CN116041445B - 一种人乳头瘤病毒51型l1蛋白突变体及减少重组蛋白降解的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药生物领域，公开一种人乳头瘤病毒51型L1蛋白突变体及其减少重组人乳头瘤病毒51型L1蛋白降解的方法及应用。本发明采用基因工程技术对HPV51L1氨基酸序列的第422位R突变为T或Q的改造成功解决了其降解的问题。实验表明，所做突变均不影响对应突变后L1蛋白的表达，且改造后VLP蛋白的降解比例明显减少，也不影响对应VLP的免疫原性。因此，本发明通过对人乳头瘤病毒51型L1蛋白突变改造后避免了其降解问题，降低了制造难度，改善了质量性状，使得重组表达改造后序列并组装所获对应HPV51L1‑VLP更适合作为预防该型乳头瘤病毒感染的疫苗抗原蛋白。

Description

一种人乳头瘤病毒51型L1蛋白突变体及减少重组蛋白降解的 方法及应用

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体涉及人乳头瘤病毒L1蛋白的表达方法。更具体涉及人乳头瘤病毒51型L1蛋白突变体及其减少重组人乳头瘤病毒51型L1蛋白降解的方法及应用。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一类无包膜的双链DNA 病毒，其通过黏膜和皮肤微创感染上皮组织基底层细胞，引起上皮组织的良性或恶性增生性病变。高危型HPV的慢性持续性感染是诱发宫颈癌的主要病因。目前超过200多种HPV亚型被鉴定出来（http://www.hpvcenter.se/html/refclones. html）。根据World HealthOrganization（WHO）发布的人乳头瘤病毒及其相关疾病的2019年总结报告（全球）和人乳头瘤病毒及其相关疾病的2019年总结报告（中国），目前确定与诱发宫颈癌相关的HPV高危型主要有以下13个：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68。

HPV的衣壳是一个由结构蛋白 L1和 L2 组成的正二十面体，直径约55 nm。目前利用真核细胞，酵母或大肠杆菌均有报道可有效表达L1蛋白，且在没有 L2 参与下72个 L1五聚体蛋白可自组装（self-assembly）形成病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLPs）。将前述VLPs作为抗原免疫后可诱导机体产生型别特异性中和抗体，有效保护机体免受同型别病毒的感染，这是目前宫颈癌预防疫苗开发的主要策略，且国内已有4款上市品种（Cervarix，Gardasil，Gardasil 9，Cecolin）。

HPV51型属于Alphapapillomavirus 6分支，为高危型之一。根据WHO发布的人乳头瘤病毒及其相关疾病的2019年总结报告（全球和中国），全球宫颈癌检测病例中HPV51亚型的检出率接近1%，中国接近0.4%。目前已上市疫苗品种中均未包含该型别，因此我们进行了重组表达HPV51L1蛋白并将其开发成为病毒样颗粒（VLP）疫苗的研究工作。

发明内容

基于大肠杆菌表达体系的HPV51L1工程菌在表达纯化过程中目的蛋白HPV51L1表现出了明显的降解情况。L1蛋白的降解影响了其作为抗原应用于预防对应型别乳头瘤病毒感染的疫苗产品中，该蛋白降解导致免疫原性下降，从而降低其作为疫苗组分用于预防病毒感染的药效。本发明人开展了HPV51L1降解问题的重点攻关工作。我们通过全面细致的质谱检测分析研究（具体研究内容包括全长及降解L1蛋白电泳条带胶内酶解，N/C端测序，氨基酸覆盖率及肽段丰度对比分析等）发现：HPV51L1蛋白的降解位点为422位的精氨酸（R），而在现已报道的HPV51L1蛋白中，几乎全部具有R422这一序列特征，我们的结构模拟分析显示R422位于L1五聚体结构的表面。精氨酸是胰蛋白酶的水解位点。胰蛋白酶特异性作用于碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键，且特异性很强。因此在重组蛋白表达过程中，HPV51L1蛋白在胰蛋白酶的作用下容易在422位精氨酸的羧基端产生了酶解断裂。

基于我们的前述结果，为解决L1蛋白降解问题，本发明人尝试用如下理化及结构特征不同的氨基酸替换422位的精氨酸（R）：丙氨酸（A）、天冬氨酸（N）、苏氨酸（T）、天冬氨酸（D）、亮氨酸（L）、丝氨酸（S）、苯丙氨酸（F）、谷氨酰胺（Q）、组氨酸（H）。。结果显示：将HPV51L1蛋白第422位精氨酸（R）分别替换为苏氨酸（T）和谷氨酰胺（Q）这两种种重组表达的蛋白突变体，其降解显著低于未突变的野生型序列，且不影响L1五聚体进一步组装成VLP。从而，通过对HPV51L1蛋白422位精氨酸的改造我们成功解决了该蛋白的降解问题，由此完成本发明。

本发明提供一种人乳头瘤病毒51型L1蛋白突变体，其由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列所编码的收氨基酸序列的第422位精氨酸替换为苏氨酸或谷氨酰胺。

本发明也提供所述的突变体的编码核酸。优选地，基于SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的第1264-1266位3个碱基替换为ACC；或者第1265-1266位碱基替换为AG。

本发明还提供所述的编码核酸的表达载体，优选地其为原核表达载体，更优选为大肠杆菌表达载体。进一步优选地，其为诱导表达载体。更优选地，出发载体为pKL1质粒。

本发明进一步提供含有所述的表达载体的重组菌，优选地，其为原核细胞，更优选为大肠杆菌。更优选地，其为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供一种制备如人乳头瘤病毒51型L1蛋白的方法，其包括培养所述的重组菌，和分离得到人乳头瘤病毒51型L1蛋白的步骤。

进一步，还包括纯化人乳头瘤病毒51型L1蛋白的步骤，具体是依次采用CHT层析柱、G25脱盐换液层析柱、Source15Q阴离子交换层析柱和分子筛层析柱进行纯化。

本发明进而提供一种HPV51L1-VLP的制备方法，其将所述得到的纯化人乳头瘤病毒51型L1蛋白与组装液进行混合静置得到，更具体地，将其与组装液按4：1的体积比混合，室温静置1 h完成组装；优选地，所述组装液为400~600mM NaAc-HAc，2.0~5.0 M NaCl，0.05-0.5% Tween 80，pH4.7~6.0。

本发明经实验验证，采用基因工程技术对HPV51L1氨基酸序列进行了422位R突变为T或Q的改造成功解决了其降解的问题。前述2种改造前后各目的蛋白在表达体系中均可有效表达且大部分为可溶表达，表达量上也无明显差异，说明HPV51L1氨基酸序列上422位R突变为T或Q均不影响对应突变后L1蛋白的表达。采用相同纯化工艺制备所得最终原液的电泳结果显示：与改造前HPV51L1-VLP蛋白相比，改造后HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白的降解比例明显减少，说明HPV51L1氨基酸序列上422位R突变为T或Q的策略成功解决了该型L1蛋白的降解问题。DLS检测结果显示：改造前后三种L1蛋白组装后均可获得直径为44-65nm的病毒样颗粒（VLP）。小鼠免疫实验中和抗体滴度检测结果显示：改造前后目的蛋白引起的中和抗体滴度水平无明显差异，说明HPV51L1氨基酸序列上422位R突变为T或Q的改造也不影响对应VLP的免疫原性。

参照《中国药典》及发明人的产品质控标准：重组蛋白纯度应不低于95%，降解比例应不高于5%。突变改造前野生型HPV51L1蛋白纯化后降解比例大于15%，这使得用大肠杆菌重组表达并纯化获得符合前述要求的药用级别HPV51L1-VLP的难度十分巨大。野生型HPV51L1序列也难以应用于预防该型乳头瘤病毒感染的疫苗产品中。突变改造后避免了其降解问题，降低了制造难度，改善了质量性状，使得重组表达改造后序列并组装所获对应HPV51L1-VLP更适合作为预防该型乳头瘤病毒感染的疫苗抗原蛋白。

附图说明

图1 pKL1-HPV51L1t和pKL1-HPV51L1q质粒酶切鉴定电泳图。其中，M为1kb DNAMarker；1为pKL1-HPV51L1t NdeI+XhoI；2为pKL1-HPV51L1t NdeI；3为pKL1-HPV51L1tXhoI；4为pKL1-HPV51L1q NdeI+XhoI；5为pKL1-HPV51L1q NdeI；6为pKL1-HPV51L1q XhoI。

图2 小摇瓶表达检测电泳图。其中，其中，M为蛋白Marker；1为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t 未诱导阴性对照；2为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t全菌；3为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t上清；4为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t沉淀；5为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q 未诱导阴性对照；6为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1 q全菌；7为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q上清；8为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q沉淀；9为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1未诱导阴性对照；10为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1全菌；11为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1上清；12为BL21(DE3) pKL1-HPV51L1沉淀； 13为HPV51L1阳性对照。

图3 HPV51L1-VLP，HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白原液SDS-PAGE电泳图。其中，A：HPV51L1-VLP，B：HPV51L1t-VLP，C：HPV51L1q-VLP。

图4 改造前后各蛋白DLS检测粒径大小分布柱状图。

图5 改造前后各蛋白原液的免疫原性检测-中和抗体滴度值柱状图。其中，HPV51L1-VLP为利用野生型L1序列制造的VLP疫苗；HPV51L1t-VLP为L1-R422T突变序列制造的VLP疫苗；HPV51L1q-VLP为L1-R422Q突变序列制造的VLP疫苗。AH为仅注射铝佐剂阴性对照。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案做进一步的详细说明。

实验材料和实验方法

实验材料

pKL1为本公司构建的表达载体，其序列见SEQ ID NO：1。

pKL1-HPV51L1为将HPV51L1基因克隆到pKL1的NdeI/XhoI位点获得的野生型HPV51L1表达载体。

突变PCR引物（引物序列如下表所示）委托金唯智生物科技有限公司进行合成。dNTP，DNA聚合酶，限制性内切酶，T4 DNA连接酶采购自NEB公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，质粒小提试剂盒，TOP10感受态细胞，BL21（DE3）感受态细胞采购自天根生化科技有限公司。

实验方法

突变基因表达载体构建及菌种制备

通过分子克隆的方法设计合成引物，以pKL1-HPV51L1为模板分别通过突变PCR扩增422位精氨酸（R）替换为苏氨酸（T）和谷氨酰胺（Q）的突变质粒。所得突变质粒经NdeI和XhoI酶切后电泳，然后切胶回收HPV51L1t和HPV51L1q目的基因片段。接着将2个目的基因片段分别与同样经NdeI和XhoI酶切后电泳切胶回收的pKL1载体片段进行连接，连接产物转化TOP10感受态细胞。转化平板上挑克隆培养后送测序筛选出阳性克隆。阳性克隆扩繁后提取质粒，质粒经酶切鉴定大小正确后进一步转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，获得对应的表达工程菌菌种BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t（R422T）和BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q（R422Q），菌种于-80℃超低温保存箱中保存备用。

改造前后菌种小摇瓶表达情况检测

从-80℃冰箱中取出BL21(DE3) pKL1-HPV51L1（改造前），BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t （R422T改造后）和BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q（R422Q改造后）菌种，解冻后各取20µl分别接种至40 ml LB培养基进行过夜活化（37℃，220 rpm，16 h），然后各取200µl活化菌液分别转接至40 ml 2YT培养基进行培养（30℃，220 rpm，7 h），最后添加终浓度0.2 mMIPTG开始过夜诱导（30℃，220 rpm，16 h）。注：每个菌种加一个未加诱导剂的阴性对照。小摇瓶发酵结束后，收集菌体分别进行超声破碎，然后分别取对应全菌，破碎离心上清，破碎离心沉淀进行SDS-PAGE电泳检测（电泳条件：胶浓度10%，先150 V恒压15 min后200 V恒压跑至前沿刚好跑出，考马斯亮蓝染色，沸水脱色，拍照记录电泳结果），根据电泳结果分析对应目的蛋白的表达情况并比较改造前后表达量是否存在差异。

新菌种大摇瓶发酵

从-80℃超低温保存箱中取出BL21(DE3) pKL1-HPV51L1，BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t和BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q菌种，解冻后取20 µl接种至40 ml LB培养基进行过夜活化（37℃，220 rpm，16 h），然后取4 ml活化菌液转接至800 ml 2YT培养基进行培养（30℃，220 rpm，7 h），最后添加终浓度0.2 mM IPTG开始过夜诱导（30℃，220 rpm，16 h）。发酵结束后用4℃，4500 rpm，25 min离心收集菌体，所得菌体于-80℃超低温保存箱中保存备用。

改造前后目的蛋白纯化

取大摇瓶发酵BL21(DE3) pKL1-HPV51L1，BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t，BL21(DE3)pKL1-HPV51L1q菌体，按菌体（g）：破菌Buffer（ml）=1:4的比例，加入对应体积的破菌Buffer（5~50mMPB，5~30mM DTT，pH8.0）充分重悬。然后用高压匀质机破碎菌体：破菌压力为800bar，循环破碎3次。破菌液经4℃，12000rpm离心60min收集上清，上清稀释2倍后用于下一步CHT层析。

CHT层析柱（羟基磷灰石Ⅱ型层析柱，柱体积CV：10 ml，限压：≤0.3 MPa）提前用CHT平衡 Buffer（5~50 mM PB，5~30mM mM DTT，pH8.0）充分平衡。然后取上一步稀释后上清上样至平衡好的层析住，收集上样流穿。上样完成后用CHT淋洗Buffer（5~50mM PB，20 mMDTT，pH7.0）淋洗8个CV至UV基线平。淋洗完成后开始洗脱，用0-100% CHT洗脱Buffer（400mM PB，5~30mM DTT，pH8.0），10个CV进行线性洗脱，分管收集各洗脱组分，合并收集目的蛋白所在组分用于下一步G25脱盐换液。

G25脱盐换液层析柱（G25，柱体积CV：70 ml，限压：≤0.3 Mpa）提前用换液Buffer（5 mM PB，5~30mM DTT，pH8.0）充分平衡，然后取上一步CHT层析收集样品上样至平衡好的层析柱。上样完成后用换液Buffer进行洗脱，根据色谱图收集目的蛋白所在组分，用于下一步Source15Q阴离子交换层析。

Source15Q阴离子交换层析柱（Source 15Q，柱体积CV：5 ml，限压：≤0.3 MPa）提前用SQ-A Buffer（5 mM PB，5~30mM DTT，pH8.0）充分平衡。然后取上一步G25脱盐换液层析收集样品上样至平衡好的层析住，收集上样流穿。上样完成后，用SQ-A Buffer淋洗8个CV至UV基线平。淋洗完成后开始洗脱，先用0-20% SQ-B Buffer（5 mM PB，1 M NaCl，5~30mMDTT，pH8.0），10个CV进行线性洗脱，最后用100% SQ-B Buffer进行洗脱，分管收集各洗脱组分，电泳确定目的蛋白所在组分后合并前述组分，用于下一步分子筛层析。

分子筛层析柱（Superdex 200，柱体积CV：120 ml，限压：≤0.3 Mpa）提前用分子筛Buffer（5~50mM PB，130 mM NaCl，1~10mM DTT，pH8.0）充分平衡，然后取上一步Source15Q层析收集样品上样至平衡好的层析柱。上样完成后用分子筛Buffer进行洗脱，根据色谱图收集目的蛋白所在组分，用于下一步组装。

取上一步分子筛层析收集目的蛋白，根据其体积，按L1蛋白：组装液 = 4：1的体积比，加入对应体积的组装液（400~600mM NaAc-HAc，2.0~5.0 M NaCl，0.05~0.5% Tween 80，pH4.7~6.0），混匀后于室温静置1 h完成组装。组装后进行DLS（Dynamic LightScattering，动态光散射）检测，确认VLP组装效果良好后，用于下一步G25换液。

G25脱盐换液层析柱（G25，柱体积CV：40 ml，限压：≤0.3 Mpa）提前用换液Buffer（20 mM NaAc-HAc，400~600mM NaCl，0.001-0.1%Tween-80，pH5.0）充分平衡，然后取上一步组装后样品上样至平衡好的层析柱。上样完成后用换液Buffer进行洗脱，根据色谱图收集目的蛋白所在组分，该组分即为纯化最终所得HPV51L1-VLP，HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白原液，将其于-80℃超低温保存箱中保存备用。

取HPV51L1-VLP，HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白原液进行电泳检测，确认改造前后L1蛋白的降解情况。取各组装后样品及各换液后蛋白原液进行DLS检测，确认改造前后L1蛋白自组装成VLP的状态。取各蛋白原液进行小鼠体内免疫原性检测（6-8周雌性BALB/c小鼠，肌肉注射，1µg蛋白原液+25µg自制铝佐剂/只，1个样品免10只，分别于1免2周，1免4周和1免6周进行眼眶采血，收集血清进行中和抗体检测，检测方法为基于假病毒的HPV中和抗体检测方法），确认改造前后对应VLP样品对免疫原性的影响。

实验结果与讨论

改造后质粒酶切鉴定

取构建成功的改造后pKL1-HPV51L1t和pKL1-HPV51L1q质粒，分别用NdeI和XhoI进行单酶切和双酶切，将酶切后各样品上样至1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果见图1。

根据酶切鉴定电泳结果，结合表1中所示载体片段，目的基因片段及质粒大小，分析认为改造后pKL1-HPV51L1t和pKL1-HPV51L1q质粒大小与理论值相符且纯度较高，可用于后续转化BL21(DE3)感受态细胞制备对应表达工程菌。

表1 载体片段，目的基因片段及质粒大小汇总表

改造前后菌种小摇瓶表达情况检测

取小摇瓶发酵收集BL21(DE3) pKL1-HPV51L1，BL21(DE3) pKL1-HPV51L1t，BL21(DE3) pKL1-HPV51L1q菌体分别进行超声破碎，然后分别取对应全菌，破碎离心上清，破碎离心沉淀进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果见图2。

电泳结果显示：改造前后各目的蛋白HPV51L1，HPV51L1t和HPV51L1q在BL21(DE3)pKL1表达体系中均可有效表达且大部分为可溶表达，表达量上也无明显差异，说明HPV51L1氨基酸序列上422位R突变为T或Q均不影响对应突变后L1蛋白的表达。

改造前后各蛋白原液SDS-PAGE电泳检测

取纯化所得HPV51L1-VLP，HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白原液分别进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果见图3。分析得HPV51L1蛋白纯度为：84.96%，降解比例为：15.04%。HPV51L1t蛋白纯度为：99.26%，降解比例为：0.47%。HPV51L1q蛋白纯度为：99.03%，降解比例为：0.68%。

电泳结果显示：与改造前HPV51L1-VLP蛋白相比，改造后HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白的降解比例明显减少，说明HPV51L1氨基酸序列上422位R突变为T或Q的策略成功解决了该型L1蛋白的降解问题。

改造前后VLP组装结果DLS检测

取各组装后HPV51L1-VLP，HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP样品以及对应换液后各蛋白原液进行DLS检测，结果见表2。其中各样品粒径大小分布参见图4。

表2 改造前后各蛋白DLS检测结果汇总表

DLS检测结果显示：改造前后三种L1蛋白组装后均可获得直径为54-65nm的病毒样颗粒（VLP）。

改造前后各蛋白原液的免疫原性检测

取改造前后各HPV51L1-VLP，HPV51L1t-VLP和HPV51L1q-VLP蛋白原液和自制铝佐剂分别稀释后按比例混合，然后按实验方法中所述进行小鼠免疫，采血以及中和抗体检测，1免2周，1免4周和1免6周对应血清中的中和抗体滴度检测结果见图5。

小鼠免疫实验中和抗体滴度检测结果显示：改造前后目的蛋白引起的中和抗体滴度水平无明显差异，说明HPV51L1氨基酸序列上422位R突变为T或Q的改造不影响对应VLP的免疫原性。

Claims (18)

1.一种人乳头瘤病毒51型L1蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为由SEQ ID NO：2所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列的第422位精氨酸替换为苏氨酸或谷氨酰胺。

2.如权利要求1所述的突变体的编码核酸。

3.如权利要求2所述的编码核酸，其特征在于，所述编码核酸的核苷酸序列为基于SEQID NO：2所示核苷酸序列的第1264-1266位3个碱基替换为ACC；或者第1265-1266位碱基替换为AG。

4.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，其为原核表达载体。

6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，其为大肠杆菌表达载体。

7.如权利要求6所述的表达载体，其为诱导表达载体。

8.如权利要求7所述的表达载体，其特征在于，出发载体为pKL1质粒。

9.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于，pKL1质粒核苷酸如SEQ ID NO：1所示。

10.含有如权利要求4至9任一项所述的表达载体的重组菌。

11.如权利要求10所述的重组菌，其特征在于，其为原核细胞。

12.如权利要求11所述的重组菌，其特征在于，其为大肠杆菌。

13.如权利要求11所述的重组菌，其特征在于，其为大肠杆菌BL21(DE3)。

14.一种制备如人乳头瘤病毒51型L1蛋白的方法，其特征在于，包括培养如权利要求10至13任一项所述的重组菌，和分离得到人乳头瘤病毒51型L1蛋白的步骤。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括纯化人乳头瘤病毒51型L1蛋白的步骤。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述纯化人乳头瘤病毒51型L1蛋白的步骤是依次采用CHT层析柱、G25脱盐换液层析柱、Source15Q阴离子交换层析柱和分子筛层析柱进行纯化。

17.一种HPV51L1-VLP的制备方法，其特征在于，将权利要求14至16任一项所述方法得到的人乳头瘤病毒51型L1蛋白与组装液进行混合静置得到；

所述组装液为400~600mM NaAc-HAc，2.0~5.0 M NaCl，0.05~0.5% Tween 80，pH4.7~6.0。

18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述得到的人乳头瘤病毒51型L1蛋白与组装液按4：1的体积比混合，室温静置1 h完成组装。