individu- almente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e aqueles da VLP de HPV26N0 individual- mente na mesma dose.
A VLP de H51N9-69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4-26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neutralizantes de alta titulação contra HPV69 em camun- dongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV69N0 individualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose e foram significativamen- te maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose.
A VLP de H51N9-69T2-26S3 e VLP de H51N9-69T4- 26S2 também podem, cada uma, induzir à geração de anticorpos neu- tralizantes de alta titulação contra HPV26 em camundongos e seus efeitos protetores eram comparáveis àqueles da VLP de HPV26N0 in- dividualmente e àqueles da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista na mesma dose e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP de HPV51N9 individualmente na mesma dose.
Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T2-26S3 e a VLP de H51N9-69T4-26S2 tinham boa imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV51, HPV69 e HPV26. Tabela 6. Cronograma de vacinação Proce- dimento Dose Antígeno para vacina- Nú- de vaci- Grupo Adjuvante imunizan- ção mero nação te (sema- na) adjuvante de VLP de HPV51N9 1 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP de HPV69N0 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio Grupo 1 com adjuvante de adjuvante de VLP de HPV26N0 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio alumínio VLP de adjuvante de 5 μg para 5 0, 2, 4 HPV51/HPV69/HPV26 alumínio cada VLP VLP de H51N9-69T2- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 6S1 alumínio
Proce- dimento Dose Antígeno para vacina- Nú- de vaci- Grupo Adjuvante imunizan- ção mero nação te (sema- na) VLP de H51N9-69T2- adjuvante de 5μg 5 0, 2, 4 6S3 alumínio VLP de H51N9-69T2- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 6S4 alumínio VLP de H51N9-69T2- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 6S5 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 26S1 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 26S2 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 26S4 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 5 μg 5 0, 2, 4 26S5 alumínio adjuvante de VLP de HPV51N9 1 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP de HPV69N0 1 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP de HPV26N0 1 μg 5 0, 2, 4 alumínio VLP de adjuvante de 1 μg para 5 0, 2, 4 HPV51/HPV69/HPV26 alumínio cada VLP VLP de H51N9-69T2- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 26S1 alumínio VLP de H51N9-69T2- adjuvante de Grupo 2 1 μg 5 0, 2, 4 26S3 alumínio com adjuvant VLP de H51N9-69T2- adjuvante de e de alumínio 1 μg 5 0, 2, 4 26S4 alumínio VLP de H51N9-69T2- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 26S5 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 26S1 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 26S2 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 26S3 alumínio VLP de H51N9-69T4- adjuvante de 1 μg 5 0, 2, 4 26S5 alumínio Exemplo 6: Avaliação de ED50 de partículas similares a vírus para indução de soroconversão
[0159] Neste experimento, as partículas similares a vírus usadas foram VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T4-26S2.
[0160] Camundongos BalB/c fêmeas de 6 semanas de idade (8 camundongos) foram vacinados com adjuvante de alumínio através de uma única injeção intraperitoneal, em que a VLP de H51N9-69T1- 26S2, VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T3-26S1 ou VLP de H51N9-69T4-26S2 (em uma dose imunizante de 0,900 μg, 0,300 μg, 0,100 μg, 0,033 μg e 0,011 μg) foi usada nos grupos experimentais e VLP de HPV51N9 individualmente, VLP de HPV69N0 individualmen- te, VLP de HPV26N0 individualmente (em uma dose imunizante de 0,900 μg, 0,300 μg, 0,100 μg, 0,033 μg e 0,011 μg) ou VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista (ou seja, uma mistura de VLP de HPV51N9, VLP de HPV69N0 e VLP HPV26N10, em uma dose imuni- zante de 0,900 μg, 0,300 μg, 0,100 μg, 0,033 μg e 0,011 μg para cada VLP); o volume de imunização foi de 1 mL. Além disso, o diluente usado para diluir a vacina foi usado como um controle em branco. 8 camundongos foram vacinados em cada grupo e, na sema- na 5 após a vacinação, o sangue venoso foi coletado do globo ocu- lar. Anticorpos contra HPV no soro foram detectados e, através do mé- todo de Reed-Muench (R Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27: 493-7), a ED50 para indu- ção de seroconversão (ou seja, indução da geração de anticorpos em camundongos) foi calculada para cada amostra. Os resultados foram mostrados na Tabela 7. Tabela 7. ED50 para a VLP de H51N9-69T1-26S2, VLP de H51N9- 69T2-26S3, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T4-26S2 para indução da geração de anticorpos contra HPV51, HPV69 e HPV26 (soroconversão) em camundongos
ED50 contra ED50 contra ED50 contra VLP de HPV (μg) HPV51PsV HPV69PsV HPV26PsV (μg) (μg) (μg) HPV51N9 0,058 ＞0,9 ＞0,9 HPV69N0 ＞0,9 0,029 0,019 HPV26N0 ＞0,9 0,008 0,057 HPV51N9-69T1-26S2 ＞0,9 0,178 ＞0,9 HPV 51N9-69T3-26S1 0,066 0,048 0,176 HPV51N9-69T2-26S3 0,170 0,180 0,120 HPV51N9-69T4-26S2 0,010 0,007 0,058 HPV51/69/26 0,066 0,010 0,007
[0161] Os resultados mostraram que, 5 semanas após a vacinação dos camundongos, a ED50 para a VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T4-26S2 para indução da ge- ração de anticorpos contra HPV51 em camundongos era comparável àquela da VLP de HPV51N9 individualmente e àquela da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista e foi significativamente maior do que aquela para a VLP de HPV69N0 individualmente e a VLP de HPV26N0 individualmente; e a sua ED50 para indução da geração de anticorpos contra HPV69 foi comparável àquela da VLP de HPV69N0 individual- mente e àquela da VLPL de HPV51/HPV69/HPV26 mista e foi signifi- cativamente maior do que aquela da VLP de HPV51N9 individualmen- te; e sua ED50 para indução da geração de anticorpos contra HPV26 foi comparável àquela da VLP de HPV26N0 individualmente e àquela da VLP de HPV51/HPV69/HPV26 mista e foi significativamente maior do que aquela da VLP de HPV51N9 individualmente. Isto mostrou que a VLP de H51N9-69T2-26S3, VLP de H51N9-69T3-26S1 e VLP de H51N9-69T4-26S2 tinham boa imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV51, HPV69 e HPV26.
[0162] Embora as modalidades específicas do presente pedido tenham sido descritas em detalhes, aqueles versados na técnica en- tenderão que, de acordo com os ensinamentos descritos no relatório descritivo, várias modificações e alterações podem ser feitas nas mesmas e que tais modificações e alterações estão dentro do âmbito do presente pedido.
O escopo do presente pedido é fornecido pelas reivindicações em anexo e quaisquer equivalentes das mesmas.

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína L1 de HPV5 mutante ou uma variante da mes- ma caracterizada pelo fato de que, comparado com uma proteína L1 de HPV5 de tipo selvagem, (I) a proteína L1 de HPV5 mutante tem as seguintes muta- ções: (1) truncamento de 0-15 aminoácidos no N -término da pro- teína L1 de HPV51 de tipo selvagem; e a mutação conforme definido em (2)(a), (2)(b), (2)(c) ou (2)(d): (2)(a) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 52-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem; (2)(b) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 125-147 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem; (2)(c) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 170-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem; (2)(d) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 259-289 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV de tipo selvagem, ou (II) a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação con- forme definido em (1) e (2)(a) e tem ainda uma mutação conforme de- finido em (3)(b); ou
(III) a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação con- forme definido em (1) e (2)(b) e tem ainda uma mutação conforme de- finido em (3)(c); ou (IV) a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação con- forme definido em (1) e (2)(c) e tem ainda uma mutação conforme de- finido em (3)(a) ou (3)(b); ou (V) a proteína L1 de HPV51 mutante tem a mutação con- forme definido em (1) e (2)(d) e tem ainda uma mutação conforme de- finido em (3)(b); em que as mutações conforme definido em (3)(a), (3)(b) ou (3)(c) são as seguintes: (3)(a) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 51-60 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem; (3)(b) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 114-146 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem; (3)(c) substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 173-181 da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem por resíduos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV de tipo selvagem; e a variante difere da proteína L1 de HPV51 mutante ape- nas quanto à substituição, adição ou eliminação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 aminoácidos e retém a função da proteína L1 de HPV51 mutante, isto é, capacidade de induzir à ge- ração de anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de
HPV.
2. Proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes itens: (i) a proteína L1 de HPV51 mutante tem 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos truncados no N-término da proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem comparado com a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem, (ii) o segundo tipo de HPV de tipo selvagem é HPV69; (iii) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (2)(a) são resíduos de aminoácidos nas posições 52-60 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem; (iv) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (2)(b) são resíduos de aminoácidos nas posições 125-147 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem; (v) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (2)(c) são resíduos de aminoácidos nas posições 170-183 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem; (vi) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (2)(d) são resíduos de aminoácidos nas posições 261-291 de uma proteína L1 de HPV69 de tipo selvagem; (vii) o terceiro tipo de HPV de tipo selvagem é HPV26; (viii) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (3)(a) são resíduos de aminoácidos nas posições 51-60 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem; (ix) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (3)(b) são resíduos de aminoácidos nas posições 114-146 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem; (x) os resíduos de aminoácidos nas posições correspon- dentes conforme descrito em (3)(c) são resíduos de aminoácidos nas posições 173-181 de uma proteína L1 de HPV26 de tipo selvagem; (xi) a proteína L1 de HPV51 de tipo selvagem tem uma se- quência de aminoácidos conforme apresentadp em SEQ ID NO: 1; (xii) a proteína L1 do segundo tipo de HPV de tipo selva- gem tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 2; (xiii) a proteína L1 do terceiro tipo de HPV de tipo selvagem tem uma sequência de aminoácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 22.
3. Proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 de HPV51 mutante tem uma sequência de ami- noácidos conforme apresentado em SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 23, 27, 28, 41 ou 45.
4. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 32, 36, 37, 49 ou 53.
6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o áci- do nucleico isolado, como definido na reivindicação 4 ou 5.
7. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 4 ou 5 e/ou o vetor, como definido na reivindicação 6.
8. Partícula similar a vírus HPV, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste na proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3.
9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou o ácido nuclei- co isolado, como definido na reivindicação 4 ou 5, ou o vetor, como definido na reivindicação 6, ou a célula hospedeira, como definida na reivindicação 7, ou a partícula similar a vírus HPV, como definida na reivindicação 8.
10. Composição farmacêutica ou vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula similar ao vírus HPV, como defini- da na reivindicação 8 e, opcionalmente, um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. Composição farmacêutica ou vacina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a partícula similar ao vírus HPV está presente em uma quantidade eficaz para prevenir a infecção pelo HPV ou uma doença causada através de infecção pelo HPV.
12. Composição farmacêutica ou vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a infecção pelo HPV é infecção por um ou mais tipos de HPV e/ou a doença causada através de infecção pelo HPV é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer do colo do útero, condiloma acuminado e qualquer combinação dos mesmos.
13. Composição farmacêutica ou vacina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a infecção pelo HPV é selecionada a partir do grupo que consiste em: infecção pelo HPV51, infecção pelo HPV69, infecção pelo HPV26 e qualquer combinação das mesmas.
14. Método para preparar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende expres-
sar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma em uma célula hospedeira e, em seguida, recuperar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma a partir de uma cultura da célula hospedeira.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracteriza- do pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes itens: (i) a célula hospedeira é E. coli; (ii) o método compreende as etapas de: expressar a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma em E. coli e, em se- guida, obter a proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mes- ma por meio de purificação de um sobrenadante de lisato de E. coli.
16. Método para preparar uma vacina, caracterizado pelo fato de que compreende combinar a partícula similar ao vírus HPV, como definida na reivindicação 8 com um veículo e/ou excipiente far- maceuticamente aceitável.
17. Uso da proteína L1 de HPV51 mutante ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma partícula similar a vírus HPV, como definida na reivindica- ção 8, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica ou vacina para prevenir a infecção pelo HPV ou uma doença causada através de infecção pelo HPV.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a infecção pelo HPV é infecção por um ou mais tipos de HPV e/ou a doença causada através de infecção pelo HPV é sele- cionada a partir do grupo que consiste em câncer do colo do útero, condiloma acuminado e qualquer combinação dos mesmos.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a infecção pelo HPV é selecionada a partir do grupo que consiste em: infecção pelo HPV51, infecção pelo HPV69, infecção pelo HPV26 e qualquer combinação das mesmas.
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