JP7224332B2 - ヒトパピローマウイルス１６型のｌ１タンパク質の変異体 - Google Patents

ヒトパピローマウイルス１６型のｌ１タンパク質の変異体 Download PDF

Info

Publication number
JP7224332B2
JP7224332B2 JP2020501525A JP2020501525A JP7224332B2 JP 7224332 B2 JP7224332 B2 JP 7224332B2 JP 2020501525 A JP2020501525 A JP 2020501525A JP 2020501525 A JP2020501525 A JP 2020501525A JP 7224332 B2 JP7224332 B2 JP 7224332B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
hpv16
amino acid
wild
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020501525A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020526223A (ja
Inventor
グー、イン
リ、シャオウェイ
ソン、シュオ
ホー、マオチョウ
リ、チーハイ
シァ、ニンシャオ
Original Assignee
シャアメン ユニバーシティ
シャアメン イノバックス バイオテック カンパニー リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シャアメン ユニバーシティ, シャアメン イノバックス バイオテック カンパニー リミテッド filed Critical シャアメン ユニバーシティ
Publication of JP2020526223A publication Critical patent/JP2020526223A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7224332B2 publication Critical patent/JP7224332B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質（又はその変異体）、それをコードする配列、それを調製する方法、並びにそれを含むウイルス様粒子に関し、タンパク質（又はその変異体）及びウイルス様粒子は、少なくとも２つの型のＨＰＶ（たとえば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ ３５；又はＨＰＶ １６、ＨＰＶ ３５及びＨＰＶ ３１）に対する中和抗体を誘導することができ、したがって、上記の少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、及び子宮頸がんや尖圭コンジローマなどの前記感染によって引き起こされる疾患を予防するために使用することができる。本発明はさらに、前記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、及び子宮頸癌及び尖圭コンジローマなどの前記感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における上記のタンパク質及びウイルス様粒子の使用に関する。
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主に皮膚と粘膜に疣贅を引き起こす。腫瘍形成との関係によると、ＨＰＶは高リスク型と低リスク型に分類できる。その中で、高リスクＨＰＶ型による感染は、女性の子宮頸がんを含む生殖器がんの主な原因であることが確認されている。一方、低リスクＨＰＶ型による感染は、主に尖圭コンジローマを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防及び制御する最も効果的な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頸がんを引き起こす可能性のある高リスクＨＰＶ型に対するワクチンを投与することである。
ＨＰＶの主要カプシドタンパク質Ｌ１は、中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己組織化の特性を有する。ＨＰＶ ＶＬＰは、主要カプシドタンパク質Ｌ１の７２個の五量体で構成される対称二十面体構造を有する（Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．及びＰ．Ｈ．Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ．１９８７．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，６１（９）：２７９３‐９）。ＨＰＶ ＶＬＰの構造は、本来のＨＰＶの構造と非常に類似しており、本来のウイルスの中和エピトープのほとんどを保持し、高力価中和抗体を誘導することができる（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．，Ｆ．Ｂｏｏｙ，ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（２４）：１２１８０‐４）。
しかし、既存の研究は、ＨＰＶ ＶＬＰが主に同じＨＰＶ型に対する中和抗体を誘導し、同一のＨＰＶ型に対する防御免疫を生成し、少数の高度に相同な型の間で低交差防御効果のみを有することを示した（Ｓａｒａ Ｌ． Ｂｉｓｓｅｔｔ，Ｇｉａｄａ Ｍａｔｔｉｕｚｚｏ，ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｖａｃｃｉｎｅ． ３２：６５４８－６５５５）。したがって、既存のＨＰＶワクチンの防御の範囲は非常に限られている。一般に、１つのＨＰＶ型のＶＬＰは、同じＨＰＶ型による感染を防ぐためにのみ使用できる。この場合、ＨＰＶワクチンの防御の範囲を拡張する必要がある場合、唯一の方法は、ワクチンにより多くのＨＰＶ型のＶＬＰを追加することである。現在利用可能なＨＰＶワクチンには、メルクのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（これはＨＰＶ１６、１８、６及び１１に対する４価ワクチンである）、ＧＳＫのＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（これはＨＰＶ １６、１８に対する二価ワクチンである）、及びＭｅｒｃｋのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（これは９価ワクチンである）、これらはすべて、複数の型のＨＰＶのＶＬＰを混合することによって作成される。ただし、このアプローチはＨＰＶワクチンの生産コストを大幅に増加させ、免疫化用量の増加により潜在的な安全性の問題につながる可能性がある。
したがって、複数のＨＰＶ型による感染及びそれにより引き起こされる子宮頸癌及び尖圭コンジローマなどの疾患をより経済的かつ効果的に防止するために、複数の型のＨＰＶに対する防御中和抗体を誘導できるＨＰＶウイルス様粒子を開発する必要性が当技術分野に存在する。
発明の内容
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型のＬ１タンパク質の特定のセグメントを、第二の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５）のＬ１タンパク質の対応するセグメントで置き換えた後に、得られた変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質が、体内でＨＰＶ１６及び第二の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５）に対する高力価の中和抗体の産生を、ＨＰＶ１６ ＶＬＰと第二の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物と同等の防御効果でもって誘導することができ；さらに、ＨＰＶ１６に対するその防御効果が、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ単独と同等であり、第二の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５）に対するその防御効果が第二の型のＨＰＶ単独と同等であるという、発明者の予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。
また、上記置換に基づいて、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の別の特定のセグメントが、第三の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３１）のＬ１タンパク質の対応するセグメントとさらに置換されることができ、二重置換を有する得られた変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、体内で、ＨＰＶ１６、第二の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５）及び第三の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３１）に対する高力価の中和抗体の生成を、ＨＰＶ１６ ＶＬＰと、第二の型及び第三の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物と同等の防御効果でもって誘導することができ；さらに、ＨＰＶ１６に対するその防御効果は、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ単独と同等であり、第二の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５）に対するその防御効果は第二の型のＨＰＶ単独のＶＬＰと同等であり、第三の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３１）に対するその防御効果は、第三の型のＨＰＶ単独のＶＬＰと同等である。
したがって、一つの態様において、本発明は、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体を提供し、ここで該変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質に比べ以下の変異を有する：
（１）４、６、８、１０、２０、３０、又は４０個のアミノ酸などの、４～５０個のアミノ酸のＮ末端切断；
（２）野生型ＨＰＶ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基の、第二の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換；
任意選択で、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質はさらに以下の変異を有する：
（３）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置７６～８７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換
（４）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置１５２～１６７でのアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換；又は
（５）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２０２～２０７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換；
及び、変異体は変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質とは、１つ又はいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失によってのみ異なり、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の機能を維持する、すなわち、少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対して中和抗体を誘導する能力を維持する。
特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質と比較して、３０又は４０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する。
特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質と比較して、３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する。
特定の好ましい実施形態では、第二の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ３５である。特定の好ましい実施形態では、（２）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基である。
特定の好ましい実施形態において、第三の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ３１である。特定の好ましい実施形態では、（３）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置５０～６２のアミノ酸残基である。特定の好ましい実施形態では、（４）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１２７～１４２のアミノ酸残基である。特定の好ましい実施形態では、（５）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７‐１８２のアミノ酸残基である。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基の配列は、配列番号２５に記載されている。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置５０～６２のアミノ酸残基の配列は、配列番号２６に記載されている。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１２７～１４２のアミノ酸残基の配列は、配列番号２７に記載されている。
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１８２のアミノ酸残基の配列は、配列番号２８に記載されている。
特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、配列番号７、９、１０、１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の態様では、本発明は、上記の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体をコードする単離された核酸を提供する。別の態様では、本発明は、単離された核酸を含むベクターを提供する。特定の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸は、配列番号１９、２１、２２、２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
目的のポリヌクレオチドの挿入に有用なベクターは当技術分野で周知であり、クローニングベクター及び発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
別の態様において、本発明はまた、上述のような単離された核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞には、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような原核細胞、及び酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞などのような哺乳動物細胞）のような真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の宿主細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞株であってもよい。
別の態様において、本発明は、ＨＰＶウイルス様粒子に関し、ここで該ウイルス様粒子は本発明の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体を含むか、又は本発明の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体からなるか、若しくは本発明の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体により形成される。
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質と比較して、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４～５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含む。
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質に比べ、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４～５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置７６～８７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置５０～６２のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含む。
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質に比べ、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４～５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置１５２～１６７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１２７～１４２のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含む。
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質に比べ、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４～５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２０２～２０７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１８２のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含む。
特に好ましい実施形態では、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号７、９、１０又は１１に記載の配列を有する変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含む。
別の態様において、本発明はまた、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体、又は単離された核酸又はベクター又は宿主細胞、又はＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物に関する。特定の好ましい実施形態では、組成物は、本発明の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体を含む。特定の好ましい実施形態では、組成物は、本発明のＨＰＶウイルス様粒子を含む。
別の態様では、本発明はまた、本発明のＨＰＶウイルス様粒子を含む医薬組成物又はワクチンにも関し、場合により薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤をさらに含む。本発明の医薬組成物又はワクチンは、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌、尖圭コンジローマを予防するために使用することができる。
特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は一つ以上のＨＰＶ型による感染である（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される。
本発明の医薬組成物又はワクチンは当技術分野で周知の方法、例えば、経口又は注射により投与することができるが、これらに限定されない。本発明において、特に好ましい投与様式は注射である。
特定の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物又はワクチンは単位用量の形で投与される。例えば、本発明を限定することを意図するものではないが、各単位用量に含まれるＨＰＶウイルス様粒子の量は５μｇ～８０μｇ、好ましくは２０μｇ～４０μｇである。
別の態様において、本発明は上記の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又は変異体を調製するための方法に関し、これは変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体を宿主細胞において発現させ、次いで変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はそれらの変異体を宿主細胞の培養物から回収することを含む。
特定の好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
特定の好ましい実施形態において、この方法は、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させるステップ、次いで変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体を大腸菌の溶解物上清を精製することにより得るステップを含む。特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体は大腸菌の溶解物上清からクロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）により回収される。
別の態様において、本発明はワクチンを調製する方法に関し、これは本発明のＨＰＶウイルス様粒子を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む。
別の態様において、本発明はＨＰＶ感染やＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防する方法に関し、これは被験体に本発明による予防的に有効な量のＨＰＶウイルス様粒子又は医薬組成物又はワクチンを投与することを含む。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染が一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが挙げられるが、これらには限定されない。別の好ましい実施形態では、被験体はヒトなどの哺乳動物である。
別の態様において、本発明は本発明による変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質又はその変異体又はＨＰＶウイルス様粒子の、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防のための医薬組成物又はワクチンの製造における使用に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染が一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明における関連用語の記載及び説明
本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、特に明記しない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室手順は、対応分野で広く使用されるすべてのルーチンのステップである。また、本発明のより良い理解のために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
本発明によれば、用語「第二の型の野生型ＨＰＶ」は、ＨＰＶ１６とは異なる別の型の野生型ＨＰＶを意味する。本発明においては、第二の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ３５である。本発明によれば、用語「第三の型の野生型ＨＰＶ」は、ＨＰＶ１６及び第二の型の野生型ＨＰＶとは異なる別の型の野生型ＨＰＶを指す。本発明においては、第三の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ３１である。
本発明によれば、表現「対応する位置」は、配列が最適に整列される場合、すなわち、配列が最大の同一性割合を得るように整列される場合に比較される配列の等価位置を指す。
本発明によれば、「野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に天然に存在する主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の配列は、当技術分野で周知であり、様々な公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベース登録番号ＡＮＡ０５４９６．１、ＡＮＡ０５５３９．１、ＡＧＣ６５５２５．１、ＡＡＶ９１６５９．１及びＡＡＤ３３２５９．１）で見つけることができる。
本発明において、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号１に示される配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の２９２～３１６位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１に示すポリペプチドの２９２～３１６の位置のアミノ酸残基を指す。しかし、野生型ＨＰＶ１６が複数の分離株を含み得ること、及び様々な分離株がそのＬ１タンパク質のアミノ酸配列において相違を有し得ることが、当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者であれば、配列に相違があるものの、ＨＰＶ１６の様々な分離株のＬ１タンパク質が、非常に高いアミノ酸配列同一性（通常９５％を超える、例えば９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える）を有すること、実質的に同じ生物学的機能を持っていることを理解するであろう。したがって、本発明では、「野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号１で表されるタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ１６分離株のＬ１タンパク質も含む（例えば、ＡＮＡ０５４９６．１、ＡＮＡ０５５３９．１、ＡＧＣ６５５２５．１、ＡＡＶ９１６５９．１、及びＡＡＤ３３２５９．１に示されるようなＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質）。また、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは配列番号１の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ１６分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２の３１６のアミノ酸残基」には、配列番号１の位置２９２～３１６のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ１６分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
本発明によれば、「野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス３５型（ＨＰＶ３５）に天然に存在する主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の配列は、当技術分野で周知であり、様々な公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベース登録番号Ｐ２７２３２．２、ＡＣＶ８４０２２．１、ＡＥＩ６１３６５．１、ＡＥＩ６１４２９．１、及びＡＣＶ８４０２９．１）で見つけることができる。
本発明では、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号２に示す配列を参照して記載される。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基」は、配列番号２で表されるポリペプチドの位置２６６～２８８のアミノ酸残基を指す。しかし、野生型ＨＰＶ３５は、様々な単離株を含み得ること、及び様々な分離株がそれらのＬ１タンパク質のアミノ酸配列に相違を有し得ることが当業者に理解されるであろう。さらに、当業者であれば、配列に相違があるものの、ＨＰＶ３５の様々な分離株のＬ１タンパク質が非常に高いアミノ酸配列同一性（通常は９５％を超える、例えば９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える）を有すること、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解するであろう。したがって、本発明では、用語「野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質」は、配列番号２で表されるタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ３５分離株のＬ１タンパク質（例えば、Ｐ２７２３２．２、ＡＣＶ８４０２２．１、ＡＥＩ６１３６５．１、ＡＥＩ６１４２９．１及びＡＣＶ８４０２９．１に示されるＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質）も含む。また、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは配列番号２の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ３５分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基」には、配列番号２の位置２６６～２８８のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ３５分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルス３１型（ＨＰＶ３１）に天然に存在する主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の配列は、当技術分野で周知であり、様々な公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベース登録番号Ｐ１７３８８．１、ＡＥＩ６０９６５．１、ＡＮＢ４９６５５．１、及びＡＥＩ６１０２１．１）で見つけることができる。
本発明において、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号３に示される配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１７７のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３で表されるポリペプチドの位置１７７～１８２のアミノ酸残基」を指す。しかし、野生型ＨＰＶ３１が複数の分離株を含み得ること、種々の分離株がそれらのＬ１タンパク質のアミノ酸配列において相違を有し得ることが当業者により理解される。さらに、当業者であれば、配列に相違はあるものの、ＨＰＶ３１の様々な分離株のＬ１タンパク質が非常に高いアミノ酸配列同一性（通常は９５％を超える、例えば９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える）を有すること、及び実質的に同じ生物学的機能を有することを理解するであろう。したがって、本発明では、用語「野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質」は、配列番号３で表されるタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ３１分離株のＬ１タンパク質（例えば、Ｐ１７３８８．１、ＡＥＩ６０９６５．１、ＡＮＢ４９６５５．１及びＡＥＩ６１０２１．１に示されるＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質）も含む。また、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは配列番号３の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ３１単離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１８２のアミノ酸残基」は、配列番号３の位置１７７～１８２のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ３１分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
本発明によれば、表現「対応する配列断片」又は「対応する断片」とは、配列が最適に整列された場合、すなわち配列が最も高い同一性のパーセントを得るように整列された場合と比較して、配列の同等の位置に配置されている断片を指す。
本発明によれば、表現「Ｘ個のアミノ酸のＮ末端切断」は、タンパク質のＮ末端の位置１～Ｘのアミノ酸残基が（タンパク質翻訳の開始のための）開始コドンによりコードされているメチオニン残基で置換されていることを指す。例えば、３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有するＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質のＮ末端の位置１～３０のアミノ酸残基を開始コドンによってコードされるメチオニン残基で置換することにより得られるタンパク質を指す。
本発明によれば、「変異体」という用語は、そのアミノ酸配列が１つ又はいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失を有するか、又は本発明による変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号７、９、１０及び１１に示されるタンパク質）と比較して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、及び変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の機能を維持するタンパク質を指す。本発明において、用語「変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の機能」とは、身体において少なくとも二つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を意味する。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の類似性の尺度である。一般に、配列は最大一致を得るように整列される。「同一性」自体には、当技術分野で周知の意味があり、ＢＬＡＳＴなどの公開されたアルゴリズムを使用して計算することができる。
本発明によれば、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較のための２つの配列が特定の部位に塩基又はアミノ酸の同じモノマーサブユニットを持っている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが特定の部位にアデニンを持っている、又は２つのポリペプチドのそれぞれが特定の部位にリジンを持っている）、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較対象部位の総数に対する２つの配列が共有する同一部位の数ｘ１００の関数である。例えば、２つの配列の１０の部位のうち６つが一致する場合、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。たとえば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは５０％の同一性を共有する（６つの部位のうち３つが一致する）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。そのような整列は、例えば、ニードルマンらの方法に基づく整列プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムを使用することにより行うことができる（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３‐４５３，１９７０）。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１‐１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０重み残余テーブルを用いて、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４で決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４‐４５３（１９７０））により、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスを使用し、１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップウェイトと１、２、３、４、５、又は６の長さウェイトで決定できる。
本明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利な影響又は変化を与えないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に対して、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的又は機能的に類似する（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合等を形成する能力を含む化学的性質を有する）残基で置換されるという置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、一般的に保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０‐１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９‐８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２‐４１７（１９９７）を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明によれば、用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を指し、ここで、大腸菌（株）は、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）を含む市販の株に由来するが、これらに限定されない。
本発明によれば、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸運搬ツールを指す。ベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより、宿主細胞において担持された遺伝物質要素を発現させることができる。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明によれば、「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」という用語は、当技術分野で周知の、被験体及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、１９版、ペンシルベニア：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５参照）、これはｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤には、リン酸緩衝液が含まれるが、これに限定されない。界面活性剤には、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、又は非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ‐８０が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントには、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及びフロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）が含まれるが、これらに限定されない。イオン強度増強剤には、ＮａＣｌが含まれるが、これに限定されない。
本発明によれば、「有効量」という用語は、意図された目的を効果的に達成できる量を指す。例えば、疾患（ＨＰＶ感染など）の予防に有効な量とは、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、又は遅延させるのに有効な量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
本発明によれば、「クロマトグラフィー」という用語には、イオン交換クロマトグラフィー（カチオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、及びアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、「溶解物上清」という用語は、以下のステップにより生成される溶液を指す：宿主細胞（大腸菌など）を溶解緩衝液中で破壊し、その後、不溶性物質を、破壊された宿主細胞を含有する溶解溶液から除去する。様々な溶解緩衝液が当技術分野で周知であり、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、宿主細胞の破壊は、当業者に周知の方法によって達成することができ、ホモジナイザー破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出、リゾチーム処理などが挙げられるが、これらに限定されない。不溶性物質を除去する方法も当業者に周知であり、濾過及び遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の有益な効果
研究によれば、ＨＰＶ１６及び他の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１など）との間の特定の交差防御があるものの、このような交差防御は、それ自身の型のＶＬＰの防御効力の、通常百分の一未満、さらには千分の一未満の乏しい効力を有する。したがって、ＨＰＶ１６ワクチンを接種した被験体は他の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１など）に感染する高いリスクが依然としてあることが示されている。
本発明は、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質及びそれにより形成されたＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ１６と他の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）との間に有意な交差防御を提供することができる。具体的には、同じ免疫化用量で、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、体内で少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対して高力価の中和抗体の生成を誘導することができ、その効果は、複数の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物（例えば、ＨＰＶ１６ＶＬＰ及びＨＰＶ３５ＶＬＰの混合物、又はＨＰＶ１６ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ＶＬＰ、及びＨＰＶ３１ＶＬＰの混合物）と同等である。したがって、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ３１）による感染及びそれに伴う疾患を同時に防止するために使用することができ、有意に有利な技術的効果を有する。これは、ＨＰＶワクチンの防御の範囲を拡大し、ＨＰＶワクチンの生産コストを削減する上で特に重要な利点がある。
以下、本発明の実施形態を添付の図面及び実施形態を参照して詳細に説明する。しかし、当業者は、以下の図面及び実施例が本発明の単なる例示であり、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解するであろう。以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び有利な態様が当業者には明らかであろう。
図１は実施例１の精製変異タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１６Ｎ３０（３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有するＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質）；レーン２：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１；レーン３：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２；レーン４：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３；レーン５：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４；レーン６：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５；レーン７：ＨＰＶ１６Ｎ３０；レーン８：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１；レーン９：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２；レーン１０：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３；レーン１１：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５。結果は、クロマトグラフィーによる精製後、タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５が９５％以上の純度を有することを示した。
図２は、広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用して、実施例１で調製されたＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５のウエスタンブロット検出の結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１６Ｎ３０；レーン２：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１；レーン３：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２；レーン４：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３；レーン５：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４；レーン６：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５；レーン７：ＨＰＶ１６Ｎ３０；レーン８：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１；レーン９：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２；レーン１０：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３；レーン１１：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５。結果は、変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識できることを示した。
図３Ａ‐３Ｌは、タンパク質ＨＰＶ１６Ｎ３０、ＨＰＶ３５ Ｌ１、ＨＰＶ３１ Ｌ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を含むサンプルの分子ふるいクロマトグラフィー分析の結果を示す。図３Ａ：ＨＰＶ１６Ｎ３０；図３Ｂ：ＨＰＶ３５ Ｌ１；図３Ｃ：ＨＰＶ３１ Ｌ１；図３Ｄ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１；図３Ｅ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２；図３Ｆ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３；図３Ｇ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４；図３Ｈ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５；図３Ｉ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１；図３Ｊ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２；図３Ｋ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３；図３Ｌ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５。結果は、各試料の第１のタンパク質ピークが約１２分間で出現し、これらがＨＰＶ１６Ｎ３０タンパク質から組織化されたＶＬＰ（ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ）、ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質から組織化されたＶＬＰ（ＨＰＶ３５ ＶＬＰ）、及びＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質から組織化されたＶＬＰ（ＨＰＶ３１ ＶＬＰ）と同等であることを示した。これは、上記変異タンパク質の全てがＶＬＰに組織化され得ることを示す。
図４Ａ‐４Ｌは、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰについての沈降速度分析の結果を示す。図４Ａ、Ｈ１６Ｎ３０ ＶＬＰ；図４Ｂ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ；図４Ｃ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ；図４Ｄ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ；図４Ｅ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ；図４Ｆ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ；図４Ｇ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ；図４Ｈ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ；図４Ｉ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ；図４Ｊ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ；図４Ｋ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ；図４Ｌ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰ。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰの沈降係数が、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、及びＨＰＶ３１ ＶＬＰの沈降係数に類似していることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５がサイズと形態の点で野生型ＶＬＰと類似のウイルス様粒子に組織化されることを示す。
図５Ａ～５Ｌは、様々なＶＬＰサンプルについての透過型電子顕微鏡観察の結果を示す（１００，０００倍の倍率、バー＝０．１μｍ）。図５Ａ、ＨＰＶ１６Ｎ３０によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ３５ Ｌ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｃ、ＨＰＶ３１ Ｌ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｈ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２から組織化されたＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３から組織化されたＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５から組織化されたＶＬＰ。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５がＨＰＶ１６Ｎ３０、ＨＰＶ３５ Ｌ１及びＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質に類似し、約３０ｎｍの半径のＶＬＰに組織化され得ることを示した。
図６Ａ‐６Ｌは、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰについての熱安定性評価の結果を示す。図６Ａ、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰ。結果は、各タンパク質によって形成されたＶＬＰの熱安定性が非常に高いことを示す。
図７Ａは、マウスにおける実験群のＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ及び対照群のＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰがマウスにおいてＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対する高力価中和抗体を誘導したことを示し；ＨＰＶ１６に対するその防御効果はＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同程度であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に高く；また、ＨＰＶ３５に対するその防御効果はＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独、混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同程度であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰがＨＰＶ１６感染及びＨＰＶ３５感染に対する効果的なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ及びＨＰＶ３５ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示す。
図７Ｂは、マウスにおける実験群のＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰ、及び対照群のＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰがマウスにおいてＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する高力価中和抗体を誘導し；そのＨＰＶ１６に対する防御効果がＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独と混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に高く；ＨＰＶ３５に対するそれらの防御効果がＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に高く；そのＨＰＶ３１に対する防御効果はＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり；ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰがＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、ＨＰＶ３１感染に対する効果的なワクチンとして使用することができ、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、及びＨＰＶ３１ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用することができることを示す。
図８Ａ‐８Ｃは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰによるマウスの免疫化後のマウス血清における中和抗体力価の評価結果を示す。図８Ａ：１０μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１０μｇであった）。図８Ｂ：１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１μｇであった）。図８Ｃ：０．１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が０．１μｇであった）。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ１６に対する高力価の中和抗体を誘導し、その防御効果が同用量のＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、同用量でＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；これはまた、マウスにおいてＨＰＶ３５に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果が、同用量でＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、同用量でＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰがＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対して良好な交差免疫原性と交差防御を有していることを示す。
図８Ｄ～８Ｆは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰによるマウスの免疫化後のマウス血清の中和抗体力価の評価結果を示す。図８Ｄ：１０μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１０μｇであった）。図８Ｅ：１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１μｇであった）。図８Ｆ：０．１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が０．１μｇであった）。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰがマウスにおけるＨＰＶ１６に対する高力価の中和抗体を誘導し、その防御効果は同じ用量でＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、同じ用量でＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独又はＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；それはまた、マウスにおいてＨＰＶ３５に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果は同じ用量でＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、同じ用量で、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独又はＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；そしてまた、マウスにおいてＨＰＶ３１に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果がＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、同じ用量でＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独又はＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐Ｓ３ ＶＬＰが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対して良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示す。
配列情報
本発明に関与する配列のいくつかを以下の表１に示す。
Figure 0007224332000001
Figure 0007224332000002
配列１（配列番号１）：
Figure 0007224332000003
配列２（配列番号２）：
Figure 0007224332000004
配列３（配列番号３）：
Figure 0007224332000005
配列４（配列番号４）：
Figure 0007224332000006
配列５（配列番号５）：
Figure 0007224332000007
配列６（配列番号６）：
Figure 0007224332000008
配列７（配列番号７）：
Figure 0007224332000009
配列８（配列番号８）：
Figure 0007224332000010
配列９（配列番号９）：
Figure 0007224332000011
配列１０（配列番号１０）：
Figure 0007224332000012
配列１１（配列番号１１）：
Figure 0007224332000013
配列１２（配列番号１２）：
Figure 0007224332000014
配列１３（配列番号１３）：
Figure 0007224332000015
配列１４（配列番号１４）：
Figure 0007224332000016
配列１５（配列番号１５）：
Figure 0007224332000017
配列１６（配列番号１６）：
Figure 0007224332000018
配列１７（配列番号１７）：
Figure 0007224332000019
配列１８（配列番号１８）：
Figure 0007224332000020
配列１９（配列番号１９）：
Figure 0007224332000021
配列２０（配列番号２０）：
Figure 0007224332000022
配列２１（配列番号２１）：
Figure 0007224332000023
配列２２（配列番号２２）：
Figure 0007224332000024
配列２３（配列番号２３）：
Figure 0007224332000025
配列２４（配列番号２４）：
Figure 0007224332000026
配列２５（配列番号２５）：
Figure 0007224332000027
配列２６（配列番号２６）：
Figure 0007224332000028
配列２７（配列番号２７）：
Figure 0007224332000029
配列２８（配列番号２８）：
Figure 0007224332000030
発明を実施するための特定の形態
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらは本発明を説明することを意図しており、限定するものではない。
特に断らない限り、本発明において使用される分子生物学実験方法及びイムノアッセイは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル），第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５の手順を実質的に参照することにより実施された；制限エンドヌクレアーゼは、メーカーの推奨する条件下で使用された。本発明は実施例により記載され、この実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではないことは、当業者によって理解されるであろう。
実施例１．変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の発現及び精製
発現ベクターの構築
ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質から誘導されるセグメント３又はセグメント５を含む変異ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターをＰＣＲによって多部位突然変異誘発のために構築した。ここで使用された初期テンプレートはｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ３０Ｃプラスミドであった（これは３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有するＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質をコードした（このタンパク質はＨＰＶ１６Ｎ３０と名付けた）；表２では１６Ｌ１Ｎ３０と略す）。各ＰＣＲ反応に使用されたテンプレートとプライマーを表２に示し、ＰＣＲ反応の増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性；２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、一定時間の間、特定の温度でのアニーリング、７２℃で７分３０秒間の伸長）；最終的に７２℃で７分間の伸長。用いたＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。
２μｌの制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩを増幅産物（５０μＬ）に加え、３７℃で６０分間インキュベートした。１０μＬの酵素消化産物を、塩化カルシウム法で調製した４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入）の形質転換に使用した。形質転換された大腸菌を、カナマイシン（最終濃度：２５ｍｇ／ｍｌ、以下同じ）を含む固体ＬＢ培地（ＬＢ培地成分：１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母粉末、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、以下同じ）上に広げ、単一コロニーが明確に観察されるまで、３７°Ｃで１０～１２時間静置培養した。単一コロニーを採取し、液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）４ｍｌを含有する試験管に接種し、３７℃で１０時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。その後、細菌溶液１ｍＬを取り、－７０°Ｃで保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミドに挿入した標的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）のそれぞれに挿入された標的断片のヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１８及び２０であり、それによりコードされるアミノ酸配列が配列番号６及び８であることを示した（対応するタンパク質を、それぞれ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５と名付けた）。
変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置１９９～２１０のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置１７３～１８４のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なっていた。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置３７４～３８４のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置３４６～３５６のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なっていた。
ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質に由来するセグメント１、セグメント２又はセグメント４を含む変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の発現ベクターは、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ＤＧ、Ｙｏｕｎｇ Ｌ、Ｃｈｕａｎｇ ＲＹ、Ｖｅｎｔｅｒ ＪＣ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ＣＡ、Ｓｍｉｔｈ ＨＯを使用して構築された。ＤＮＡ分子の数百キロベースまでの酵素的アセンブリ。Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３-５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１８）。簡単に説明すると、突然変異を含む短い断片と突然変異を含まない長い断片を最初にＰＣＲ反応で取得し、次にギブソンアセンブリシステムを使用して２つの断片をループに連結した。使用した最初のテンプレートは、ｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ３０Ｃプラスミド及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３５Ｌ１プラスミド（ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質をコードする。表２で３５Ｌ１と略記）であった。各ＰＣＲ反応のために使用されるテンプレート及びプライマーは、表２に示した。短い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性；２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で特定の時間のアニーリング、７２°Ｃで１分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間の伸長。長い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性；２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、一定時間、所定の温度でのアニーリング、７２℃で７分３０秒間の伸長）；最終的に７２℃で１０分間の伸長。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。増幅産物を電気泳動に供した後、標的断片をＤＮＡ回収キットを用いて回収し、それらの濃度を決定した。増幅された短い断片及び長い断片を、２：１のモル比で混合し（３μＬの総体積）、次いで２Ｘギブソンアセンブリプレミックス（２Ｘギブソンアセンブリマスターミックス、ＮＥＢから購入した、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを含む）の３μＬを添加し、５０°Ｃで１時間反応させた。
塩化カルシウム法により調製された４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を、組織化された生成物（６μＬ）で形質転換した。形質転換された大腸菌を、カナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明確に観察されるまで３７℃で１０～１２時間静的培養した。単一コロニーを採取し、４ｍＬの液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）を含有する試験管に接種し、３７℃で１０時間、２２０ｒｐｍで振盪培養した。その後、細菌溶液１ｍＬを取り、－７０°Ｃで保存した。プラスミドを大腸菌から抽出し、プラスミドに挿入された標的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）のそれぞれに挿入された標的断片のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１６、１７、及び１９であり、それによってコードされるアミノ酸配列は配列番号４、５、及び７（対応するタンパク質は、それぞれ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４と名付けた）であることを示した。
変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置７６～８７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置５０～６１のアミノ酸残基で置き換えられている点でＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置１５８～１６７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置１３２～１４１のアミノ酸残基で置き換えられている点でＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基で置き換えられている点でＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。
変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を、ＨＰＶ３５ Ｌ１に由来するセグメント及びＨＰＶ３１ Ｌ１に由来するセグメントを含有する二置置換とともにコードする発現ベクターを、ギブソンアセンブリを用いて構築した。簡単に言えば、突然変異を含む短い断片と突然変異を含まない長い断片を最初にＰＣＲ反応により取得し、次にギブソンアセンブリシステムを使用して２つの断片をループに連結した。使用した初期テンプレートは、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４プラスミド（変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４をコードする。表２でＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４と略記）、及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３１Ｌ１プラスミド（ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質をコードする。表２で３１Ｌ１と略記）を含んでいた。それぞれのＰＣＲ反応のために使用されるテンプレート及びプライマーを表２に示し、短い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性、２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間の伸長。長い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の伸長、２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７分３０秒間の伸長）；最後に７２℃で１０分間の伸長。用いたＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。増幅産物を電気泳動に供し、次いで標的断片を、ＤＮＡ回収キットを用いて回収し、その濃度を測定した。増幅された短い断片及び長い断片を２：１のモル比で混合し（３μＬの全体積）、次いで２Ｘギブソンアセンブリプレミックスの３μＬ（２Ｘギブソン・アセンブリマスターミックス、ＮＥＢから購入した、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼを含む）を追加し、５０℃で１時間反応させた。
塩化カルシウム法により調製された４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を、組織化された生成物（６μＬ）で形質転換した。形質転換された大腸菌をカナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明確に観察されるまで３７℃で１０～１２時間静的培養した。単一コロニーを採取し、４ｍＬの液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）を含有する試験管に接種し、３７℃で１０時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。その後、細菌溶液１ｍＬを取り、－７０°Ｃで保存した。プラスミドを大腸菌から抽出し、プラスミドに挿入した標的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）のそれぞれに挿入された所望の断片の塩基配列はそれぞれ配列番号２１、２２、２３、及び２４であり、それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号９、１０、１１、１２（対応するタンパク質は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５と名付けた）であることを示した。
変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置７６‐８７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置５０～６２のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置１５２～１６７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１２７～１４２のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２０２～２０７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１８２のアミノ酸残基で置きかえられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異アタンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５は、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置３７５～３８４のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置３５０～３５９のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。
Figure 0007224332000031
Figure 0007224332000032
Figure 0007224332000033
変異タンパク質の大規模スケールでの発現
組換えプラスミドｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を担持する大腸菌の細菌液を、－７０℃の冷蔵庫から取り出し、１００ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に別々に接種し、３７℃で約８時間２００ｒｐｍで培養し、次に、カナマイシン含有ＬＢ培地の５００ｍｌに移して接種し（細菌液１ｍｌを接種した）、継続的に培養した。細菌濃度が約０．６のＯＤ６００に達したときに、培養温度を２５℃に下げ、ＩＰＴＧの５００μＬをそれぞれの培養フラスコに添加し、培養を８時間続けた。培養終期に、細菌細胞を遠心分離により回収した。Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５タンパク質を別個に発現する細菌細胞が得られた。
変異タンパク質を発現する細菌細胞の破壊
得られた細胞を、細菌細胞１ｇと溶解物１０ｍＬ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）の比で再懸濁した。細胞を３０分間の超超音波処理により破壊した。破壊された細胞を含有する溶解物を、１５分間１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で遠心分離し、上清（すなわち、破壊された細菌細胞の上清）を取り出した。
変異タンパク質のクロマトグラフィー精製
機器システム：ＡＫＴＡエクスプローラー１００分取液体クロマトグラフィーシステム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（現、Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製。
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣＨＴ‐ＩＩ（Ｂｉｏ‐ＲＡＤから購入）、及びＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＤＴＴ；及び２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ ＮａＣｌ。
サンプル：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５をそれぞれ含有する破壊された細菌細胞の得られた上清。
溶出手順：
（１）破壊された細菌細胞の上清のカチオン交換精製をＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを用いて行った：サンプルをカラムにロードし、次いで４００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて望ましくないタンパク質を溶出し、８００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を使用して標的タンパク質を溶出し、８００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液により溶出された画分を収集した。
（２）前のステップで得られた溶出画分のクロマトグラフィー精製をＣＨＴ ＩＩ（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）を用いて行った：前のステップで得られた溶出画分を、希釈してＮａＣｌの濃度を０．５Ｍに減少させた；サンプルをカラムにロードし、次いで５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて望ましくないタンパク質を溶出し、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて標的タンパク質を溶出し、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液により溶出された画分を収集した。
（３）前のステップで得られた溶出画分のクロマトグラフィー精製を、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）を使用して実行した：サンプルをカラムにロードし、次いで１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用して不要なタンパク質を溶出し、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液を使用して標的タンパク質を溶出し、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液により溶出された画分を回収した。
ステップ（３）で得られた溶出画分１５０μＬを採取し、６Ｘローディング緩衝液３０μＬに加え、混合し、８０℃の水浴で１０分間インキュベートした。次に、サンプル１０μｌを１０％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲルで１２０Ｖで１２０分間電気泳動し；電気泳動バンドを、クーマシーブルー染色により可視化した。電気泳動の結果を図１に示した。結果は、上記精製工程の後、タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５の純度はすべて９５％を超えていた。
同様の方法により、大腸菌とｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ３０Ｃプラスミドを使用してＨＰＶ１６Ｎ３０タンパク質を調製及び精製した。大腸菌及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３５Ｌ１プラスミドを使用して、ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質（配列番号２）を調製及び精製した。大腸菌及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３１Ｌ１プラスミドを使用して、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質（配列番号３）を調製及び精製した。
変異タンパク質のウェスタンブロッティング
精製したタンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を、上記の方法により電気泳動に供した。電気泳動後、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用してウェスタンブロット検出を実施し、結果を図２に示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５は、広域スペクトル抗体４Ｂ３により特異的に認識できることを示した。
例２：ＨＰＶウイルス様粒子のアセンブリと粒子形態検出
ＨＰＶウイルス様粒子のアセンブリ
所与の体積（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、又はＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を、順次、（１）２Ｌの保存緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ）、（２）２Ｌ復元緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ ＮａＣｌ）；及び（３）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌに透析した。透析は、３つの緩衝液のそれぞれにおいて１２時間行った。
同様の方法で、タンパク質ＨＰＶ１６Ｎ３０、ＨＰＶ３５ Ｌ１及びＨＰＶ３１ Ｌ１を、それぞれ、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及びＨＰＶ３１ ＶＬＰに組織化した。
分子ふるいクロマトグラフィー分析
透析されたサンプルを、ＴＳＫ Ｇｅｌ ＰＷ５０００ｘｌ ７．８ｘ３００ｍｍの分析カラムを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡからの１１２０ Ｃｏｍｐａｃｔ ＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステムを使用した分子ふるいクロマトグラフィーで分析した。分析の結果を図３Ａ～３Ｌに示す。結果は、タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を含有するサンプルについて、最初のタンパク質のピークが約１２分で現れ、これはＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及びＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であることを示した。これは上記で調製したタンパク質がＶＬＰに組織化されたことを示した。
沈降速度分析
沈降速度分析のために使用された機器は、光学検査システム及びＡｎ‐５０Ｔｉ及びＡｎ‐６０Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ ＸＬ‐Ａ分析型の超遠心であった。沈降速度法を使用して、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰの沈降係数を分析した。結果を４Ａ～４Ｌに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰの沈降係数が、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及びＨＰＶ３１ ＶＬＰと同様であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５が大きさ及び形態の点で野生型ＶＬＰと類似のウイルス様粒子に組織化されることを示した。
ウイルス様粒子の形態学的検出
ＶＬＰを含むサンプルの１００μＬを透過型電子顕微鏡観察のために採取した。使用した機器は、ＪＥＯＬ製の１００ｋＶ透過型電子顕微鏡で、倍率は１００，０００倍であった。簡単に言えば、１３．５μＬのサンプルを採取し、ｐＨ７．０の２％リンタングステン酸でネガティブ染色し、カーボンコーティングされた銅メッシュに固定し、次いで透過型電子顕微鏡で観察した。観察の結果は、図５Ａ～５Ｌに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５がすべてウイルス様粒子に組織化されることを示した。さらに、結果はまた、これらの変異タンパク質によって形成された粒子が約３０ナノメートルの半径を有し、サイズが均一であることを示した。これは、これらの変異タンパク質が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１のＬ１タンパク質に類似し、均一なサイズのＶＬＰを形成することができることを示した。
例３：ウイルス様粒子の熱安定性の評価
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５によって形成されたＶＬＰの熱安定性は、ＧＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入した示差温度熱量計ＶＰキャピラリーＤＳＣを用いて評価した。ここで、タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質の各々を１．５℃／分の加熱速度で１０℃～９０℃の範囲内でスキャンした。テスト結果を図６Ａ～６Ｌに示した。結果は、タンパク質のそれぞれにより形成されたＶＬＰが極めて高い熱安定性を有することを示した。
実施例４：動物におけるウイルス様粒子の免疫防御の評価１
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５によって形成されたＶＬＰの免疫防御特性をマウスを使用して評価した。免疫化に使用した動物は、５～６週齢のＢａｌＢ／ｃマウス（通常グレード）（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入）であった。
上記で調製したＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５ ＶＬＰ、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ及びＨＰＶ３５ ＶＬＰの混合物）をそれぞれアルミニウムアジュバントの上に吸着させた。マウスは、異なる免疫原に従って８つの群に分け、各群は５匹のマウスを含ませた。免疫化手順は以下のとおりであった：一次免疫を０週で実施し；追加免疫をそれぞれ２週と４週で行った。免疫化の方法は腹腔内注射とし、使用した免疫原と用量を表４に示す。一次免疫後８週で、静脈血を眼球から収集し、血清を分離した後、血清中の中和抗体の力価を測定した。試験結果を図７Ａに示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰが高い力価の中和抗体をマウスにおいてＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対して誘導し；ＨＰＶ１６に対するその防御効果は、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に高く；ＨＰＶ３５に対するその防御効果は、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰがＨＰＶ１６感染及びＨＰＶ３５感染に対する有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ及びＨＰＶ３５ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
Figure 0007224332000034
さらに、上記で調製したＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５ ＶＬＰ、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１（すなわち、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及びＨＰＶ３１ ＶＬＰの混合物）を、それぞれ、アルミニウムアジュバントに吸着させた。マウスを異なる免疫原に従って８つの群に分け、各群には５匹のマウスを含ませた。免疫化手順は以下のとおりであった：一次免疫を０週で実施し；追加免疫をそれぞれ２週と４週で行った。免疫化の方法は腹腔内注射とし、使用した免疫原と用量を表５に示す。一次免疫後８週で、静脈血を眼球から収集し、血清を分離した後、血清中の中和抗体の力価を測定した。試験結果を図７Ｂに示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰがマウスにおいてＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する高い力価の中和抗体を誘導し；そのＨＰＶ１６に対する防御効果はＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に高く；それらのＨＰＶ３５に対する防御効果はＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独、混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独、及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に高く；そのＨＰＶ３１に対する防御効果はＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２ ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰが、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染及びＨＰＶ３１感染に対する有効なワクチンとして使用することができ、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ及びＨＰＶ３１ ＶＬＰを含有する混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
Figure 0007224332000035
実施例５：動物におけるウイルス様粒子の免疫防御の評価２
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰのＥＤ５０
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス（８匹のマウス）を単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントで免疫化した。ここで、実験群にはＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰ（免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、及び０．００４μｇとした）を投与した、対照群はＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独とＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独（免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）、又は混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰ（各ＶＬＰの免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）を投与した；免疫化量は１ｍＬとした。免疫化後５週で、静脈血を眼球から回収し、血液中のＨＰＶ抗体を検出した。血清変換（seroconversion）（すなわち、マウスにおける抗体の生成の誘導）のＥＤ５０を、Ｒｅｅｄ‐Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ ＬＪ ＭＨ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．（５０パーセントのエンドポイントを推定する簡単な方法。）Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ．１９３８；２７：４９３‐７）によって、各サンプルについて計算した。結果を表６～９に示した。
Figure 0007224332000036
Figure 0007224332000037
Figure 0007224332000038
Figure 0007224332000039
結果は、マウスにおける免疫化の５週間後に、マウスにおいて抗ＨＰＶ１６抗体の生成を誘導するためのＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰのＥＤ５０は、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に優れており；マウスにおいて抗ＨＰＶ３５抗体の生成を誘導するためのそのＥＤ５０はＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独よりも有意に優れることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰがＨＰＶ１６とＨＰＶ３５に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰのＥＤ５０
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス（８匹のマウス）を、単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントで免疫化した。実験群はＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬ（免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）を投与し；対照群はＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独（免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）、及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰ（各ＶＬＰの免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）を投与し；免疫体積は１ｍＬとした。免疫化後５週で、静脈血を眼球から回収し、血液中のＨＰＶ抗体を検出した。血清変換の誘導（すなわち、マウスにおける抗体の生成の誘導）のためのＥＤ５０は、各サンプルについて、Ｒｅｅｄ‐Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ ＬＪ ＭＨ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．（５０パーセントのエンドポイントを推定する簡単な方法。）Ａｍ Ｊ Ｈｙｇ．１９３８；２７：４９３‐７）によって計算した。結果を表１０～１４に示した。
Figure 0007224332000040
Figure 0007224332000041
Figure 0007224332000042
Figure 0007224332000043
Figure 0007224332000044
結果は、マウスの免疫化の５週間後に、マウスにおける抗ＨＰＶ１６抗体の生成を誘導するためのＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰのＥＤ５０は、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に優れており；マウスにおいて抗ＨＰＶ３５抗体の生成を誘導するためのそのＥＤ５０は、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；マウスにおいて抗ＨＰＶ３１抗体の生成を誘導するためのそのＥＤ５０は、ＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
マウスにおけるＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰでの免疫化後の血清中の中和抗体の力価の評価
この実験では、免疫化プロトコルを表１５に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：１０μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１０μｇであった）、１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１μｇであった）、及び０．１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して０．１μｇであった）。各群を４つのサブグループに細分し、対照サブグループ１及び２は、それぞれ、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び単独ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独で免疫化し、対照サブグループ３は混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰで免疫化し、実験サブグループはＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰで免疫化した。
サブグループあたり６匹のマウスを腹腔内注射により免疫化し、免疫化用量はそれぞれ１０μｇ、１μｇ、及び０．１μｇであり、注射量は１ｍｌであった。全てのマウスは最初に０週で免疫化し、追加免疫をそれぞれ２週及び４週で行った。血液サンプルは８週で眼窩出血を介してマウスから採取し、血清中のＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対する抗体の力価を分析した。分析の結果を図８Ａ～８Ｃに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰは、マウスにおけるＨＰＶ１６に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果がＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、同じ用量でＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり、それはマウスにおけるＨＰＶ３５に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果は、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独と同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５ ＶＬＰと同等であり、同じ用量でのＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４ ＶＬＰがＨＰＶ１６とＨＰＶ３５に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
Figure 0007224332000045
マウスにおけるＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰでの免疫化後の血清中の中和抗体の力価の評価
この実験では、免疫化プロトコルを表１６に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：１０μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１０μｇであった）、１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１μｇであった）、及び０．１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して０．１μｇであった）。各群は６つのサブグループに細分し、対照サブグループ１、２、及び３は、それぞれ、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独を用いて免疫化し、対照サブグループ４は、混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰで免疫化し、実験サブグループはＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰ単独で免疫化した。
サブグループあたり６匹のマウスを腹腔内注射により免疫化し、免疫化用量は１０μｇ、１μｇ、０．１μｇであり、注射量は１ｍｌであった。すべてのマウスは、最初０週で免疫化し、追加免疫をそれぞれ２週と４週で行った。血液サンプルをマウスから８週目で眼窩出血を介して採取し、血清中のＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する抗体の力価を分析した。分析の結果を図８Ｄ～８Ｆに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰがマウスにおけるＨＰＶ１６に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果はＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独又は同じ用量でＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；それはマウスでＨＰＶ３５に対する中和抗体の高力価を誘導し、その防御効果はＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ＶＬＰ単独又は同じ用量でのＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独よりも有意に優れており；それはマウスにおけるＨＰＶ３１に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果はＨＰＶ３１ ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１ ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ ＶＬＰ単独又は同じ用量でのＨＰＶ３５ ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３ ＶＬＰがＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
Figure 0007224332000046
本発明の特定の実施形態を詳細に説明してきたが、当業者は、本発明の詳細の様々な修正及び変更を全ての開示の教示に照らして行うことができ、これらのすべての修正及び変更が本発明の範囲内にあることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によって与えられる。
配列番号４ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１
配列番号５ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２
配列番号６ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３
配列番号７ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４
配列番号８ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５
配列番号９ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１
配列番号１０ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２
配列番号１１ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３
配列番号１２ ＜２２３＞ Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５
配列番号１３ ＜２２３＞ 配列番号１をコードするＤＮＡ配列
配列番号１４ ＜２２３＞ 配列番号２をコードするＤＮＡ配列
配列番号１５ ＜２２３＞ 配列番号３をコードするＤＮＡ配列
配列番号１６ ＜２２３＞ 配列番号４をコードするＤＮＡ配列
配列番号１７ ＜２２３＞ 配列番号５をコードするＤＮＡ配列
配列番号１８ ＜２２３＞ 配列番号６をコードするＤＮＡ配列
配列番号１９ ＜２２３＞ 配列番号７をコードするＤＮＡ配列
配列番号２０ ＜２２３＞ 配列番号８をコードするＤＮＡ配列
配列番号２１ ＜２２３＞ 配列番号９をコードするＤＮＡ配列
配列番号２２ ＜２２３＞ 配列番号１０をコードするＤＮＡ配列
配列番号２３ ＜２２３＞ 配列番号１１をコードするＤＮＡ配列
配列番号２４ ＜２２３＞ 配列番号１２をコードするＤＮＡ配列
配列番号２５ ＜２２３＞ 野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基の配列
配列番号２６ ＜２２３＞ 野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置５０～６２のアミノ酸残基の配列
配列番号２７ ＜２２３＞ 野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１２７～１４２のアミノ酸残基の配列
配列番号２８ ＜２２３＞ 野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１８２のアミノ酸残基の配列
配列番号２９～６０ ＜２２３＞ プライマー

Claims (18)

  1. 変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質であって、変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質が野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパクと比較して以下の変異を有する変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質：
    （１）４～５０個のアミノ酸のＮ末端切断；及び
    （２）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２９２～３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
  2. 変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質にはさらに以下の変異がある、請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質：
    （３）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置７６～８７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
    （４）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置１５２～１６７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；又は
    （５）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の位置２０２～２０７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
  3. 変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質が、野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパクと比較して、４、６、８、１０、２０、３０、又は４０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する、請求項１又は２に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質。
  4. （２）に記載される対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質の位置２６６～２８８のアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質。
  5. 変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質が以下の項目：
    （ａ）（３）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置５０～６２のアミノ酸残基である、
    （ｂ）（４）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１２７～１４２のアミノ酸残基である、
    （ｃ）（５）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の位置１７７～１８２のアミノ酸残基である、
    の一つ以上を特徴とする、請求項２に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質。
  6. 変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質が以下の項目：
    １）野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する，
    ２）野生型ＨＰＶ３５ Ｌ１タンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する，
    ３）野生型ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する，
    の一つ以上を特徴とする、請求項１又は２に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質。
  7. 変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質は配列番号７、９、１０、１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質をコードする単離された核酸。
  9. 請求項８に記載の単離された核酸を含むベクター。
  10. 請求項８に記載の単離された核酸及び／又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項１～７のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を含む又はからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
  12. 請求項１～７のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、又は請求項８に記載の単離された核酸、又は請求項９に記載のベクター、又は請求項１０に記載の宿主細胞、又は請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物。
  13. 請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子、及び必要に応じてさらに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチン。
  14. 請求項１～７のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を調製する方法であって、宿主細胞内で変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を発現させ、次いで宿主細胞の培養物から変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質を回収することを含む、上記方法。
  15. 宿主細胞は大腸菌である、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンの調製方法。
  17. ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、又は請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子。
  18. ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及びＨＰＶ３１感染のうちの一つ以上から選択され；及び／又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、請求項１７に記載の変異ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、又はＨＰＶウイルス様粒子。
JP2020501525A 2017-07-14 2018-07-13 ヒトパピローマウイルス１６型のｌ１タンパク質の変異体 Active JP7224332B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710573731.9 2017-07-14
CN201710573731 2017-07-14
PCT/CN2018/095632 WO2019011331A1 (zh) 2017-07-14 2018-07-13 一种人乳头瘤病毒16型l1蛋白的突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020526223A JP2020526223A (ja) 2020-08-31
JP7224332B2 true JP7224332B2 (ja) 2023-02-17

Family

ID=65002371

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020501525A Active JP7224332B2 (ja) 2017-07-14 2018-07-13 ヒトパピローマウイルス１６型のｌ１タンパク質の変異体

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11213580B2 (ja)
EP (1) EP3653638A4 (ja)
JP (1) JP7224332B2 (ja)
KR (1) KR102567627B1 (ja)
CN (1) CN109251235B (ja)
BR (1) BR112020000833A2 (ja)
WO (1) WO2019011331A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114127097A (zh) * 2019-07-19 2022-03-01 神州细胞工程有限公司 嵌合的人乳头瘤病毒56型l1蛋白
CN114364692B (zh) * 2019-07-19 2024-03-29 神州细胞工程有限公司 嵌合的乳头瘤病毒l1蛋白

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001506485A (ja) 1996-10-04 2001-05-22 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 合成ｈｐｖ１６ウイルス様粒子
US20020168372A1 (en) 1993-07-16 2002-11-14 Matthias Durst Dna sequence encoding a papillomavirus l1 protein capable of efficiently forming virus-like particles
US20040081661A1 (en) 1998-02-20 2004-04-29 Medigene Ag Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
EP2154147A1 (en) 2007-04-29 2010-02-17 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. A truncated l1 protein of human papillomavirus 16

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2229955C (en) 1998-02-20 2003-12-09 Medigene Gmbh Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
US6689366B1 (en) 1998-12-17 2004-02-10 Merck & Co., Inc. Synthetic virus like particles with heterologous epitopes
CN101148661B (zh) * 2006-09-18 2013-01-02 中国医学科学院基础医学研究所 人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途
WO2009055491A2 (en) 2007-10-22 2009-04-30 University Of Rochester Respiratory syncytial virus vaccine based on chimeric papillomavirus virus-like particles or capsomeres
CN101518647A (zh) 2008-02-29 2009-09-02 江阴艾托金生物技术有限公司 人乳头瘤病毒预防性疫苗、构建方法及应用
CN107080833A (zh) * 2009-04-10 2017-08-22 约翰·霍普金斯大学 作为广谱人类乳头状瘤病毒（hpv）疫苗的乳头状瘤病毒样颗粒（vlp）
JP2012530505A (ja) * 2009-06-25 2012-12-06 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）タンパク質構築物及びｈｐｖ疾患の予防におけるそれらの使用
EP2377879A1 (en) 2010-04-14 2011-10-19 Deutsches Krebsforschungszentrum N-terminal HPV E7 fusion proteins
CN102747047B (zh) * 2012-02-28 2016-03-23 厦门大学 人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒及其制备方法
CN105175538B (zh) * 2012-06-08 2019-01-08 厦门大学 抗hpv l1 蛋白的广谱单克隆抗体或其抗原结合片段及它们的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020168372A1 (en) 1993-07-16 2002-11-14 Matthias Durst Dna sequence encoding a papillomavirus l1 protein capable of efficiently forming virus-like particles
JP2001506485A (ja) 1996-10-04 2001-05-22 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 合成ｈｐｖ１６ウイルス様粒子
US20040081661A1 (en) 1998-02-20 2004-04-29 Medigene Ag Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs
EP2154147A1 (en) 2007-04-29 2010-02-17 Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. A truncated l1 protein of human papillomavirus 16

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A human monoclonal antibody against HPV16 recognizes an immunodominant and neutralizing epitope partially overlapping with that of H16.V5，Scientific Reports，2016年，Vol.6, article No.19042，p.1-12
Hybrid papillomavirus L1 molecules assemble into virus-like particles that reconstitute conformational epitopes and induce neutralizing antibodies to distinct HPV types，Virology，2001年，Vol.291，p.324-334
Identification of a Human Papillomavirus Type 16-Specific Epitope on the C-Terminal Arm of the Major Capsid Protein L1，JOURNAL OF VIROLOGY，2003年，Vol.77, No.21，p.11625-11632

Also Published As

Publication number Publication date
KR102567627B1 (ko) 2023-08-17
BR112020000833A2 (pt) 2020-07-21
US20210000938A1 (en) 2021-01-07
WO2019011331A1 (zh) 2019-01-17
EP3653638A4 (en) 2021-05-05
US11213580B2 (en) 2022-01-04
CN109251235A (zh) 2019-01-22
EP3653638A1 (en) 2020-05-20
JP2020526223A (ja) 2020-08-31
KR20200035963A (ko) 2020-04-06
CN109251235B (zh) 2021-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10940194B2 (en) Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 58
EP3385274B1 (en) Mutant of human papillomavirus type 11 l1 protein
US11427618B2 (en) Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 39
CN109251236B (zh) 一种人乳头瘤病毒35型l1蛋白的突变体
JP7224332B2 (ja) ヒトパピローマウイルス１６型のｌ１タンパク質の変異体
JP7290258B2 (ja) ヒトパピローマウイルス５１型のｌ１タンパク質の変異型
JP7265563B2 (ja) ヒトパピローマウイルス１８型のｌ１タンパク質の変異体
JP7337352B2 (ja) ヒトパピローマウイルス６６型のｌ１タンパク質の変異体
CN110950936B (zh) 一种人乳头瘤病毒69型l1蛋白的突变体

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200317

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210712

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220523

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220629

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220928

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20220928

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230118

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230207

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7224332

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150