KR20210064318A - Hpv 타입 51의 l1 단백질의 돌연변이체 - Google Patents

Hpv 타입 51의 l1 단백질의 돌연변이체 Download PDF

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Abstract

돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체, 그의 코딩 서열, 그의 제조방법, 및 그를 포함하는 바이러스-유사 입자로서, 상기 단백질 또는 그의 변이체 및 상기 바이러스-유사 입자는 2종 이상의 HPV(예를 들면, HPV51과 HPV69, 또는 HPV51, HPV69 및 HPV26)에 대한 중화 항체를 유도할 수 있는 것인 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체, 그의 코딩 서열, 그의 제조방법, 및 그를 포함하는 바이러스-유사 입자가 제공된다. 또한, 백신 또는 약학적 조성물의 제조를 위한 전술된 단백질 및 바이러스-유사 입자의 용도로서, 상기 약학적 조성물 또는 백신은 2종 이상의 HPV의 감염 또는 상기 감염에 의해 유발되는 질환, 예를 들면, 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위해 사용될 수 있는 것인 용도가 제공된다.

Description

HPV 타입 51의 L1 단백질의 돌연변이체
본 출원은 그 개시가 참조에 의해 전체로 본 명세서에 포함된, 2018년 9월 26일에 제출된 중국 출원 제201811122822.1호에 근거하고, 그로부터의 우선권의 이익을 주장한다.
본 출원은 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 돌연변이된 HPV51 L1 단백질(또는 그의 변이체), 그를 코딩하는 서열, 그의 제조 방법 및 이를 포함하는 바이러스-유사 입자에 관한 것으로, 상기 단백질(또는 그의 변이체) 및 바이러스-유사 입자는 2종 이상의 HPV(예를 들어 HPV51 및 HPV69, 또는 HPV51, HPV69 및 HPV26)에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 따라서 상기 2종 이상의 HPV에 의한 감염, 상기 감염에 의해 유발되는 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마(condyloma acuminatum)의 예방에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 2종 이상의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발되는 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 상기 단백질 및 상기 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(Human Papillomavirus: HPV)는 주로 피부 및 점막에 사마귀를 유발한다. HPV 타입은 종양형성과의 관련성에 따라 고위험 타입 및 저위험 타입으로 분류된다. 이 중에서, 고위험 HPV 타입에 의한 감염은 여성에서 자궁경부암을 포함한 생식기 암의 주요 원인인 것으로 입증되었으며; 저위험 HPV 타입은 주로 첨형 콘딜로마를 유발한다. HPV 감염을 예방하고 통제하는 가장 효과적인 방법은 HPV 백신, 특히 자궁경부암을 일으키는 고위험 HPV 타입에 대한 백신을 접종하는 것이다.
HPV의 주요 캡시드 단백질 L1은 중공의 바이러스-유사 입자(hollow Virus-Like Particle: VLP)로 자가조립하는 특징을 갖는다. HPV VLP는 주요 캡시드 단백질 L1의 72개 오량체로 구성된 대칭적인 정이십면체 구조를 갖는다(Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9). HPV VLP는 구조 면에서 천연 HPV와 매우 유사하고, 천연 바이러스의 중화 에피토프 대부분을 유지하며, 고역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다(Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4).
기존 연구들은 HPV VLP가 주로 동일한 HPV 타입에 대한 중화 항체 생성을 유도하고, 동일한 HPV 타입에 대한 보호 면역을 생성하며, 일부 매우 상동성이 높은 HPV 타입들 간에 낮은 교차-보호 효과만을 갖는다는 것을 보여준다 (Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555). 따라서, 기존의 HPV 백신들은 매우 제한적인 보호 범위를 갖는다. 일반적으로, 하나의 HPV 타입의 VLP는 동일한 HPV 타입에 의한 감염의 예방에만 사용될 수 있다. 이 경우에, HPV 백신의 보호 범위를 확대해야 하는 경우, 유일한 방법은 백신에 보다 많은 타입의 HPV의 VLP를 추가하는 것이다. 현재, 머크의 가다실(Gardasil)®(HPV16, 18, 6 및 11에 대한 4가 백신) 및 가다실®9(HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 및 58에 대한 9가 백신), 및 GSK의 서바릭스(Cervarix)®(HPV16 및 18에 대한 2가 백신)를 포함하는 상업적으로 입수가능한 HPV 백신들은 다수의 HPV 타입의 VLP들을 혼합하여 제조된다. 그러나, 이와 같은 방법은 HPV 백신의 생산 비용을 크게 증가시키고, 면역화 용량(immunizaing dose)의 증가로 인해 안전성 문제를 야기할 수 있다.
따라서, 다수의 HPV 타입에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발되는 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 보다 경제적이고 효과적으로 예방하기 위해, 다수의 HPV 타입에 대한 보호 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 HPV 바이러스-유사 입자를 개발하는 것이 당해 기술 분야에서 시급하다.
본 출원은 적어도 부분적으로 본 발명자들의 놀라운 발견에 기초한다: 인유두종 바이러스(HPV) 타입 51의 L1 단백질의 특정 세그먼트를 제2 HPV 타입 (예를 들어 HPV69)의 L1 단백질의 상응하는 세그먼트에 의해 치환한 후에, 이에 따라 수득된 돌연변이된 HPV51 L1 단백질이 개체에서 HPV51 및 제2 HPV 타입(예를 들어 HPV69)에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과는 HPV51 VLP 및 제2 HPV 타입의 VLP의 혼합물의 효과에 필적하고, HPV51에 대한 그의 보호 효과는 HPV51 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제2 HPV 타입(예를 들어 HPV69)에 대한 그의 보호 효과는 제2 HPV 타입 단독의 VLP의 경우에 필적한다.
또한, 상기 치환에 기초하여, HPV51 L1 단백질의 또 다른 특정 세그먼트가 제3 HPV 타입(예를 들어 HPV26)의 L1 단백질의 상응하는 세그먼트로 추가적으로 치환될 수 있고, 이에 따라 수득된 이중 치환을 갖는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 HPV51, 제2 HPV 타입(예를 들어 HPV69) 및 제3 HPV 타입(예를 들어 HPV26)에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 출원은 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체로서, 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 하기 돌연변이를 갖고:
(1) 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에서, 0 내지 15개의 아미노산, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단(truncation); 및
하기 (2)(a), (2)(b), (2)(c) 또는 (2)(d)에 정의된 돌연변이:
(2)(a) 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
(2)(b) 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
(2)(c) 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
(2)(d) 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환, 및
상기 변이체는 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질과 1개 이상 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개)의 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실에 의해서만 다르고, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질의 기능, 즉, 2종 이상의 HPV(예를 들면, HPV51 및 HPV69)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 보유하는 것인 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(a)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(b)에 정의된 돌연변이를 더 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(b)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(c)에 정의된 돌연변이를 더 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(c)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(a) 또는 (3)(b)에 정의된 돌연변이를 더 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(d)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(b)에 정의된 돌연변이를 더 갖는다.
상기 (3)(a), (3)(b) 또는 (3)(c)에 정의된 돌연변이는 하기와 같다:
(3)(a) 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
(3)(b) 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
(3)(c) 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, N-말단에서 절단된 9개의 아미노산을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 제2 타입의 야생형 HPV는 HPV69이다. 일부 구체예에서, (2)(a)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, (2)(b)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, (2)(c)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, (2)(d)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기이다.
일부 구체예에서, 상기 제3 타입의 야생형 HPV는 HPV26이다. 일부 구체예에서, (3)(a)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 위치에 있는 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, (3)(b)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, (3)(c)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기이다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV51 L1 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV26 L1 단백질은 서열번호 22로 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들은 서열번호 17에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들은 서열번호 18에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들은 서열번호 19에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들은 서열번호 20에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 350-362번 아미노산 잔기들은 서열번호 21에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들은 서열번호 56에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들은 서열번호 57에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들은 서열번호 58에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들은 서열번호 59에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질의 348-360번 아미노산 잔기들은 서열번호 60에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 서열번호 4, 5, 6, 또는 7로 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 서열번호 23, 27, 28, 41 또는 45로 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 전술된 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 상기 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 단리된 핵산은 서열번호 12, 13, 14 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 단리된 핵산은 서열번호 32, 36, 37, 49 또는 53에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 목적 폴리뉴클레오티드(polynucleotide of interest)의 삽입을 위해 유용한 벡터들이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 일 구체예에서, 상기 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파아지, 등이다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 또한 전술된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 대장균 세포와 같은 원핵 세포, 및 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포(예를 들면, 마우스 세포, 인간 세포 등과 같은 포유동물 세포)와 같은 진핵 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 출원에 따른 숙주 세포는 또한, 세포주, 예를 들면, 293T 세포일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 포함하거나, 그로 구성된 HPV 바이러스-유사 입자(virus-like particle, VLP)에 관한 것이다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단을 갖고, 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 아미노산의 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 0 내지 15개 아미노산의 절단, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단을 갖고, 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 아미노산의 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에 9개 아미노산의 절단, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 서열번호 4, 5, 6 또는 7에 기재된 서열을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 서열번호 23, 27, 28, 41 또는 45에 기재된 서열을 갖는, 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 또한 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체, 상기 단리된 핵산, 상기 벡터, 상기 숙주 세포, 또는 상기 HPV 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 본 출원에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 또한 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자 및 선택적으로, 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 출원에 따른 약학적 조성물 또는 백신은 HPV 감염, 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방에 유효한 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 HPV 감염은 1종 이상의 HPV에 의한 감염 (예를 들면, HPV51 감염, HPV69 감염 및 HPV26 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 감염)이다. 일부 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암, 첨형 콘딜로마 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 출원에 따른 약학적 조성물 또는 백신은 당해 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 경구 또는 주사에 의해 투여될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서, 특히 바람직한 투여 경로는 주사이다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 출원에 따른 약학적 조성물 또는 백신을 단위 투여 제형(unit dosage form)으로 투여한다. 예를 들어, 본 출원을 제한하는 것은 아니지만, 각각의 단위 투여량은 5 ㎍ 내지 80 ㎍, 바람직하게는 20 ㎍ 내지 40 ㎍의 HPV 바이러스-유사 입자를 함유한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 전술된 바와 같은 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 제조하는 방법으로서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및 그 후, 상기 숙주 세포의 배양물로부터 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli)이다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 E. coli에서 발현시키는 단계, 그런 다음 E. coli의 용해물 상층액을 정제함으로써 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체는 상기 E.coli의 용해물 상층액으로부터 크로마토그래피(예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 회수된다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제와 조합하는 단계를 포함하는, 백신의 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 예방적 유효량(prophylactically effective amount)의 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자 또는 약학적 조성물 또는 백신을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV51 감염, HPV69 감염 및/또는 HPV26 감염)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 개체는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 또한 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 본 출원에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체 또는 HPV 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV51 감염, HPV69 감염 및/또는 HPV26 감염)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 또한 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 본 출원에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체 또는 HPV 바이러스-유사 입자에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV51 감염, HPV69 감염 및/또는 HPV26 감염)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원 중 용어의 정의
본 출원에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어들은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 본원에서 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험 작업들은 해당 분야에서 널리 사용되는 통상적인 작업들이다. 한편, 본 출원의 이해를 돕기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본 출원에 따르면, 용어 "제2 타입의 야생형 HPV(a second type of wild type HPV)"는 HPV51 이외의 야생형 HPV 타입을 의미한다. 본 출원에서, 제2 타입의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV69이다.
본 출원에 따르면, 용어 "제3 타입의 야생형 HPV(a third type of wild type HPV)"는 HPV51 및 제2 타입의 야생형 HPV 이외의 야생형 HPV 타입을 의미한다. 본 출원에서, 제3 타입의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV26이다.
본 출원에 따르면, 표현 "상응하는 위치(corresponding positions)"는 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 최고의 동일성 비율을 수득하도록 정렬시킬 때, 비교되는 서열들의 상당하는(equivalent) 위치를 의미한다.
본 출원에 따르면, 용어 "야생형 HPV51 L1 단백질(wild type HPV51 L1 prot)"은 인유두종 바이러스 타입 51(HPV51)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 의미한다. 야생형 HPV51 L1 단백질의 서열은 당업계에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스에서 찾을 수 있다 (예를 들어 NCBI 데이터베이스의 등록번호 ACV88631.1, ALJ32930.1, CRH69903.1, 및 AJS10540.1).
본 출원에서, 야생형 HPV51 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 설명된다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 위치의 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 52-60 of a wild type HPV51 L1 protein)"는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 폴리펩티드의 52-60번 위치의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV51이 다양한 단리물(isolate)을 포함할 수 있고, 다양한 단리물 간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 서열에 차이가 있을 수 있으나, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV51 단리물 간에 매우 높은 동일성 (일반적으로 95% 초과, 예를 들면, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 갖고, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다는 것을 이해한다. 따라서, 본 출원에서, 용어 "야생형 HPV51 L1 단백질(wild type HPV51 L1 protein)"은 서열번호 1로 기재된 단백질 및 다양한 HPV51 단리물의 L1 단백질(예를 들면, ACV88631.1, ALJ32930.1, CRH69903.1 및 AJS10540.1에 기재된 HPV51 L1 단백질)을 포함한다. 또한, 야생형 HPV51 L1 단백질의 서열 단편이 기재되는 경우, 이는 서열번호 1의 서열 단편 뿐 아니라, 다양한 HPV51 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들면, 표현 "야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 52-60 of a wild type HPV51 L1 protein)"는 서열번호 1의 52-60번 위치에 있는 아미노산 잔기 및 다양한 HPV51 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 출원에 따르면, 용어 "야생형 HPV69 L1 단백질(wild type HPV69 L1 protein)"은 인간 유두종바이러스 타입 69(HPV69)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 의미한다. 야생형 HPV69 L1 단백질의 서열은 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다(예를 들면, NCBI 데이터베이스의 등록번호(Accession No.) AHV83654.1, ALJ32844.1, 및 ALJ32828.1).
본 출원에서, 야생형 HPV69 L1 단백질의 아미노산 서열이 언급될 때, 서열번호 2에 기재된 서열에 대한 참조에 의해 기재된다. 예를 들면, 표현 "야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 52-60 of a wild type HPV69 L1 protein)"는 서열번호 2에 기재된 폴리펩티드의 52-60번 아미노산 잔기들을 의미하고; 표현 "야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 170-183 of a wild type HPV69 L1 protein)"는 서열번호 2에 기재된 폴리펩티드의 170-183번 아미노산 잔기들을 의미한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV69가 다양한 단리물을 포함할 수 있고, 다양한 단리물 간에 L1 단백질의 아미노산 서열에 차이가 있을 수 있다는 것을 이해한다. 또한, 당업자는 서열에 차이가 있을 수 있으나, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV69 단리물 간에 매우 높은 동일성 (일반적으로 95% 초과, 예를 들면, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 갖고, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다는 것을 이해한다. 따라서, 본 출원에서, 용어 "야생형 HPV69 L1 단백질(wild type HPV69 L1 protein)"은 서열번호 2로 기재된 단백질 및 다양한 HPV69 단리물의 L1 단백질(예를 들면, AHV83654.1, ALJ32844.1 및 ALJ32828.1에 기재된 HPV51 L1 단백질)을 포함한다. 또한, 야생형 HPV69 L1 단백질의 서열 단편이 기재되는 경우, 이는 서열번호 2의 서열 단편 뿐 아니라, 다양한 HPV69 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들면, 표현 "야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 52-60 of a wild type HPV69 L1 protein)"는 서열번호 2의 52-60번 위치에 있는 아미노산 잔기 및 다양한 HPV69 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 출원에 따르면, 용어 "야생형 HPV26 L1 단백질(wild type HPV26 L1 protein)"은 인간 유두종바이러스 타입 26 (HPV26)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 의미한다. 야생형 HPV26 L1 단백질의 서열은 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 공개 데이터베이스에서 찾을 수 있다(예를 들면, NCBI 데이터베이스의 등록번 NP041787.1, AHY96046.1, 및 AHY96053.1).
본 출원에서, 야생형 HPV26 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 22에 제시된 서열을 참조하여 설명된다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 위치의 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 51-60 of a wild type HPV26 L1 protein)"는 서열번호 22에 제시된 폴리펩티드의 51-60번 위치의 아미노산 잔기를 의미하고; 표현 "야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 위치의 아미노산 잔기(amino acid residues at positions 173-181 of a wild type HPV26 L1 protein)"는 서열번호 22에 제시된 폴리펩티드의 173-181번 위치의 아미노산 잔기를 의미한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV26이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들 간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있다는 것을 이해한다. 더욱이, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV26 단리물들간에 매우 높은 동일성 (일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는다는 것을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "야생형 HPV26 L1 단백질(wild type HPV26 L1 protein)"이란 용어는 서열번호 22에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV26 단리물의 L1 단백질 (예를 들면, NP041787.1, AHY96046.1 및 AHY96053.1에 기재된 HPV26 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV26 L1 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 이는 서열번호 2의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV26 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 22의 51-60번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV26 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 출원에 따르면, 표현 "상응하는 서열 단편(corresponding sequence fragments)" 또는 "상응하는 단편(corresponding fragments)"은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 가장 높은 백분율의 동일성이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 동등한(equivalent) 위치에 위치하는 단편을 의미한다.
본 출원에 따르면, 표현 "N-말단에서 X개 아미노산의 절단(truncation of amino acids at N-terminal)" 또는 "N-말단에 X개 아미노산의 절단을 갖는(having X amino acids truncated at N-terminal)"은 단백질의 N-말단의 1 내지 X번 위치의 아미노산 잔기의 (단백질 번역을 개시하기 위한) 개시 코돈에 의해 코딩된 메티오닌 잔기에 의한 치환을 의미한다. 예를 들어 N-말단에서 9개 아미노산의 절단을 갖는 HPV51 L1 단백질은 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단의 1 내지 9번 위치의 아미노산 잔기를 개시 코돈에 의해 암호화된 메티오닌 잔기로 치환하여 얻어지는 단백질을 의미한다.
본 출원에 따르면, 용어 "변이체(variant)"는 단백질의 아미노산 서열이 1개 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 아미노산의 치환 (바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실을 갖거나, 또는 본 출원에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 (예를 들어 서열번호 5 또는 6에 제시된 바와 같은 단백질)과 비교하여 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지며, 본 출원에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질의 기능을 유지하는 단백질을 의미한다. 본 출원에서, 용어 "돌연변이된 HPV51 L1 단백질의 기능(function of the mutated HPV51 L1 protein)"은 2종 이상의 HPV(예를 들어 HPV51 및 HPV69)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 의미한다. 용어 "동일성(identity)"은 뉴클레오티드 서열들 또는 아미노산 서열들 간의 유사성의 척도를 의미한다. 일반적으로, 서열들은 최대 일치가 획득되도록 정렬되었다. "동일성"은 당업계에서 잘 알려진 의미를 가지며 공개된 알고리즘 (예를 들어 BLAST)에 의해 계산될 수 있다.
본 출원에 따르면, 용어 "동일성(identity)"은 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 핵산 간의 일치 정도를 의미한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정 위치에서 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브유닛을 갖는 경우 (예를 들어 2개의 DNA 분자가 각각 특정한 위치에서 아데닌을 갖거나, 또는 2개의 폴리펩티드가 각각 특정한 위치에서 리신을 갖는 경우), 그 2개의 분자는 해당 부위에서 동일하다. 2개 서열 간의 동일성 백분율(percent identity)은 비교를 위한 부위의 총 수에 걸쳐 상기 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 부위 수 x 100의 함수이다. 예를 들어 2개 서열의 10개 부위 중 6개가 일치하는 경우, 이들 2개 서열은 60%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 동일성을 공유한다 (6개 부위 중 3개가 일치한다). 일반적으로 2개 서열의 비교는 최대 일치를 생성시키는 방식으로 수행된다. 그러한 정렬은 예를 들어 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Needleman, et al의 방법(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)에 기초한 Align 프로그램 (DNAstar, Inc)을 사용하여 수행할 수 있다. 2개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 또한, PAM120 가중치 잔기 표(weight residue table)를 사용하고, 12의 갭 길이 페널티 (gap length penalty) 및 4의 갭 페널티 (gap penalty)로, ALIGN 프로그램에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하여, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 (gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치 (length weight)로, GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 사용가능) 중 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩티드의 필수적인 성질에 불리하게 영향을 미치거나 또는 변화시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 예를 들어, 보존적 치환은 당업계에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이 유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 상응하는 아미노산 잔기와 유사한 곁사슬을 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 상응하는 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한(예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성시키는 능력을 포함한 화학적 성질 등을 갖는) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 곁사슬을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리(families)가 당업계에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 곁사슬을 갖는 아미노산 (예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 곁사슬을 갖는 아미노산 (예를 들어 아스파트트산 및 글루탐산), 비하전 극성 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 곁사슬을 갖는 아미노산 (예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 곁사슬을 갖는 아미노산 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 곁사슬을 갖는 아미노산(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 일반적으로 보존적 치환은 상응하는 아미노산 잔기의 동일한 곁사슬 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기에 의한 치환을 의미한다. 아미노산 보존적 치환의 확인 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997) 참조).
본 출원에 따르면, 용어 "대장균 발현 시스템(E. coli expression system)"은 E.coli(균주) 및 벡터로 이루어지는 발현 시스템을 의미하며, 상기 E.coli (균주)는 상업적으로 입수할 수 있는 균주로부터 유래하고, ER2551, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 따르면, 용어 "벡터(vector)"는 그에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 가질 수 있는 핵산 운반체 도구를 의미한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질의 발현을 가능하게 하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 한다. 벡터는 숙주 세포 내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 운반되는 유전물질 요소가 숙주 세포에서 발현되게 할 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지, 코스미드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 따르면, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제(a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient)"는 개체 및 활성 성분에 약리학적으로 및/또는 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 부형제를 의미하며, 이들은 당업계에 주지되어 있고 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), pH 조절제, 계면활성제, 아쥬반트, 및 이온 강도 증강제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액(phosphate buffer)을 포함하나 이에 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을 포함하나 이에 제한되지 않고; 아쥬반트는 알루미늄 아쥬반트(예를 들어 수산화 알루미늄), 및 프로인트 아쥬반트(예를 들어 프로인트 완전 아쥬반트)를 포함하나 이에 제한되지 않고; 이온 강도 증강제는 NaCl을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 따르면, 용어 "유효량(an effective amount)"은 의도하는 목적을 유효하게 달성할 수 있는 양을 의미한다. 예를 들어, 질환 (예를 들어 HPV 감염)의 예방을 위한 유효량은 질환 (예를 들어 HPV 감염)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 또는 지연시키기에 유효한 양을 의미한다. 그러한 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다.
본 출원에 따르면, 용어 "크로마토그래피(chromatography)"는 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 흡수성(absorbent) 크로마토그래피 (예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과 크로마토그래피 (겔 배제 크로마토그래피), 및 친화성 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 따르면, 용어 "용해물 상층액(lysate supernatant)"은 하기 단계에 의해 생성된 용액을 의미한다: 숙주 세포 (예를 들어, 대장균)를 용해 버퍼에서 파쇄시키고, 이어서 상기 파쇄된 숙주 세포를 함유하는 용해된 용액으로부터 불용성 물질을 제거한다. 다양한 용해 버퍼가 당업계에 주지되어 있으며, 트리스 버퍼, 포스페이트 버퍼, HEPES 버퍼, MOPS 버퍼 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 숙주 세포의 파쇄는 당업자에 의해 균질화 파쇄, 초음파 처리, 분쇄, 고압 압출, 리소자임 처리 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 주지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 불용성 물질의 제거 방법도 당업자에게 잘 알려져 있고 여과 및 원심분리를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
연구는 HPV51 및 다른 HPV 타입(들)(예를 들어 HVP69 및/또는 HPV26) 간에 어느 정도의 교차-보호가 존재하지만, 그러한 교차-보호는 매우 낮으며, 일반적으로 동일한 HPV 타입의 VLP의 보호 수준의 1% 미만, 심지어는 1000 분의 1에 불과하다는 것을 보여준다. 따라서, HPV51 백신을 접종 받은 개체는 여전히 다른 HPV 타입(들)(예를 들어 HVP69 및/또는 HPV26)에 의해 감염될 위험이 높다.
본 출원은 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 및 그에 의해 형성된 HPV 바이러스-유사 입자를 제공한다. 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 HPV51 및 다른 HPV 타입(들)(예를 들어 HVP69 및/또는 HPV26)에 대해 유의성 있는 교차-보호를 제공할 수 있다. 특히, 동일한 면역화 용량에서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 개체에서 2종 이상의 HPV(예를 들어 HPV51 및 HPV69, 또는 HPV51, HPV69 및 HPV26)에 대해 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그 효과는 복수 HPV 타입의 VLP의 혼합물(예를 들어 HPV51 VLP 및 HPV69 VLP의 혼합물, 또는 HPV51 VLP, HPV69 VLP 및 HPV26 VLP의 혼합물)의 효과와 비슷하다. 따라서, 본 출원에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 동시에 적어도 2개 타입의 HPV(예를 들어 HPV51 및 HPV69, 또는 HPV51, HPV69 및 HPV26)에 의한 감염뿐만 아니라 상기 감염과 관련된 질환을 예방하기 위해 사용될 수 있으며, 현저하게 유용한 기술적 효과를 갖는다. 이는 HPV 백신의 보호 범위의 확대 및 HPV 백신의 생산 비용을 줄이는 측면에서 특히 상당한 이점을 갖는다.
본 출원의 구체예는 도면 및 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 당업자는 하기 도면 및 실시예가 본 출원의 범위를 한정하기 보다는 단지 본 출원을 설명하기 위한 것으로 의도된다는 것을 이해할 것이다. 하기 도면 및 바람직한 구체예의 상세한 설명에 따르면, 본 출원의 다양한 목적 및 장점들은 당업자에게 자명하다.
도 1a는 실시예 1에서 정제된 돌연변이된 단백질의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 래인 1: 단백질 분자량 마커; 래인 2: HPV51N9 (N-말단에서 9개의 아미노산 절단을 갖는 HPV51 L1)；래인 3: HPV69N0 (전장 야생형 HPV69 L1 단백질)；래인 4: H51N9-69T1 (서열번호 4로 기재된 돌연변이된 단백질)；래인 5: H51N9-69T2 (서열번호 5로 기재된 돌연변이된 단백질)；래인 6: H51N9-69T3 (서열번호 6으로 기재된 돌연변이된 단백질)；래인 7: H51N9-69T4 (서열번호 7로 기재된 돌연변이된 단백질)；래인 8: H51N9-69T5 (서열번호 8로 기재된 돌연변이된 단백질). 결과는 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 및 H51N9-69T5가 약 90%의 순도에 도달했다는 것을 보여주었다.
도 1b 내지 1d는 실시예 1에서 정제된 돌연변이된 단백질 H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5의 SD-PAGE 결과를 보여준다. SDS-PAGE 결과는 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 돌연변이된 단백질이 약 80-90%의 비교적 높은 순도에 도달했다는 것을 보여주었다.
도 2a는 HPV L1 단백질에 대한 광범위 항체(broad-spectrum antibody) 4B3을 이용하여 측정된, 실시예 1에서 제조된 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 and H51N9-69T5의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 래인 1: 단백질 분자량 마커; 래인 2: HPV51N9 (N-말단에서 9개의 아미노산 절단을 갖는 HPV51 L1)； 래인 3: HPV69N0 (전장 야생형 HPV69 L1 단백질); 래인 4: H51N9-69T1; 래인 5: H51N9-69T2; 래인 6: H51N9-69T3; 래인 7: H51N9-69T4; 래인 8: H51N9-69T5. 결과는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 및 H51N9-69T5가 광범위 항체 4B3에 의해 특이적으로 인식될 수 있다는 것을 보여주었다.
도 2b 내지 2d는 HPV L1 단백질에 대한 광범위 항체 4B3을 이용하여 측정된, 실시예 1에서 제조된 돌연변이된 단백질 H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 결과는 크로마토그래피에 의한 정제 후에, 돌연변이된 단백질이 광범위 항체 4B3에 의해 특이적으로 인식될 수 있다는 것을 보여주었다.
도 3은 분자 시브 크로마토그래피(molecular sieve chromatography)에 의해 분석된, 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 또는 H51N9-69T5를 포함하는 시료의 결과를 보여준다. 결과는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 또는 H51N9-69T5를 포함하는 시료의 제1 단백질 피크가 약 13-14분에 나타났고, 이는 HPV51N9 VLP의 것과 유사했다는 것을 보여주었다. 이는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4 및 H51N9-69T5가 모두 균일한 크기를 갖는 VLP로 조립될 수 있다는 것을 보여주었다.
도 4는 분자 시브 크로마토그래피에 의해 분석된, 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 또는 H51N9-69T4-26S5를 포함하는 시료의 결과를 보여준다. 결과는 이들 돌연변이된 VLP의 제1 단백질 피크가 HPV51N9 VLP의 것과 유사하게, 약 13-14분에 나타났다는 것을 보여주었다. 이는 이들 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5가 모두 균일한 크기를 갖는 VLP로 조립될 수 있다는 것을 보여주었다. 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S4 또는 H51N9-69T1-26S5에 의해 형성된 VLP는 균일하지 않은 크기를 가졌다.
도 5는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP의 침강 속도 분석(sedimentation velocity analysis)의 결과를 보여준다. 결과는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP의 침강 계수(sedimentation coefficient)가 각각 148S, 135S, 117S 및 131S라는 것을 보여주었다. 이는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3 및 H51N9-69T4가 모두 크기 및 형태 면에서 야생형 VLP(HPV51N9 VLP, 123S)와 유사한 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있다는 것을 보여주었다.
도 6은 돌연변이된 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5VLP, H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP, H51N9-69T3-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP의 침강 속도 분석의 결과를 보여준다. 결과는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5VLP, H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP, H51N9-69T3-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP의 침강 계수가 각각 148S, 130S, 131S, 130S, 135S, 140S, 135S, 144S, 133S, 131S, 161S, 140S, 137S, 132S, 126S 및 48S였고, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S5 VLP는 불량한 균일성을 가졌고, 2개의 상이한 크기를 가졌다는 것을 보여주었다.
도 7은 다양한 VLP 시료의 전사 전자 현미경(TEM) 사진 (100,000 Х 확대로 촬영됨, 막대(Bar)=0.1 ㎛)을 보여주며, A는 HPV51N9 VLP의 TEM 사진을 보여주고; B는 H51N9-69T1 VLP의 TEM 사진을 보여주며; C는 H51N9-69T2 VLP의 TEM 사진을 보여주고; D는 H51N9-69T3 VLP의 TEM 사진을 보여주며; E는 H51N9-69T4 VLP의 TEM 사진을 보여주고; F는 H51N9-69T5 VLP의 TEM 사진을 보여주며; G는 HPV69N0 VLP의 TEM 사진을 보여준다. 결과는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP 및 H51N9-69T5 VLP가 HPV51N9 VLP와 유사하고, 이들 돌연변이된 단백질은 약 25 nm의 반경을 갖는 VLP로 조립될 수 있다는 것을 보여주었다.
도 8은 다양한 VLP 시료의 전사 전자 현미경(TEM) 사진 (100,000 Х 확대로 촬영됨, 막대=0.1 ㎛)을 보여주며, A는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP 및 H51N9-69T1-26S5VLP의 TEM 사진을 보여주고; B는 H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP 및 H51N9-69T2-26S5 VLP의 TEM 사진을 보여주며; C는 H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP 및 H51N9-69T3-26S5 VLP의 TEM 사진을 보여주고; D는 H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP의 TEM 사진을 보여준다. 결과는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S4를 제외하고, 나머지 돌연변이된 단백질들은 약 25 nm의 반경을 갖는 VLP로 조립될 수 있다는 것을 보여주었다.
도 9는 HPV26N0 VLP의 확인 결과를 보여주고, A는 분자 시브 크로마토그래피에 의해 분석된 HPV26N0 VLP의 결과를 보여주고; B는 HPV26N0 VLP의 침강 속도 분석의 결과를 보여주며; C는 HPV26N0 VLP의 TEM 사진을 보여준다.
도 10a 및 10b는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, H51N9-69T4 VLP 및 H51N9-69T5 VLP에 의한 마우스의 백신 접종(vaccination) 후에 마우스 혈청 중 중화항체 역가의 결과를 보여준다. 도 10a: 알루미늄 아쥬반트 그룹 1(알루미늄 아쥬반트를 이용한, 5.0 ㎍의 면역화 용량(immunizing dose)); 도 10b: 알루미늄 아쥬반트 그룹 2 (알루미늄 아쥬반트를 이용한, 1 ㎍의 면역화 용량). 결과는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP가 각각 마우스에서 HPV51에 대한 고-역가(high-titer) 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV69N0 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. 이는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP가 HPV51 및 HPV69에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호(cross-protection)를 갖는다는 것을 보여주었다.
도 11a 및 11b는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP 및 H51N9-69T3-26S5 VLP에 의한 마우스의 백신 접종 후에 마우스 혈청 중 중화 항체 역가의 결과를 보여준다. 도 11a: 알루미늄 아쥬반트 그룹 1(알루미늄 아쥬반트를 이용한, 5.0 ㎍의 면역화 용량); 도 11b: 알루미늄 아쥬반트 그룹 2 (알루미늄 아쥬반트를 이용한, 1 ㎍의 면역화 용량). 결과는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP가 각각 마우스에서 HPV51에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 HPV26N0 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP는 각각 마우스에서 HPV69에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다. H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP는 각각 마우스에서 HPV26에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV26N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다. 이는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP가 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 갖는다는 것을 보여주었다.
도 12a 및 12b는 H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP에 의한 마우스의 백신 접종 후에 마우스 혈청 중 중화 항체 역가의 결과를 보여준다. 도 12a: 알루미늄 아쥬반트 그룹 1(알루미늄 아쥬반트를 이용한, 5.0 ㎍의 면역화 용량); 도 12b: 알루미늄 아쥬반트 그룹 2 (알루미늄 아쥬반트를 이용한, 1 ㎍의 면역화 용량). 결과는 H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP가 각각 마우스에서 HPV51에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 HPV26N0 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP도 각각 마우스에서 HPV69에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP도 각각 마우스에서 HPV26에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV26N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량의 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. 이는 H51N9-69T2-26S3 VLP and H51N9-69T4-26S2 VLP가 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 갖는다는 것을 보여주었다.
서열 정보
본 출원에 관련된 서열의 일부가 하기 표 1에 제공된다.
서열번호 설명
1 야생형 HPV51 L1 단백질, HPV51 L1
2 야생형 HPV69 L1 단백질, HPV69 L1, 즉, HPV69 N0
3 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단된 HPV51 L1 단백질, HPV51N9
4 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 1을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T1
5 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 2를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T2
6 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 3을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T3
7 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 4를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T4
8 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 5를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T5
9 서열번호 1을 코딩하는 DNA 서열
10 서열번호 2를 코딩하는 DNA 서열
11 서열번호 3을 코딩하는 DNA 서열
12 서열번호 4를 코딩하는 DNA 서열
13 서열번호 5를 코딩하는 DNA 서열
14 서열번호 6을 코딩하는 DNA 서열
15 서열번호 7을 코딩하는 DNA 서열
16 서열번호 8을 코딩하는 DNA 서열
17 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들, 즉, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 1의 서열
18 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들, 즉, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 2의 서열
19 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들, 즉, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 3의 서열
20 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들, 즉, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 4의 서열
21 야생형 HPV69 L1 단백질의 350-362번 아미노산 잔기들, 즉, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 5의 서열
22 야생형 HPV26 L1 단백질, HPV26 L1
23 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 1, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 2를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T1-26S2
24 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 1, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 3을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T1-26S3
25 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 1, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 4를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T1-26S4
26 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 1, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 5를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T1-26S5
27 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 3, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 1을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T3-26S1
28 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 3, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 2를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T3-26S2
29 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 3, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 4를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T3-26S4
30 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 3, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 5를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T3-26S5
31 서열번호 22를 코딩하는 DNA 서열
32 서열번호 23을 코딩하는 DNA 서열
33 서열번호 24를 코딩하는 DNA 서열
34 서열번호 25를 코딩하는 DNA 서열
35 서열번호 26을 코딩하는 DNA 서열
36 서열번호 27을 코딩하는 DNA 서열
37 서열번호 28을 코딩하는 DNA 서열
38 서열번호 29를 코딩하는 DNA 서열
39 서열번호 30을 코딩하는 DNA 서열
40 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 2, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 1을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T2-26S1
41 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 2, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 3을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T2-26S3
42 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 2, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 4를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T2-26S4
43 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 2, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 5를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T2-26S5
44 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 4, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 1을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T4-26S1
45 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 4, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 2를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T4-26S2
46 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 4, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 3을 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T4-26S3
47 N-말단에서 9개의 아미노산이 절단되고, HPV69 L1 단백질의 세그먼트 4, 및 HPV26 L1 단백질의 세그먼트 5를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질, H51N9-69T4-26S5
48 서열번호 40을 코딩하는 DNA 서열
49 서열번호 41을 코딩하는 DNA 서열
50 서열번호 42를 코딩하는 DNA 서열
51 서열번호 43을 코딩하는 DNA 서열
52 서열번호 44를 코딩하는 DNA 서열
53 서열번호 45를 코딩하는 DNA 서열
54 서열번호 46을 코딩하는 DNA 서열
55 서열번호 47을 코딩하는 DNA 서열
56 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들, 즉, HPV26 L1 단백질의 세그먼트 1의 서열
57 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들, 즉, HPV26 L1 단백질의 세그먼트 2의 서열
58 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들, 즉, HPV26 L1 단백질의 세그먼트 3의 서열
59 야생형 HPV26 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들, 즉, HPV26 L1 단백질의 세그먼트 4의 서열
60 야생형 HPV26 L1 단백질의 348-360번 아미노산 잔기들, 즉, HPV26 L1 단백질의 세그먼트 5의 서열
서열 1(서열번호 1)：
MALWRTNDSKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTATAAVSPTFTPSNFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK.
서열 2(서열번호 2)：
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서열 3(서열번호 3)：
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서열 4(서열번호 4)：
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서열 5(서열번호 5)：
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서열 6(서열번호 6)：
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서열 7(서열번호 7)：
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서열 8(서열번호 8)：
MKVYLPPAPVSRIVNTEEYITRTGIYYYAGSSRLITLGHPYFPLPKTSTRAAIPKVSAFQYRVFRVQLPDPNKFGLPDPNLYNPDTDRLVWGCVGVEVGRGQPLGVGLSGHPLFNKYDDTENSRIANGNAQQDVRDNTSVDNKQTQLCIIGCAPPIGEHWGIGTTCKNTPVPPGDCPPLELVSSVIQDGDMIDTGFGAMDFAALQATKSDVPLDISQSVCKYPDYLKMSADTYGNSMFFHLRREQIFARHYYNKLGSVGEDIPTDYYIKGSGNGRDPIESYIYSATPSGSMITSDSQIFNKPYWLHRAQGHNNGICWNNQLFITCVDTTRSTNLTISTASAQSASATFKPSDFKQYIRHGEEYELQFIFQLCKITLTTEVMAYLHTMDPTILEQWNFGLTLPPSASLEDAYRFVRNAATSCQKDTPPQAKPDPLAKYKFWDVDLKERFSLDLDQFALGRKFLLQVGVQRKPRPGLKRPASSASSSSSSSAKRKRVKK.
서열 9(서열번호 9)：
ATGGCCCTGTGGAGGACCAACGACAGCAAGGTGTACCTGCCCCCCGCCCCCGTGAGCAGGATCGTGAACACCGAGGAGTACATCACCAGGACCGGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCCCTGCCCAAGACCAGCACCAGGGCCGCCATCCCCAAGGTGAGCGCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGCTCCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACCCCAACCTGTACAACCCCGACACCGACAGGCTGGTGTGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTTCAACAAGTACGACGACACCGAGAACAGCAGGATCGCCAACGGCAACGCCCAGCAGGACGTGAGGGACAACACCAGCGTGGACAACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCATCGGCACCACCTGCAAGAACACCCCCGTGCCCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGATCGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCGCCGCCCTGCAGGCCACCAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCAGCCAGAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGAGCGCCGACACCTACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGAGGAGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTACTACAACAAGCTGGGCAGCGTGGGCGAGGACATCCCCACCGACTACTACATCAAGGGCAGCGGCAACGGCAGGGACCCCATCGAGAGCTACATCTACAGCGCCACCCCCAGCGGCAGCATGATCACCAGCGACAGCCAGATCTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGAACAACCAGCTGTTCATCACCTGCGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCATCAGCACCGCCACCGCCGCCGTGAGCCCCACCTTCACCCCCAGCAACTTCAAGCAGTACATCAGGCACGGCGAGGAGTACGAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGGCCTACCTGCACACCATGGACCCCACCATCCTGGAGCAGTGGAACTTCGGCCTGACCCTGCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACGCCTACAGGTTCGTGAGGAACGCCGCCACCAGCTGCCAGAAGGACACCCCCCCCCAGGCCAAGCCCGACCCCCTGGCCAAGTACAAGTTCTGGGACGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCCTGGACCTGGACCAGTTCGCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGTGGGCGTGCAGAGGAAGCCCAGGCCCGGCCTGAAGAGGCCCGCTAGCAGCGCCAGCTCCAGCAGCTCCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAGGGTGAAGAAGTAA
서열 10(서열번호 10)：
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서열 11(서열번호 11)：
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서열 12(서열번호 12)：
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서열 13(서열번호 13)：
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서열 14(서열번호 14)：
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서열 15(서열번호 15)：
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서열 16(서열번호 16)：
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서열 17(서열번호 17)：
IPKSGSTAE
서열 18(서열번호 18)：
LDDTENSHLATANADTDNRDNVC
서열 19(서열번호 19)：
VGTVCKNAQSQVQR
서열 20(서열번호 20)：
FFNKAGTIGDPVPVSMYIKGAGQGREPPTTS
서열 21(서열번호 21)：
SAQSASATFKPSD
서열 22(서열번호 22)：
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서열 23(서열번호 23)：
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서열 24(서열번호 24)：
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서열 25(서열번호 25)：
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서열 26(서열번호 26)：
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서열 27(서열번호 27)：
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서열 28(서열번호 28)：
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서열 29(서열번호 29)：
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서열 30(서열번호 30)：
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서열 31(서열번호 31)：
서열번호 22를 코딩하는 DNA 서열
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서열 32(서열번호 32)：
서열번호 23을 코딩하는 DNA 서열
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서열 33(서열번호 33)：
서열번호 24를 코딩하는 DNA 서열
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서열 34(서열번호 34)：
서열번호 25를 코딩하는 DNA 서열
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서열 35(서열번호 35)：
서열번호 26을 코딩하는 DNA 서열
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서열 36(서열번호 36)：
서열번호 27을 코딩하는 DNA 서열
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서열 37(서열번호 37)：
서열번호 28을 코딩하는 DNA 서열
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서열 38(서열번호 38)：
서열번호 29를 코딩하는 DNA 서열
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서열 39(서열번호 39)：
서열번호 30을 코딩하는 DNA 서열
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서열 40(서열번호 40)：
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서열 42(서열번호 42)：
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서열 43(서열번호 43)：
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서열 45(서열번호 45)：
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서열 46(서열번호 46)：
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서열 47(서열번호 47)：
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서열 48(서열번호 48)：
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서열 49(서열번호 49)：
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서열 50(서열번호 50)：
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서열 51(서열번호 51)：
서열번호 43을 코딩하는 DNA 서열
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서열 52(서열번호 52)：
서열번호 44를 코딩하는 DNA 서열
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서열 53(서열번호 53)：
서열번호 45를 코딩하는 DNA 서열
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서열 54(서열번호 54)：
서열번호 46을 코딩하는 DNA 서열
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서열 55(서열번호 55)：
서열번호 47을 코딩하는 DNA 서열
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서열 56(서열번호 56)：
SIPKTGQKAE
서열 57(서열번호 57)：
IGLSGHPLFNKLDDTENSHLATVNADTDNRDNV
서열 58(서열번호 58)：
ICKNTQTQR
서열 59(서열번호 59)：
FYNKAGAVGDAIPTTLYIKGAESGREPPTSS
서열 60(서열번호 60)：
SAASASTPFKPSD
본 출원은 하기 실시예를 참조하여 더 설명되며, 실시예는 본 출원을 한정하기 보다는, 본 출원을 설명하기 위한 목적으로만 사용된다.
달리 명시되지 않는 한, 본 출원에 사용된 분자생물학적 실험 방법 및 면역학적 분석들은 실질적으로 Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 및 F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995에 기재된 바와 같은 방법에 따라 수행되며; 제한 효소는 제조사가 권장하는 조건하에서 사용된다. 당업자는 실시예가 본 출원을 설명하기 위해 사용되지만, 본 출원의 보호 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해한다.
실시예 1. 돌연변이된 HPV51 L1 단백질의 발현 및 정제
발현 벡터의 구축
깁슨(Gibson) 조립 (Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318)을 HPV69 L1로부터의 특정 세그먼트 및/또는 HPV26 L1 단백질로부터의 특정 세그먼트를 포함하는 돌연변이된 HPV51 L1 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 구축하였다. 요약하면, 돌연변이를 포함하는 짧은 단편 및 돌연변이를 포함하지 않는 긴 단편을 PCR에 의해 먼저 수득하고, 깁슨 조립 시스템을 이용하여 두 단편을 라이게이션시켜서 고리를 형성하였다.
사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-HPV51N9C (N-말단에 9개의 아미노산 절단을 갖는 HPV51 L1 단백질을 코딩함, 표 2에 51L1N9로 약칭됨), 플라스미드 pTO-T7-HPV69N0C (전장 HPV69 L1 단백질을 코딩함; 표 2에 69L1N0로 약칭됨), 및 플라스미드 pTO-T7-HPV26N0C (전장 HPV26 L1 단백질을 코딩함; 표 2에 26L1N0로 약칭됨)를 포함하였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머가 표 2에 표시되며, 짧은 단편을 증폭하기 위한 PCR의 증폭 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25회 사이클 (94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장); 및 최종적으로 72℃에서 10분간 연장. 긴 단편을 증폭하기 위한 PCR의 증폭 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25회 사이클 (94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 7.5분간 연장); 및 최종적으로 72℃에서 10분간 연장. 어닐링의 온도 및 시간은 표 2에 기재되었다. 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나타내었다. 증폭 산물을 전기영동한 후, DNA 추출 키트 (BEYOTIME, Cat.No.D0033)를 사용하여 목적 단편을 회수하고, 농도를 측정하였다. 증폭에 의해 얻은 짧은 단편 및 긴 단편을 2:1의 몰비 (총 부피 3 ㎕)로 혼합하고, 이어서 3㎕의 2 X 깁슨 조립 Master Mix (NEB로부터 구입, T5 엑소뉴클레아제, Phusion DNA 폴리머라제, Taq DNA 리가아제를 포함)를 첨가하고, 50℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
조립된 생성물 (6㎕)을 사용하여 염화 칼슘 방법에 의해 준비된 40 ㎕의 적격(competent) E. coli ER2566 (New England Biolabs로부터 구입)을 형질전환시켰다. 형질전환된 E. coli를 카나마이신(25㎍/mL의 최종 농도, 이하 동일함)을 함유하는 고형 LB 배지(LB 배지의 성분: 10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 분말, 10 g/L NaCl, 이하 동일함) 상에 도말하고, 단일 콜로니가 명확하게 관찰될 때까지 37℃에서 10 내지 12시간 동안 정적 배양하였다. 단일 콜로니를 수집하여 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고, 37℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕 배양한 다음, 이어서 1 ㎖ 박테리아 용액을 취하고 -70℃에서 보관하였다. 플라스미드를 E. coli로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 목적 단편의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱하였다. 시퀀싱 결과, 구축된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 목적 단편의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 및 55이고, 그에 의해 코딩된 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47이었다(상응하는 단백질은 각각 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5로 표기되었다).
돌연변이된 단백질 H51N9-69T1은 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다. 돌연변이된 단백질 H51N9-69T2는 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다. 돌연변이된 단백질 H51N9-69T3은 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다. 돌연변이된 단백질 H51N9-69T4는 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다. 돌연변이된 단백질 H51N9-69T5는 야생형 HPV51 L1 단백질의 348-359번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 350-362번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S2는 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S3은 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S4는 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S5는 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 348-359번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 348-360번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T3-26S1은 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T3-26S2는 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T3-26S4는 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T3-26S5는 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 348-359번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 348-360번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T2-26S1은 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T2-26S3은 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T2-26S4는 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T2-26S5는 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 348-359번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 348-360번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T4-26S1은 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T4-26S2는 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T4-26S3은 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
돌연변이된 단백질 H51N9-69T4-26S5는 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기들에 의한 치환, 및 야생형 HPV51 L1 단백질의 348-359번 아미노산 잔기들의 야생형 HPV26 L1 단백질의 348-360번 아미노산 잔기들에 의한 치환에 의해 HPV51N9와 다르다.
표 2. 발현 벡터의 구축을 위한 PCR 주형 및 프라이머
주형 상류 프라이머 하류 프라이머 생성물 어닐링 온도/시간
51L1N9 G-V-H51N9-69T1-F G-V-H51N9-69T1-R H51N9-69T1 긴 단편 56℃/50s
51L1N9 G-V-H51N9-69T2-F G-V-H51N9-69T2-R H51N9-69T2 긴 단편 56℃/50s
51L1N9 G-V-H51N9-69T3-F G-V-H51N9-69T3-R H51N9-69T3 긴 단편 56℃/50s
51L1N9 G-V-H51N9-69T4-F G-V-H51N9-69T4-R H51N9-69T4 긴 단편 56℃/50s
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H51-69T2 Vector-H51-69T2-26S4-R Vector-H51-69T2-26S4-F H51-69T2-26S4 긴 단편 56℃/50s
26L1N0 Frag-H51-69T2-26S5-F Frag-H51-69T2-26S5-R H51-69T2-26S5 짧은 단편 56℃/30s
H51-69T2 Vector-H51-69T2-26S5-R Vector-H51-69T2-26S5-F H51-69T2-26S5 긴 단편 56℃/50s
26L1N0 Frag-H51-69T4-26S1-F Frag-H51-69T4-26S1-R H51-69T4-26S1 짧은 단편 56℃/30s
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H51-69T4 Vector-H51-69T4-26S2-R Vector-H51-69T4-26S2-F H51-69T4-26S2 긴 단편 56℃/50s
26L1N0 Frag-H51-69T4-26S3-F Frag-H51-69T4-26S3-R H51-69T4-26S3 짧은 단편 56℃/30s
H51-69T4 Vector-H51-69T4-26S3-R Vector-H51-69T4-26S3-F H51-69T4-26S3 긴 단편 56℃/50s
26L1N0 Frag-H51-69T4-26S5-F Frag-H51-69T4-26S5-R H51-69T4-26S5 짧은 단편 56℃/30s
H51-69T4 Vector-H51-69T4-26S5-R Vector-H51-69T4-26S5-F H51-69T4-26S5 긴 단편 56℃/50s
표 3: 사용된 프라이머의 서열 (서열번호 61-144)
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3')
61 G-V- H51N9-69T1-F GTAGGGGTGGCCCAGGGTGATCAG
62 G-V- H51N9-69T1-R GCCTTCCAGTACAGGGTGTTCAGG
63 G-V- H51N9-69T2-F CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
64 G-V- H51N9-69T2-R ACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCA
65 G-V- H51N9-69T3-F CTCGCCGATGGGGGGGGCGCAGCCGATGATGCACAGCTG
66 G-V- H51N9-69T3-R CCCTGGAGCTGGTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGCGACA
67 G-V- H51N9-69T4-F GTGCCTGGCGAAGATCTGCTCCCT
68 G-V- H51N9-69T4-R GCCACCCCCAGCGGCAGCATGATC
69 G-V- H51N9-69T5-F GGCGGTGCTGATGGTCAGGTTGGT
70 G-V- H51N9-69T5-R ACTTCAAGCAGTACATCAGGCACG
71 G- H51N9-69T1-F CTGATCACCCTGGGCCACCCCTACTTCCCGATCCCGAAATCTGGT
72 G- H51N9-69T1-R CCTGAACACCCTGTACTGGAAGGCAGAGACCTTCGGGATTTCAGC
73 G- H51N9-69T2-F TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTG
74 G- H51N9-69T2-R TGATGCACAGCTGGGTCTGCTTGTTGTCAACGCAAACGTTGTCAC
75 G- H51N9-69T3-F GGCTGCGCCCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGTGTCGGTACCGTT
76 G- H51N9-69T3-R TCACGCTGCTCACCAGCTCCAGGGGCGGGCAGTCACCACGCTGAA
77 G- H51N9-69T4-F AGGGAGCAGATCTTCGCCAGGCACTTCTTCAACAAAGCTGGTACC
78 G- H51N9-69T4-R GATCATGCTGCCGCTGGGGGTGGCAGAGTAGATGGATGTGGTCGG
79 G- H51N9-69T5-F ACCAACCTGACCATCAGCACCGCCTCTGCTCAGTCTGCTTCTGCT
80 G- H51N9-69T5-R CGTGCCTGATGTACTGCTTGAAGTCAGACGGTTTGAAGGTAGCAG
81 Frag-H51-69T1-26S2-F TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGT
82 Frag-H51-69T1-26S2-R GGGGGCGCAGCCGATGATGCACAGCTGGGTCTGTTTGTTGTCAAC
83 Vector-H51-69T1-26S2-R CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
84 Vector-H51-69T1-26S2-F CTGTGCATCATCGGCTGCGCTCCCCCCATCG
85 Frag-H51-69T1-26S3-F ATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGTGAACACTGGGGTATCGGT
86 Frag-H51-69T1-26S3-R GCCGTCCTGGATCACGCTGCTCACCAGTTCCAGCGGCGGGCA
87 Vector-H51-69T1-26S3-R GATGGGGGGGGCGCAGCCGATGAT
88 Vector-H51-69T1-26S3-F GTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGC
89 Frag-H51-69T1-26S4-F TACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGCGTCGTGAACAGATCTTCGCTCGTCAC
90 Frag-H51-69T1-26S4-R GCTGTCGCTGGTGATCATGCTGCCAGACGGGGTAGCAGAGTAGAT
91 Vector-H51-69T1-26S4-R GTGGAAGAACATGCTGTTGCCGTA
92 Vector-H51-69T1-26S4-F GGCAGCATGATCACCAGCGACAGC
93 Frag-H51-69T1-26S5-F TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTCTACCAACCTGACCATCTCTACCGCG
94 Frag-H51-69T1-26S5-R CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATTCTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
95 Vector-H51-69T1-26S5-R GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
96 Vector-H51-69T1-26S5-F GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
97 Frag-H51-69T3-26S1-F TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGTCACCCGTAC
98 Frag-H51-69T3-26S1-R CACCCTGAACACCCTGTACTGGAAAGCAGAAACTTTCGGGAT
99 Vector-H51-69T3-26S1-R GATCAGCCTGCTGCTGCCGGCGTA
100 Vector-H51-69T3-26S1-F TTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTG
101 Frag-H51-69T3-26S2-F TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGT
102 Frag-H51-69T3-26S2-R GGGGGCGCAGCCGATGATGCACAGCTGGGTCTGTTTGTTGTCAAC
103 Vector-H51-69T3-26S2-R CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
104 Vector-H51-69T3-26S2-F CTGTGCATCATCGGCTGCGCTCCCCCCATCG
105 Frag-H51-69T3-26S4-F TACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGCGTCGTGAACAGATCTTCGCTCGTCAC
106 Frag-H51-69T3-26S4-R GCTGTCGCTGGTGATCATGCTGCCAGACGGGGTAGCAGAGTAGAT
107 Vector-H51-69T3-26S4-R GTGGAAGAACATGCTGTTGCCGTA
108 Vector-H51-69T3-26S4-F GGCAGCATGATCACCAGCGACAGC
109 Frag-H51-69T3-26S5-F TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTCTACCAACCTGACCATCTCTACC
110 Frag-H51-69T3-26S5-R CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATTCTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
111 Vector-H51-69T3-26S5-R GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
112 Vector-H51-69T3-26S5-F GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
113 Frag-H51-69T2-26S1-F TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGTCACCCGTAC
114 Frag-H51-69T2-26S1-R CACCCTGAACACCCTGTACTGGAAAGCAGAAACTTTCGGGAT
115 Vector-H51-69T2-26S1-R GATCAGCCTGCTGCTGCCGGCGTA
116 Vector-H51-69T2-26S1-F TTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTG
117 Frag-H51-69T2-26S3-F ATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGTGAACACTGGGGTATCGGT
118 Frag-H51-69T2-26S3-R GCCGTCCTGGATCACGCTGCTCACCAGTTCCAGCGGCGGGCA
119 Vector-H51-69T2-26S3-R GATGGGGGGGGCGCAGCCGATGAT
120 Vector-H51-69T2-26S3-F GTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGC
121 Frag-H51-69T2-26S4-F TACGGCAACAGCATGTTCTTCCACCTGCGTCGTGAACAGATCTTCGCTCGTCAC
122 Frag-H51-69T2-26S4-R GCTGTCGCTGGTGATCATGCTGCCAGACGGGGTAGCAGAGTAGAT
123 Vector-H51-69T2-26S4-R GTGGAAGAACATGCTGTTGCCGTA
124 Vector-H51-69T2-26S4-F GGCAGCATGATCACCAGCGACAGC
125 Frag-H51-69T2-26S5-F TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTCTACCAACCTGACCATCTCTACC
126 Frag-H51-69T2-26S5-R CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATTCTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
127 Vector-H51-69T2-26S5-R GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
128 Vector-H51-69T2-26S5-F GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
129 Frag-H51-69T4-26S1-F TACGCCGGCAGCAGCAGGCTGATCACCCTGGGTCACCCGTAC
130 Frag-H51-69T4-26S1-R CACCCTGAACACCCTGTACTGGAAAGCAGAAACTTTCGGGAT
131 Vector-H51-69T4-26S1-R GATCAGCCTGCTGCTGCCGGCGTA
132 Vector-H51-69T4-26S1-F TTCCAGTACAGGGTGTTCAGGGTG
133 Frag-H51-69T4-26S2-F TGGGGCTGCGTGGGCGTGGAGGTGGGTCGTGGTCAGCCGCTGGGT
135 Frag-H51-69T4-26S2-R GGGGGCGCAGCCGATGATGCACAGCTGGGTCTGTTTGTTGTCAAC
135 Vector-H51-69T4-26S2-R CACCTCCACGCCCACGCAGCCCCA
136 Vector-H51-69T4-26S2-F CTGTGCATCATCGGCTGCGCTCCCCCCATCG
137 Frag-H51-69T4-26S3-F ATCATCGGCTGCGCCCCCCCCATCGGTGAACACTGGGGTATCGGT
138 Frag-H51-69T4-26S3-R GCCGTCCTGGATCACGCTGCTCACCAGTTCCAGCGGCGGGCA
139 Vector-H51-69T4-26S3-R GATGGGGGGGGCGCAGCCGATGAT
140 Vector-H51-69T4-26S3-F GTGAGCAGCGTGATCCAGGACGGC
141 Frag-H51-69T4-26S5-F TTCATCACCTGCGTGGACACCACCCGTTCTACCAACCTGACCATCTCTACC
142 Frag-H51-69T4-26S5-R CAGCTGGAAGATGAACTGCAGCTCGTATTCTTCACCGTGACGGATGTACTGTTTGAA
143 Vector-H51-69T4-26S5-R GGTGGTGTCCACGCAGGTGATGAACAG
144 Vector-H51-69T4-26S5-F GAGCTGCAGTTCATCTTCCAGCTG
돌연변이된 단백질의 대량 발현
각각 재조합 플라스미드 pTO-T7-H51N9-69T1, pTO-T7-H51N9-69T2, pTO-T7-H51N9-69T3, pTO-T7-H51N9-69T4, pTO-T7-H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5를 포함하는 대장균 용액을 -70℃ 냉장고로부터 꺼내고, 카나마이신을 함유한 100 mL LB 액체 배지에 접종하고, 200 rpm 및 37℃에서 약 8시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 배양물을 카나마이을 함유한 500 mL LB 배지로 옮기고 (1 ml 박테리아 용액을 옮김), 더 인큐베이션하였다. 박테리아 농도가 약 0.6의 OD600에 도달했을 때, 배양 온도를 25℃로 낮추고, 각 배양 용기(culture bottle)에 500 ㎕ IPTG를 첨가했다. 인큐베이션을 8시간 동안 더 수행했다. 인큐베이션을 완료한 후, 박테리아를 원심분리에 의해 회수하였다. 각각 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5 단백질을 발현하는 박테리아를 수득했다.
돌연변이된 단백질을 발현하는 박테리아의 파쇄(Disruption)
앞서 수득된 박테리아를 1g 박테리아 대 10 mL 용해 완충액 (20 mM Tris 완충액, pH7.2, 300 mM NaCl)의 비율로 재현탁시켰다. 박테리아를 초음파 장치를 이용하여 30분 동안 파쇄시켰다. 파쇄된 박테리아를 포함하는 용해 용액을 13500 rpm (30000 g)에서 15분 동안 원심분리시키고, 상층액(즉, 파쇄된 박테리아의 상층액)을 수득했다.
돌연변이된 단백질의 크로마토그래피 정제
장비: GE Healthcare (즉, 원조 Amershan Pharmacia Co.)에 의해 제조된 AKTA Explorer 100 분취용(preparative) 액체 크로마토그래피 시스템
크로마토그래피 매질(Chromatographic media): SP Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Co.), CHT-II (Bio-RAD로부터 구매함) 및 Butyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Co.)
하기 용리(elution) 프로토콜에서 사용된 상이한 농도의 NaCl을 포함하는 완충액은 완충액 A와 완충액 B를 특정 비율로 혼합하는 것에 의해 제조했다.
완충액: 완충액 A (20 mM 인산염 완충액, pH8.0, 20 mM DTT); 및 완충액 B (20 mM 인산염 완충액, pH8.0, 20 mM DTT, 2M NaCl).
시료: 전술된 바와 같이 수득된, 각각 H51N9-69T1 및 H51N9-69T3을 포함하는 파쇄된 박테리아의 상층액.
용리 프로토콜:
(1) SP Sepharose 4 Fast Flow에 의한 파쇄된 박테리아의 상층액의 양이온 교환 정제: 시료를 컬럼에 로딩하고, 그 후, 원치 않는 단백질을 400 mM NaCl을 함유한 완충액(80% 완충액 A + 20% 완충액 B)으로 용리시키고, 뒤이어, 800 mM NaCl을 함유한 완충액 (60% 완충액 A + 40% 완충액 B)으로 목적 단백질을 용리시키며, 800 mM NaCl을 함유한 완충액으로 용리된 분획을 수집했다;
(2) 단계 (1)에서 수득된 용리 분획의 CHTII(hydroxyapatite chromatography)에 의한 크로마토그래피 정제: NaCl 농도가 0.5 M까지 감소되도록단계 (1)에서 수득된 용리 분획을 희석하였다; 시료를 컬럼에 로딩하고, 그 후, 원치 않는 단백질을 500 mM NaCl을 함유한 완충액(75% 완충액 A + 25% 완충액 B)으로 용리시키고, 뒤이어, 1000 mM NaCl을 함유한 완충액 (50% 완충액 A + 50% 완충액 B)으로 목적 단백질을 용리시키며, 1000 mM NaCl을 함유한 완충액으로 용리된 분획을 수집했다;
(3) 단계 (3)에서 수득된 용리 분획의 HIC(hydrophobic interaction chromatography)에 의한 크로마토그래피 정제: 시료를 컬럼에 로딩하고, 그 후, 원치 않는 단백질을 1000 mM NaCl을 함유한 완충액으로 용리시키고, 뒤이어, 200 mM NaCl을 함유한 완충액 (90% 완충액 A + 10% 완충액 B)으로 목적 단백질을 용리시키며, 200 mM NaCl을 함유한 완충액으로 용리된 분획을 수집했다.
단계 (3)에서 수득된 용리 분획 150 ㎕를 30 ㎕의 6Х 로딩 완충액(Loading Buffer) (1L에 300ml의 1M TB 6.8, 600ml의 100% 글리세롤, 120g의 SDS, 6g의 브로모페놀 블루, 및 50ml의 β-머캅토에탄올을 포함함)에 첨가했다. 결과적으로 수득된 용액을 잘 혼합하고 80℃ 수조에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 결과적으로 수득된 시료의 10 ㎕를 120V에서 10% SDS-PAGE에 120분 동안 적용하고, 전기영동 밴드를 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색했다. 전기영동 결과가 도 1a, 1b, 1c, 및 1d에 도시되었다. 결과는 전술된 정제 단계 후에, H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5 단백질이 약 90%의 순도를 가졌다는 것을 보여주었다.
유사한 방법에 의해, 대장균 및 플라스미드 pTO-T7-HPV51N9C를 이용하여 HPV51N9 단백질을 제조하고 정제하고; 대장균 및 플라스미드 pTO-T7-HPV69L1N0C를 이용하여 HPV69N0 단백질을 제조하고 정제하며; 대장균 및 플라스미드 pTO-T7-HPV26L1N0C를 이용하여 HPV26N0 단백질을 제조하고 정제했다.
돌연변이된 단백질의 웨스턴 블롯 분석
전술된 방법에 의해 정제된 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5 단백질을 전기영동에 적용했다. 전기영동 후에, HPV L1 단백질에 대한 광범위 항체 4B3을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 결과가 도 2a, 2b, 2c, 및 2d에 도시되었다. 결과는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5가 광범위 항체 4B3에 의해 특이적으로 인식될 수 있었다는 것을 보여주었다.
실시예 2: HPV 바이러스-유사 입자의 조립 및 입자의 형태 검출
HPV 바이러스-유사 입자의 조립
주어진 부피(약 2ml)의 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5을 연속적으로, (1) 2L 보관 완충액(storage buffer) (20 mM 인산 나트륨 완충액 pH 6.5, 0.5 M NaCl); (2) 2L 복원 완충액(renaturation buffer) (50 mM 인산 나트륨 완충액 pH 6.0, 2 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 0.5 M NaCl); 및 (3) 20 mM 인산 나트륨 완충액 pH 7.0, 0.5 M NaCl로 투석시켰다. 투석은 3종의 완충액 각각에서 12시간 동안 수행했다.
유사한 방법에 의해, HPV51N9, HPV69N0 및 HPV26N0 단백질을 각각 HPV51N9 VLP, HPV69N0 VLP 및 HPV26N0 VLP로 조립시켰다.
분자 시브 크로마토그래피 분석
투석된 시료를 1120 Compact LC High Performance Liquid Chromatographic System (Agilent Technologies)에 의한 분자 시브 크로마토그래피 분석에 적용했고, 사용된 분석 컬럼은 TSK Gel PW5000Хl 7.8Х300 mm이었다. HPV26N0 VLP의 분석 결과가 도 9에 도시되고, 다른 시료들의 분석 결과가 도 3 및 4에 도시되었다. 결과는 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T1-26S4, H51N9-69T1-26S5, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5를 포함하는 시료의 제1 단백질 피크가 약 13-14분에서 나타나고, 이는 HPV51N9 VLP의 것에 유사했다는 것을 보여주었다. 이는 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S4 및 H51N9-69T1-26S5를 제외하고, 나머지 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1, H51N9-69T2, H51N9-69T3, H51N9-69T4, H51N9-69T5, H51N9-69T1-26S2, H51N9-69T1-26S3, H51N9-69T2-26S1, H51N9-69T2-26S3, H51N9-69T2-26S4, H51N9-69T2-26S5, H51N9-69T3-26S1, H51N9-69T3-26S2, H51N9-69T3-26S4, H51N9-69T3-26S5, H51N9-69T4-26S1, H51N9-69T4-26S2, H51N9-69T4-26S3 및 H51N9-69T4-26S5는 모두 균일한 크기를 갖는 VLP로 조립될 수 있었다는 것을 보여주었다. 돌연변이된 단백질 H51N9-69T1-26S4 또는 H51N9-69T1-26S5에 의해 형성된 VLP는 균일하지 않은 크기를 가졌다.
침강 속도 분석
침강 속도 분석을 위한 장치는 광학 검사 시스템 및 An-50Ti와 An-60Ti 로터를 구비한, Beckman XL-A Analytical Ultracentrifuge였다. HPV51N9 VLP, HPV69N0 VLP, H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, H51N9-69T4 VLP, H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5VLP, H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP, H51N9-69T3-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP의 침강 계수는 침강 속도 방법에 의해 분석했다. HPV26N0 VLP의 분석 결과가 도 9에 도시되었고, 다른 시료들의 분석 결과는 도 5 및 6에 도시되었다. 결과는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, H51N9-69T4 VLP, H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5VLP, H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP, H51N9-69T3-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP의 침강 계수는 각각 148S, 135S, 117S, 131S, 148S, 130S, 131S, 130S, 135S, 140S, 135S, 144S, 133S, 131S, 161S, 140S, 137S, 132S, 126S 및 48S였고, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S5 VLP는 불량한 균일성을 가졌고, 2개의 상이한 크기를 가졌다는 것을 보여주었다.
바이러스-유사 입자의 형태학적 테스트
VLP를 포함하는 100 ㎕ 시료를 전사 전자 현미경(TEM)으로 관찰했다. 사용된 장치는 JEOL Ltd.에 의해 공급된 100kV 전사 전자 현미경이었다(100,000Х 확대). 요약하면, 13.5 ㎕의 시료를 2% 인텅스텐산(phosphotungstic acid) (pH 7.0)으로 염색하고, 탄소-코팅 구리 그리드 상에 고정하고, TEM으로 관찰했다. HPV26N0 VLP의 TEM 사진이 도 9에 표시되고, 다른 시료들의 TEM 사진이 도 7 및 8에 표시되었다. 결과는, H51N9-69T1-26S4 VLP를 제외하고, 나머지 VLP, H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, H51N9-69T4 VLP, H51N9-69T5 VLP, H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S5VLP, H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP, H51N9-69T3-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP는 HPV51N9 VLP와 유사했고, 약 25 nm의 반경을 가졌다는 것을 보여주었다.
실시예 3: 바이러스-유사 입자에 의해 백신 접종된 마우스의 혈청 중 중화항체의 평가 1
본 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, H51N9-69T4 VLP 및 H51N9-69T5 VLP이었다.
본 실험에서, 백신 접종 일정은 표 4에 표시되었다. 전체 마우스(6-주령 BalB/c 암컷 마우스)를 2개의 그룹으로 나누었다: 알루미늄 아쥬반트 그룹 1 (5 ㎍의 면역화 용량, 알루미늄 아쥬반트 이용), 알루미늄 아쥬반트 그룹 2 (1 ㎍의 면역화 용량, 알루미늄 아쥬반트 이용). 각 그룹을 8개의 서브그룹(subgroup)으로 더 나누었다. 대조군 서브그룹 1 및 2는 각각 HPV51N9 VLP 단독 및 HPV69N0 VLP 단독으로 백신접종시키고, 대조군 서브그룹 3은 혼합된 HPV51/HPV69 VLP (즉, 각 VLP에 대한 주어진 면역화 용량의 HPV51N9 VLP와 HPV69N0 VLP의 혼합물)로 백신접종시켰다. 실험 서브그룹 1, 2, 3, 4 및 5는 각각 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, H51N9-69T4 VLP 및 H51N9-69T5 VLP로 백신접종시켰다.
알루미늄 아쥬반트 그룹 1-2에서, 5 마리 마우스/서브그룹을 복막내 주사에 의해 각각 면역화 용량 5 ㎍ 및 1 ㎍, 및 1 mL의 주사 용량으로 백신접종시켰다. 전체 마우스에 0주차에 1차 백신 접종을 적용하고, 각각 2주차 및 4주차에 부스터 백신 접종(booster vaccination)을 적용했다. 8주차에, 안와 채혈(orbital bleeding)을 통해 혈액 시료를 채취하고, 혈청 중 HPV51 및 HPV69에 대한 항체의 역가를 분석했다. 분석 결과가 도 10a 및 10b에 도시되었다. 결과는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP가 각각 마우스에서 HPV51에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV69N0 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP 및 H51N9-69T4 VLP 각각은 또한, 마우스에서 HPV69에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다.
이는 H51N9-69T1 VLP, H51N9-69T2 VLP, H51N9-69T3 VLP, 및 H51N9-69T4 VLP 가 HPV51 및 HPV69에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 갖는다는 것을 보여주었다.
표 4. 백신접종 일정
그룹 백신 접종용 항원 아쥬반트 면역화 용량 개체 수 백신 접종 절차(주)
알루미늄 아쥬반트 그룹 1 HPV51N9 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
HPV69N0 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
HPV51/HPV69 VLP 알루미늄 아쥬반트 각 VLP 당
5㎍ 		5 0, 2, 4
H51N9-69T1 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T3 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T5 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
알루미늄 아쥬반트 그룹 2 HPV51N9 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
HPV69N0 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
HPV51/HPV69 VLP 알루미늄 아쥬반트 각 VLP 당
1㎍ 		5 0, 2, 4
H51N9-69T1 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T3 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T5 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
실시예 4: 바이러스-유사 입자에 의해 백신 접종된 마우스의 혈청 중 중화항체의 평가 2
본 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP 및 H51N9-69T3-26S5 VLP이었다.
본 실험에서, 백신 접종 일정은 표 5에 표시되었다. 전체 마우스(6-주령 BalB/c 암컷 마우스)를 2개의 그룹으로 나누었다: 알루미늄 아쥬반트 그룹 1 (5 ㎍의 면역화 용량, 알루미늄 아쥬반트 이용), 알루미늄 아쥬반트 그룹 2 (1 ㎍의 면역화 용량, 알루미늄 아쥬반트 이용). 각 그룹을 12개의 서브그룹으로 더 나누었다. 대조군 서브그룹 1, 2 및 3은 각각 HPV51N9 VLP 단독, HPV69N0 VLP 단독, 및 HPV26N0 VLP 단독으로 백신접종시키고, 대조군 서브그룹 4는 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP (즉, 각 VLP에 대한 주어진 면역화 용량의 HPV51N9 VLP, HPV69N0 VLP 및 HPV26N0 VLP의 혼합물)로 백신접종시켰다. 실험 서브그룹 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8은 각각 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T1-26S3 VLP, H51N9-69T1-26S4 VLP, H51N9-69T1-26S5VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP, H51N9-69T3-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S4 VLP 및 H51N9-69T3-26S5 VLP로 백신접종시켰다.
알루미늄 아쥬반트 그룹 1-2에서, 5 마리 마우스/서브그룹을 복막내 주사에 의해 각각 면역화 용량 5 ㎍ 및 1 ㎍, 및 1 mL의 주사 용량으로 백신접종시켰다. 전체 마우스에 0주차에 1차 백신 접종을 적용하고, 각각 2주차 및 4주차에 부스터 백신 접종을 적용했다. 8주차에, 안와 채혈을 통해 혈액 시료를 채취하고, 혈청 중 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 항체의 역가를 분석했다. 분석 결과가 도 11a 및 11b에 도시되었다. 결과는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP가 각각 마우스에서 HPV51에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 HPV26N0 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP 각각은 또한, 마우스에서 HPV69에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다. H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP 각각은 또한, 마우스에서 HPV26에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV26N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다. 이는 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T3-26S2 VLP가 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 갖는다는 것을 보여주었다.
표 5. 백신 접종 일정
Figure pct00001
실시예 5: 바이러스-유사 입자에 의해 백신 접종된 마우스의 혈청 중 중화 항체 역가의 평가 3
본 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자들은 H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP이었다.
본 실험에서, 백신 접종 일정은 표 6에 표시되었다. 전체 마우스(6-주령 BalB/c 암컷 마우스)를 2개의 그룹으로 나누었다: 알루미늄 아쥬반트 그룹 1 (5 ㎍의 면역화 용량, 알루미늄 아쥬반트 이용), 알루미늄 아쥬반트 그룹 2 (1 ㎍의 면역화 용량, 알루미늄 아쥬반트 이용). 각 그룹을 12개의 서브그룹으로 더 나누었다. 대조군 서브그룹 1, 2 및 3은 각각 HPV51N9 VLP 단독, HPV69N0 VLP 단독, 및 HPV26N0 VLP 단독으로 백신접종시키고, 대조군 서브그룹 4는 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP (즉, 각 VLP에 대한 주어진 면역화 용량의 HPV51N9 VLP, HPV69N0 VLP 및 HPV26N0 VLP의 혼합물)로 백신접종시켰다. 실험 서브그룹 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8은 각각 H51N9-69T2-26S1 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T2-26S4 VLP, H51N9-69T2-26S5 VLP, H51N9-69T4-26S1 VLP, H51N9-69T4-26S2 VLP, H51N9-69T4-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S5 VLP로 백신접종시켰다.
알루미늄 아쥬반트 그룹 1-2에서, 5 마리 마우스/서브그룹을 복막내 주사에 의해 각각 면역화 용량 5 ㎍ 및 1 ㎍, 및 1 mL의 주사 용량으로 백신접종시켰다. 전체 마우스에 0주차에 1차 백신 접종을 적용하고, 각각 2주차 및 4주차에 부스터 백신 접종을 적용했다. 8주차에, 안와 채혈을 통해 혈액 시료를 채취하고, 혈청 중 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 항체의 역가를 분석했다. 분석 결과가 도 12a 및 12b에 도시되었다. 결과는 H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP가 각각 마우스에서 HPV51에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 HPV26N0 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다는 것을 보여주었다. H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP 각각은 또한, 마우스에서 HPV69에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV69N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다. H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP 각각은 또한, 마우스에서 HPV26에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었고, 그들의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV26N0 VLP 단독의 효과 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 효과와 유사했고, 동일한 용량에서 HPV51N9 VLP 단독의 효과에 비해 유의성 있게 더 높았다. 이는 H51N9-69T2-26S3 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP가 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 갖는다는 것을 보여주었다.
표 6. 백신 접종 일정
그룹 백신 접종용 항원 아쥬반트 면역화 용량 개체 수 백신화 절차(주)
알루미늄 아쥬반트 그룹 1 HPV51N9 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
HPV69N0 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
HPV26N0 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
HPV51/HPV69/HPV26 VLP 알루미늄 아쥬반트 각 VLP당 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-6S1 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-6S3 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-6S4 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-6S5 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S1 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S2 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S4 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S5 VLP 알루미늄 아쥬반트 5㎍ 5 0, 2, 4
알루미늄 아쥬반트 그룹 2 HPV51N9 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
HPV69N0 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
HPV26N0 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
HPV51/HPV69/HPV26 VLP 알루미늄 아쥬반트 각 VLP당 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-26S1 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-26S3 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-26S4 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T2-26S5 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S1 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S2 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S3 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
H51N9-69T4-26S5 VLP 알루미늄 아쥬반트 1㎍ 5 0, 2, 4
실시예 6: 혈청 전환(seroconversion) 유도에 대한 바이러스-유사 입자의 ED 50 평가
본 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자들은 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP이었다.
6-주령 BalB/c 암컷 마우스(8 마리)를 단일 복막내 주사에 의해 알루미늄 아쥬반트와 함께 백신접종시켰고, 이 때, H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 또는 H51N9-69T4-26S2 VLP (0.900㎍, 0.300㎍, 0.100㎍, 0.033㎍ 및 0.011㎍의 면역화 용량)을 실험군에서 사용했고, HPV51N9 VLP 단독, HPV69N0 VLP 단독, HPV26N0 VLP 단독 (0.900㎍, 0.300㎍, 0.100㎍, 0.033㎍ 및 0.011㎍의 면역화 용량), 또는 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP (즉, HPV51N9 VLP, HPV69N0 VLP 및 HPV26N10 VLP의 혼합물, 각 VLP에 대한 면역화 용량 0.900㎍, 0.300㎍, 0.100㎍, 0.033㎍ 및 0.011㎍)를 사용했고; 면역화 부피는 1 mL였다. 또한, 백신을 희석하기 위해 사용된 희석제를 블랭크 대조군(blank control)로 사용하였다. 각 그룹당 8마리의 마우스를 백신접종시켰고, 백신접종 후 5주차에, 정맥혈을 안구로부터 수집했다. 혈청 중 HPV에 대한 항체를 검출하고, Reed-Muench 방법 (Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)에 의해, 각 시료에 대해 혈청 전환을 유도하기 위한(즉, 마우스에서 항체의 생성을 유도하기 위한) ED50을 계산하였다. 결과가 표 7에 표시되었다.
표 7. 마우스에서 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 항체의 생성(혈청 전환)을 유도하기 위한 H51N9-69T1-26S2 VLP, H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP의 ED50
HPV VLP (㎍) HPV51PsV에 대한 ED50 (㎍) HPV69PsV에 대한 ED50 (㎍) HPV26PsV에 대한 ED50 (㎍)
HPV51N9 0.058 ＞0.9 ＞0.9
HPV69N0 ＞0.9 0.029 0.019
HPV26N0 ＞0.9 0.008 0.057
HPV51N9-69T1-26S2 ＞0.9 0.178 ＞0.9
HPV51N9-69T3-26S1 0.066 0.048 0.176
HPV51N9-69T2-26S3 0.170 0.180 0.120
HPV51N9-69T4-26S2 0.010 0.007 0.058
HPV51/69/26 0.066 0.010 0.007
결과는 마우스의 백신 접종 후 5주차에, 마우스에서 HPV51에 대한 항체의 생성을 유도하기 위한 H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP의 ED50이 HPV51N9 VLP 단독의 경우 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 경우와 유사했고, HPV69N0 VLP 단독 및 HPV26N0 VLP 단독의 경우에 의해 훨씬 더 탁월했고; HPV69에 대한 항체의 생성을 유도하기 위한 ED50은 HPV69N0 VLP 단독의 경우 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 경우와 유사했고, HPV51N9 VLP 단독의 경우에 비해 훨씬 더 탁월했고; HPV26에 대한 항체의 생성을 유도하기 위한 ED50은 HPV26N0 VLP 단독의 경우 및 혼합된 HPV51/HPV69/HPV26 VLP의 경우와 유사했고, HPV51N9 VLP 단독의 경우에 비해 훨씬 더 탁월했다는 것을 보여주었다. 이는 H51N9-69T2-26S3 VLP, H51N9-69T3-26S1 VLP 및 H51N9-69T4-26S2 VLP가 HPV51, HPV69 및 HPV26에 대한 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 갖는다는 것을 보여주었다.
본 출원의 구체적인 실시예를 상세히 기재하였지만, 당업자는 본 명세서에 개시된 교시에 따라 그에 대한 다양한 수정 및 변경이 가능하며, 이러한 수정 및 변경은 본 출원의 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 본 출원의 범위는 첨부된 특허청구의 범위 및 그의 균등물에 의해 주어진다.
SEQUENCE LISTING <110> Xiamen University Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. <120> Mutant of L1 protein of Human Papillomavirus Type 51 <130> IEC180094PCT <150> CN201811122822.1 <151> 2018-09-26 <160> 144 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 504 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 51 <400> 1 Met Ala Leu Trp Arg Thr Asn Asp Ser Lys Val Tyr Leu Pro Pro Ala 1 5 10 15 Pro Val Ser Arg Ile Val Asn Thr Glu Glu Tyr Ile Thr Arg Thr Gly 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Ile Thr Leu Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Pro Leu Pro Lys Thr Ser Thr Arg Ala Ala Ile Pro Lys Val 50 55 60 Ser Ala Phe Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn 65 70 75 80 Lys Phe Gly Leu Pro Asp Pro Asn Leu Tyr Asn Pro Asp Thr Asp Arg 85 90 95 Leu Val Trp Gly Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu 100 105 110 Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Phe Asn Lys Tyr Asp Asp Thr 115 120 125 Glu Asn Ser Arg Ile Ala Asn Gly Asn Ala Gln Gln Asp Val Arg Asp 130 135 140 Asn Thr Ser Val Asp Asn Lys 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Phe Phe Asn Lys Ala Gly Thr Ile Gly Asp Pro Val 260 265 270 Pro Val Ser Met Tyr Ile Lys Gly Ala Gly Gln Gly Arg Glu Pro Pro 275 280 285 Thr Thr Ser Ile Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser 290 295 300 Asp Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly 305 310 315 320 His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Cys Val 325 330 335 Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu Thr Ile Ser Thr Val Ser Ala Gln 340 345 350 Ser Ala Ser Ala Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Lys Gln Phe Ile Arg 355 360 365 His Gly Glu Glu Tyr Glu Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile 370 375 380 Thr Leu Thr Thr Asp Val Met Ala Tyr Ile His Thr Met Asn Ser Thr 385 390 395 400 Ile Leu Glu Asn Trp Asn Phe Gly Leu Thr Leu Pro Pro Thr Ala Ser 405 410 415 Leu Glu Asp Ala Tyr Arg Phe Ile Lys Asn Ser Ala Thr Thr Cys Gln 420 425 430 Arg Asp Ala Pro Ala Gln Pro Lys Glu Asp Pro Phe Ser Lys Leu Lys 435 440 445 Phe Trp Asp Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ile Asp Leu Asp Gln 450 455 460 Phe Pro Leu Gly Arg 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ggacgcctac aggttcgtga ggaacgccgc caccagctgc 1260 cagaaggaca ccccccccca ggccaagccc gaccccctgg ccaagtacaa gttctgggac 1320 gtggacctga aggagaggtt cagcctggac ctggaccagt tcgccctggg caggaagttc 1380 ctgctgcagg tgggcgtgca gaggaagccc aggcccggcc tgaagaggcc cgctagcagc 1440 gccagctcca gcagctccag cagcgccaag aggaagaggg tgaagaagta a 1491 <210> 13 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The DNA sequence encoding H51N9-69T2 <400> 13 atgaaggtgt acctgccccc cgcccccgtg agcaggatcg tgaacaccga ggagtacatc 60 accaggaccg gcatctacta ctacgccggc agcagcaggc tgatcaccct gggccacccc 120 tacttccccc tgcccaagac cagcaccagg gccgccatcc ccaaggtgag cgccttccag 180 tacagggtgt tcagggtgca gctccccgac cccaacaagt tcggcctgcc cgaccccaac 240 ctgtacaacc ccgacaccga caggctggtg tggggctgcg tgggcgtgga ggtgggtcgt 300 ggtcagccgc tgggtgtcgg tctgtctggt cacccgctgt tcaacaaact ggacgacacc 360 gaaaactctc acctggctac cgctaacgct gacaccgaca accgtgacaa cgtttgcgtt 420 gacaacaagc agacccagct gtgcatcatc ggctgcgccc cccccatcgg cgagcactgg 480 ggcatcggca ccacctgcaa gaacaccccc gtgccccccg gcgactgccc ccccctggag 540 ctggtgagca gcgtgatcca ggacggcgac atgatcgaca ccggcttcgg cgccatggac 600 ttcgccgccc tgcaggccac caagagcgac gtgcccctgg acatcagcca gagcgtgtgc 660 aagtaccccg actacctgaa gatgagcgcc gacacctacg gcaacagcat gttcttccac 720 ctgaggaggg agcagatctt cgccaggcac tactacaaca agctgggcag cgtgggcgag 780 gacatcccca ccgactacta catcaagggc agcggcaacg gcagggaccc catcgagagc 840 tacatctaca gcgccacccc cagcggcagc atgatcacca gcgacagcca gatcttcaac 900 aagccctact ggctgcacag ggcccagggc cacaacaacg gcatctgctg gaacaaccag 960 ctgttcatca cctgcgtgga caccaccagg agcaccaacc tgaccatcag caccgccacc 1020 gccgccgtga gccccacctt cacccccagc aacttcaagc agtacatcag gcacggcgag 1080 gagtacgagc tgcagttcat cttccagctg tgcaagatca ccctgaccac cgaggtgatg 1140 gcctacctgc acaccatgga ccccaccatc ctggagcagt ggaacttcgg cctgaccctg 1200 ccccccagcg ccagcctgga ggacgcctac aggttcgtga ggaacgccgc caccagctgc 1260 cagaaggaca ccccccccca ggccaagccc gaccccctgg ccaagtacaa gttctgggac 1320 gtggacctga aggagaggtt cagcctggac ctggaccagt tcgccctggg caggaagttc 1380 ctgctgcagg tgggcgtgca gaggaagccc aggcccggcc tgaagaggcc cgctagcagc 1440 gccagctcca gcagctccag cagcgccaag aggaagaggg tgaagaagta a 1491 <210> 14 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The DNA sequence encoding H51N9-69T3 <400> 14 atgaaggtgt acctgccccc cgcccccgtg agcaggatcg tgaacaccga ggagtacatc 60 accaggaccg gcatctacta ctacgccggc agcagcaggc tgatcaccct gggccacccc 120 tacttccccc tgcccaagac cagcaccagg gccgccatcc ccaaggtgag cgccttccag 180 tacagggtgt tcagggtgca gctccccgac cccaacaagt tcggcctgcc cgaccccaac 240 ctgtacaacc ccgacaccga caggctggtg tggggctgcg tgggcgtgga ggtgggcagg 300 ggccagcccc tgggcgtggg cctgagcggc caccccctgt tcaacaagta cgacgacacc 360 gagaacagca ggatcgccaa cggcaacgcc cagcaggacg tgagggacaa caccagcgtg 420 gacaacaagc agacccagct gtgcatcatc ggctgcgccc cccccatcgg cgagcactgg 480 ggtgtcggta ccgtttgcaa aaacgctcag tctcaggttc agcgtggtga ctgcccgccg 540 ctggagctgg tgagcagcgt gatccaggac ggcgacatga tcgacaccgg cttcggcgcc 600 atggacttcg ccgccctgca ggccaccaag agcgacgtgc ccctggacat cagccagagc 660 gtgtgcaagt accccgacta cctgaagatg agcgccgaca cctacggcaa cagcatgttc 720 ttccacctga ggagggagca gatcttcgcc aggcactact acaacaagct gggcagcgtg 780 ggcgaggaca tccccaccga ctactacatc aagggcagcg gcaacggcag ggaccccatc 840 gagagctaca tctacagcgc cacccccagc ggcagcatga tcaccagcga cagccagatc 900 ttcaacaagc cctactggct gcacagggcc cagggccaca acaacggcat ctgctggaac 960 aaccagctgt tcatcacctg cgtggacacc accaggagca ccaacctgac catcagcacc 1020 gccaccgccg ccgtgagccc caccttcacc cccagcaact tcaagcagta catcaggcac 1080 ggcgaggagt acgagctgca gttcatcttc cagctgtgca agatcaccct gaccaccgag 1140 gtgatggcct acctgcacac catggacccc accatcctgg agcagtggaa cttcggcctg 1200 accctgcccc ccagcgccag cctggaggac gcctacaggt tcgtgaggaa cgccgccacc 1260 agctgccaga aggacacccc cccccaggcc aagcccgacc ccctggccaa gtacaagttc 1320 tgggacgtgg acctgaagga gaggttcagc ctggacctgg accagttcgc cctgggcagg 1380 aagttcctgc tgcaggtggg cgtgcagagg aagcccaggc ccggcctgaa gaggcccgct 1440 agcagcgcca gctccagcag ctccagcagc gccaagagga agagggtgaa gaagtaa 1497 <210> 15 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The DNA sequence encoding H51N9-69T4 <400> 15 atgaaggtgt acctgccccc cgcccccgtg agcaggatcg tgaacaccga ggagtacatc 60 accaggaccg gcatctacta ctacgccggc agcagcaggc tgatcaccct gggccacccc 120 tacttccccc tgcccaagac cagcaccagg gccgccatcc ccaaggtgag cgccttccag 180 tacagggtgt tcagggtgca gctccccgac cccaacaagt tcggcctgcc cgaccccaac 240 ctgtacaacc ccgacaccga caggctggtg tggggctgcg tgggcgtgga ggtgggcagg 300 ggccagcccc tgggcgtggg cctgagcggc caccccctgt tcaacaagta cgacgacacc 360 gagaacagca ggatcgccaa cggcaacgcc cagcaggacg tgagggacaa caccagcgtg 420 gacaacaagc agacccagct gtgcatcatc ggctgcgccc cccccatcgg cgagcactgg 480 ggcatcggca ccacctgcaa gaacaccccc gtgccccccg gcgactgccc ccccctggag 540 ctggtgagca gcgtgatcca ggacggcgac atgatcgaca ccggcttcgg cgccatggac 600 ttcgccgccc tgcaggccac caagagcgac gtgcccctgg acatcagcca gagcgtgtgc 660 aagtaccccg actacctgaa gatgagcgcc gacacctacg 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<223> The DNA sequence encoding H51N9-69T5 <400> 16 atgaaggtgt acctgccccc cgcccccgtg agcaggatcg tgaacaccga ggagtacatc 60 accaggaccg gcatctacta ctacgccggc agcagcaggc tgatcaccct gggccacccc 120 tacttccccc tgcccaagac cagcaccagg gccgccatcc ccaaggtgag cgccttccag 180 tacagggtgt tcagggtgca gctccccgac cccaacaagt tcggcctgcc cgaccccaac 240 ctgtacaacc ccgacaccga caggctggtg tggggctgcg tgggcgtgga ggtgggcagg 300 ggccagcccc tgggcgtggg cctgagcggc caccccctgt tcaacaagta cgacgacacc 360 gagaacagca ggatcgccaa cggcaacgcc cagcaggacg tgagggacaa caccagcgtg 420 gacaacaagc agacccagct gtgcatcatc ggctgcgccc cccccatcgg cgagcactgg 480 ggcatcggca ccacctgcaa gaacaccccc gtgccccccg gcgactgccc ccccctggag 540 ctggtgagca gcgtgatcca ggacggcgac atgatcgaca ccggcttcgg cgccatggac 600 ttcgccgccc tgcaggccac caagagcgac gtgcccctgg acatcagcca gagcgtgtgc 660 aagtaccccg actacctgaa gatgagcgcc gacacctacg gcaacagcat gttcttccac 720 ctgaggaggg agcagatctt cgccaggcac tactacaaca agctgggcag cgtgggcgag 780 gacatcccca ccgactacta catcaagggc 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cagcggcagc atgatcacca gcgacagcca gatcttcaac 900 aagccctact ggctgcacag ggcccagggc cacaacaacg gcatctgctg gaacaaccag 960 ctgttcatca cctgcgtgga caccaccagg agcaccaacc tgaccatcag caccgcctct 1020 gctgcttctg cttctacccc gttcaaaccg tctgacttca agcagtacat caggcacggc 1080 gaggagtacg agctgcagtt catcttccag ctgtgcaaga tcaccctgac caccgaggtg 1140 atggcctacc tgcacaccat ggaccccacc atcctggagc agtggaactt cggcctgacc 1200 ctgcccccca gcgccagcct ggaggacgcc tacaggttcg tgaggaacgc cgccaccagc 1260 tgccagaagg acaccccccc ccaggccaag cccgaccccc tggccaagta caagttctgg 1320 gacgtggacc tgaaggagag gttcagcctg gacctggacc agttcgccct gggcaggaag 1380 ttcctgctgc aggtgggcgt gcagaggaag cccaggcccg gcctgaagag gcccgctagc 1440 agcgccagct ccagcagctc cagcagcgcc aagaggaaga gggtgaagaa gtaa 1494 <210> 52 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The DNA sequence encoding H51N9-69T4-26S1 <400> 52 atgaaggtgt acctgccccc cgcccccgtg agcaggatcg tgaacaccga ggagtacatc 60 accaggaccg gcatctacta ctacgccggc agcagcaggc tgatcaccct 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tgggcgtggg cctgagcggc caccccctgt tcaacaagta cgacgacacc 360 gagaacagca ggatcgccaa cggcaacgcc cagcaggacg tgagggacaa caccagcgtg 420 gacaacaagc agacccagct gtgcatcatc ggctgcgccc cccccatcgg cgagcactgg 480 ggtatcggta ccatctgcaa aaacacccag acccagcgtg gtgactgccc gccgctggag 540 ctggtgagca gcgtgatcca ggacggcgac atgatcgaca ccggcttcgg cgccatggac 600 ttcgccgccc tgcaggccac caagagcgac gtgcccctgg acatcagcca gagcgtgtgc 660 aagtaccccg actacctgaa gatgagcgcc gacacctacg gcaacagcat gttcttccac 720 ctgaggaggg agcagatctt cgccaggcac ttcttcaaca aagctggtac catcggtgac 780 cctgttccgg tttctatgta catcaaaggt gctggtcagg gtcgtgaacc gccgaccaca 840 tccatctact ctgccacccc cagcggcagc atgatcacca gcgacagcca gatcttcaac 900 aagccctact ggctgcacag ggcccagggc cacaacaacg gcatctgctg gaacaaccag 960 ctgttcatca cctgcgtgga caccaccagg agcaccaacc tgaccatcag caccgccacc 1020 gccgccgtga gccccacctt cacccccagc aacttcaagc agtacatcag gcacggcgag 1080 gagtacgagc tgcagttcat cttccagctg tgcaagatca ccctgaccac cgaggtgatg 1140 gcctacctgc acaccatgga 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 100 ttccagtaca gggtgttcag ggtg 24 <210> 101 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 101 tggggctgcg tgggcgtgga ggtgggtcgt ggtcagccgc tgggt 45 <210> 102 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 102 gggggcgcag ccgatgatgc acagctgggt ctgtttgttg tcaac 45 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 103 cacctccacg cccacgcagc ccca 24 <210> 104 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 104 ctgtgcatca tcggctgcgc tccccccatc g 31 <210> 105 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 105 tacggcaaca gcatgttctt ccacctgcgt cgtgaacaga tcttcgctcg tcac 54 <210> 106 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 106 gctgtcgctg gtgatcatgc tgccagacgg ggtagcagag tagat 45 <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 107 gtggaagaac atgctgttgc cgta 24 <210> 108 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 108 ggcagcatga tcaccagcga cagc 24 <210> 109 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 109 ttcatcacct gcgtggacac cacccgttct accaacctga ccatctctac c 51 <210> 110 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 110 cagctggaag atgaactgca gctcgtattc ttcaccgtga cggatgtact gtttgaa 57 <210> 111 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 111 ggtggtgtcc acgcaggtga tgaacag 27 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 112 gagctgcagt tcatcttcca gctg 24 <210> 113 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 113 tacgccggca gcagcaggct gatcaccctg ggtcacccgt ac 42 <210> 114 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 114 caccctgaac accctgtact ggaaagcaga aactttcggg at 42 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 115 gatcagcctg ctgctgccgg cgta 24 <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 116 ttccagtaca gggtgttcag ggtg 24 <210> 117 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 117 atcatcggct gcgccccccc catcggtgaa cactggggta tcggt 45 <210> 118 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 118 gccgtcctgg atcacgctgc tcaccagttc cagcggcggg ca 42 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 119 gatggggggg gcgcagccga tgat 24 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 120 gtgagcagcg tgatccagga cggc 24 <210> 121 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 121 tacggcaaca gcatgttctt ccacctgcgt cgtgaacaga tcttcgctcg tcac 54 <210> 122 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 122 gctgtcgctg gtgatcatgc tgccagacgg ggtagcagag tagat 45 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 123 gtggaagaac atgctgttgc cgta 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 124 ggcagcatga tcaccagcga cagc 24 <210> 125 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 125 ttcatcacct gcgtggacac cacccgttct accaacctga ccatctctac c 51 <210> 126 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 126 cagctggaag atgaactgca gctcgtattc ttcaccgtga cggatgtact gtttgaa 57 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 127 ggtggtgtcc acgcaggtga tgaacag 27 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 128 gagctgcagt tcatcttcca gctg 24 <210> 129 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 129 tacgccggca gcagcaggct gatcaccctg ggtcacccgt ac 42 <210> 130 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 130 caccctgaac accctgtact ggaaagcaga aactttcggg at 42 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 131 gatcagcctg ctgctgccgg cgta 24 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 132 ttccagtaca gggtgttcag ggtg 24 <210> 133 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 133 tggggctgcg tgggcgtgga ggtgggtcgt ggtcagccgc tgggt 45 <210> 134 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 134 gggggcgcag ccgatgatgc acagctgggt ctgtttgttg tcaac 45 <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 135 cacctccacg cccacgcagc ccca 24 <210> 136 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 136 ctgtgcatca tcggctgcgc tccccccatc g 31 <210> 137 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 137 atcatcggct gcgccccccc catcggtgaa cactggggta tcggt 45 <210> 138 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 138 gccgtcctgg atcacgctgc tcaccagttc cagcggcggg ca 42 <210> 139 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 139 gatggggggg gcgcagccga tgat 24 <210> 140 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 140 gtgagcagcg tgatccagga cggc 24 <210> 141 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 141 ttcatcacct gcgtggacac cacccgttct accaacctga ccatctctac c 51 <210> 142 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 142 cagctggaag atgaactgca gctcgtattc ttcaccgtga cggatgtact gtttgaa 57 <210> 143 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 143 ggtggtgtcc acgcaggtga tgaacag 27 <210> 144 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 144 gagctgcagt tcatcttcca gctg 24

Claims (12)

  1. 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체로서, 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은:
    (1) 야생형 HPV51 L1 단백질의 N-말단에서, 0 내지 15개의 아미노산, 예를 들면, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 절단(truncation); 및
    하기 (2)(a), (2)(b), (2)(c) 또는 (2)(d)에 정의된 돌연변이:
    (2)(a) 야생형 HPV51 L1 단백질의 52-60번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
    (2)(b) 야생형 HPV51 L1 단백질의 125-147번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
    (2)(c) 야생형 HPV51 L1 단백질의 170-181번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
    (2)(d) 야생형 HPV51 L1 단백질의 259-289번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;을 갖고, 및
    상기 변이체는 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질과 1개 이상 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개)의 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실에 의해서만 다르고, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질의 기능, 즉, 2종 이상의 HPV(예를 들면, HPV51 및 HPV69)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 보유하고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(a)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(b)에 정의된 돌연변이를 더 갖고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(b)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(c)에 정의된 돌연변이를 더 갖고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(c)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(a) 또는 (3)(b)에 정의된 돌연변이를 더 갖고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 (1) 및 (2)(d)에 정의된 돌연변이를 갖고, 선택적으로, (3)(b)에 정의된 돌연변이를 더 갖고;
    상기 (3)(a), (3)(b) 또는 (3)(c)에 정의된 돌연변이는:
    (3)(a) 야생형 HPV51 L1 단백질의 51-60번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
    (3)(b) 야생형 HPV51 L1 단백질의 114-146번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;
    (3)(c) 야생형 HPV51 L1 단백질의 173-181번 위치에 있는 아미노산 잔기의 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기에 의한 치환;이고,
    바람직하게는, 상기 제2 타입의 야생형 HPV는 HPV69이며; 바람직하게는, (2)(a)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 52-60번 아미노산 잔기이고; 바람직하게는, (2)(b)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 125-147번 아미노산 잔기이며; 바람직하게는, (2)(c)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 170-183번 아미노산 잔기이고; 바람직하게는, (2)(d)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV69 L1 단백질의 261-291번 아미노산 잔기이며;
    바람직하게는, 상기 제3 타입의 야생형 HPV는 HPV26이고; 바람직하게는, (3)(a)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV26 L1 단백질의 51-60번 아미노산 잔기이고; 바람직하게는, (3)(b)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV26 L1 단백질의 114-146번 아미노산 잔기이고; 바람직하게는, (3)(c)에 기재된 상응하는 위치에 있는 아미노산 잔기들은 야생형 HPV26 L1 단백질의 173-181번 아미노산 잔기이며; 예를 들면, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 야생형 HPV51 L1 단백질 대비, N-말단에서 절단된 9개의 아미노산을 갖고;
    바람직하게는, 상기 야생형 HPV51 L1 단백질은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게는, 상기 야생형 HPV69 L1 단백질은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열을 가지며;
    바람직하게는, 상기 야생형 HPV26 L1 단백질은 서열번호 22로 기재된 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 서열번호 4, 5, 6, 또는 7로 기재된 아미노산 서열을 가지며;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질은 서열번호 23, 27, 28, 41 또는 45로 기재된 아미노산 서열을 갖는 것인 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체.
  2. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 단리된 핵산으로서,
    바람직하게는, 상기 단리된 핵산은 서열번호 12, 13, 14 또는 15에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖고;
    바람직하게는, 상기 단리된 핵산은 서열번호 32, 36, 37, 49 또는 53에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 단리된 핵산.
  3. 청구항 2에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  4. 청구항 2에 따른 단리된 핵산 및/또는 청구항 3에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 포함하거나, 또는 그로 구성된 HPV 바이러스-유사 입자(virus-like particle).
  6. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체, 또는 청구항 2에 따른 단리된 핵산, 또는 청구항 3에 따른 벡터, 또는 청구항 4에 따른 숙주 세포, 또는 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물.
  7. 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자, 및 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신으로서,
    바람직하게는, 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 유효량으로 존재하고,
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 1종 이상의 HPV에 의한 감염(예를 들면, HPV51 감염, HPV69 감염 및 HPV26 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 감염)이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암, 첨형 콘딜로마(condyloma acuminatum), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물 또는 백신.
  8. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 제조하는 방법으로서, 숙주 세포에서 상기 돌연변이된 HPV5 L1 단백질 또는 그의 변이체를 발현시키는 단계, 및 상기 숙주 세포의 배양물로부터 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 회수하는 단계를 포함하고;
    바람직하게는, 상기 숙주 세포는 대장균이고;
    바람직하게는, 상기 방법은: 대장균에서 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 발현시키는 단계, 및 대장균의 용해물(lysate) 상층액을 정제시키는 것에 의해 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체를 수득하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체는 크로마토그래피(예를 들면, 양이온-교환 크로마토그래피, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 상기 대장액의 용해물 상층액으로부터 회수되는 것인 방법.
  9. 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 조합하는 단계를 포함하는, 백신을 제조하는 방법.
  10. 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자 또는 청구항 7에 따른 약학적 조성물 또는 백신의 예방적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환을 예방하는 방법으로서,
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 1종 이상의 HPV에 의한 감염(예를 들면, HPV51 감염, HPV69 감염 및 HPV26 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 감염)이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암, 첨형 콘딜로마, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체 또는 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 1종 이상의 HPV에 의한 감염(예를 들면, HPV51 감염, HPV69 감염 및 HPV26 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 감염)이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암, 첨형 콘딜로마, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  12. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체 또는 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자로서,
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 1종 이상의 HPV에 의한 감염(예를 들면, HPV51 감염, HPV69 감염 및 HPV26 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 감염)이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암, 첨형 콘딜로마, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 돌연변이된 HPV51 L1 단백질 또는 그의 변이체 또는 HPV 바이러스-유사 입자.
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