CN104045695A

CN104045695A - 重组的人乳头瘤病毒18型l1蛋白及其用途

Info

Publication number: CN104045695A
Application number: CN201310696226.5A
Authority: CN
Inventors: 刘永江; 陈小江; 陈林; 盖大海; 许铮; 曹科; 陈建平; 潘勇昭; 银飞; 阮芳勇
Original assignee: BEIJING HEALTH GUARD BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING HEALTH GUARD BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: CN104045695B

Abstract

本发明重组的人乳头瘤病毒18型L1蛋白及其用途，提供一种新的编码重组的HPV18 L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV18 L1蛋白五聚体和由该五聚体组成的抗HPV18型感染的尖锐湿疣疫苗。

Description

重组的人乳头瘤病毒18型L1蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及人类乳头状瘤病毒感染的预防和/或治疗。更具体而言，本发明涉及一种重组的人乳头瘤病毒18型L1蛋白，及由其组成的五聚体，含该蛋白的疫苗及其在预防HPV18型病毒感染，特别是在预防HPV18型病毒感染引起的宫颈癌疾病中的用途。

背景技术

人类乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus,简称HPV)是通过密切接触而传播的DNA病毒。在人体组织中,HPV主要感染皮肤和黏膜组织。HPV可分为高危险型和低危险型两种，长期持续感染高危型可以致癌，如宫颈癌，危害生命。低危型HPV可导致生殖器病变，如尖锐湿疣，影响生活质量。宫颈癌是女性第二大恶性肿瘤,每年全球的发病大概在54万(2013年),约有24万例死亡,幸运的是,宫颈癌是唯一研制出疫苗的癌症。2006 年6月8日,美国食品与药品管理局(FDA)正式批准美国Merck公司(即默沙东公司)生产的 Gardasil HPV 预防性疫苗上市；它是由酿酒酵母表达并纯化的HPV16/18/6/11 L1 VLP 四价宫颈癌预防性疫苗，被批准用于预防 6~ 26岁女孩和妇女 HPV16、18、6、11型感染所引起的宫颈癌、癌前病变和生殖器疣，这是FDA通过的世界上第一个肿瘤疫苗(Villa, Costa et al. 2005, Villa, Ault et al. 2006, Bryan 2007, Olsson, Villa et al. 2007, Goldstone and Vuocolo 2012)。随后英国葛兰素史克(GSK)公司生产的商品名为Cervarix的 HPV 预防性疫苗也成功上市，它是由来源于昆虫表达系统的 HPV16/18 L1 VLP 二价宫颈癌预防性疫苗。但这两种预防性疫苗价格昂贵，极大限制了在发展中国家和落后地区的使用，因此开发一种低成本的高效价HPV疫苗就显得尤为重要(Jansen and Shaw 2004, Buonaguro, Tornesello et al. 2009, Campo and Roden 2010, Frazer, Leggatt et al. 2011, Hariri, Dunne et al. 2011, Lehtinen and Dillner 2013, Shaw 2013)。

HPV属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域：早期区(E)，约4. 5kb，编码E1、E2、E4～E7共6个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；晚期区(L)，约2. 5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制、表达调控元件。

HPV病毒颗粒直径为55～60nm，核衣壳呈20面体对称，由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体及次要衣壳蛋白L2组成。大量研究证实，HPV L1蛋白是HPV疫苗的主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-L1keParticle，VLP)。重组HPV L1-VLP疫苗已经成功上市并用于预防HPV感染及由此导致的宫颈癌、尖锐湿疣等疾病，并充分证明了L1-VLP具有与野生同型病毒相同的抗原性和免疫原性。从组成VLP的三级结构看，其抗原决定簇均分布于组成VLP的基本结构单元五聚体的表面（Xiaojiang S. Chen,Robert L. Garcea, Ilya Goldberg ,Gregory Casini and Stephen C.(2000) . HarrisonStructure of Small Virus-like Particles Assembled from the L1 Protein of Human Papillomavirus 16.Molecular Cell, Vol. 5, 557–567.Brooke Bishop, Jhimli Dasgupta, Michael Klein, Robert L. Garcea, Neil D. Christensen, Rui Zhaoand Xiaojiang S. Chen.(2007). Crystal Structures of Four Types of Human Papillomavirus L1 Capsid Proteins. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 282, NO. 43, pp. 31803–31811），说明HPV L1-VLP的抗原性和免疫原性来源于或取决于L1组成的五聚体。因此，重组L1蛋白五聚体与VLP一样具备完整的抗原表位，也可以作为抗原用来制备疫苗。

HPV疫苗研制的关键是能够大量高效制备HPV L1蛋白。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化即可获得VLP。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1 蛋白已有报道。但是由于大肠杆菌所表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV 的保护抗体。或者上述蛋白虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV L1全长序列蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大，依然无法应用于大规模生产。

因此，本领域仍然需要成本低、纯度高、产量高、效果好的HPV L1蛋白生产技术和大规模工业化生产预防宫颈癌疫苗的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的HPV18 L1蛋白，及由其组成的五聚体蛋白颗粒及含该五聚体蛋白颗粒的疫苗。

本发明涉及提供一种新的编码重组的HPV18 L1蛋白的多核苷酸基因片段、包含该基因片段的载体、包括载体的宿主细胞，以及由该基因片段翻译表达的HPV18 L1蛋白五聚体和由该五聚体组成的抗HPV18型感染的疫苗。

本发明公开了一种重组的HPV18 L1蛋白的氨基酸序列，所述蛋白的氨基酸序列在N端8-15个氨基酸全部或任意部分被2-10个氨基酸序列所取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式；H4结构域被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式。

本发明涉及的HPV18 L1蛋白，进一步是其氨基酸序列C端截短0个、1个、2个至21个氨基酸。

本发明所述的HPV18 L1蛋白，优选的被其氨基酸序列N端前8-15个氨基酸被GSGGG、ASASG或GSGAG取代，H4结构域优选的被GGGSG或GAGAS取代。

如实施例所述的HPV18 L1蛋白，优选其氨基酸序列在N端前8、10、12或15个氨基酸优选被GSGGG或ASASG氨基酸序列取代。C端优选截短10-21个氨基酸，更优选截短10个、21个氨基酸。

如实施例所述的HPV18 L1蛋白，其序列包含序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10。

本发明公开一种编码蛋白的多核苷酸序列。本发明公开一种包含多核苷酸序列的基因的表达载体。本发明公开一种包含表达载体的细胞。

本发明公开一种HPV18 L1蛋白五聚体，该蛋白五聚体由五个HPV18 L1蛋白单体形成。

本发明公开一种HPV 疫苗，该疫苗包括HPV18 L1 蛋白五聚体和药用佐剂。

本发明公开一种HPV疫苗的制备方法，该方法为：

A. 克隆或合成重组HPV18 L1蛋白的基因片段；

B. 在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的HPV18 L1蛋白；

C. 纯化由HPV18 L1蛋白组成的五聚体；

D. HPV18 L1蛋白五聚体加入药用佐剂制成疫苗。

上述方法中步骤C的纯化优选利用亲和层析色谱纯化HPV18 L1融合标签蛋白。

本发明公开HPV疫苗在制备预防和/或治疗包括HPV18感染及导致疾病的药物中的应用。

本发明第一方面提供一种编码重组HPV18 L1蛋白的多核苷酸基因片段。

本发明第二方面提供了一种构建的表达载体，其包含本发明第一方面的编码重组HPV18 L1蛋白的多核苷酸基因片段。所述载体适合驱动异源DNA在细菌、昆虫或哺乳动物细胞中翻译表达HPV18 L1蛋白。在一个实施方案中，所述表达载体优选pGEX-6p-1或pGEX-4T-2。

本发明的第三方面提供了一种构建的工程菌细胞，该细胞包含本发明第一方面的多核苷酸基因片段，或第二方面的表达载体。所述的工程菌宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌，可以是真核细胞，例如酵母细胞，或者是昆虫细胞。

本发明第四方面提供了一种药用组合物，其包含本发明第一方面的多核苷酸基因片段，或第二方面构建的表达载体或第三方面的工程菌细胞以及表达产物HPV18 L1五聚体蛋白。

本发明同时提供了制备上述编码重组HPV18 L1蛋白的多核苷酸序列、表达载体构建、工程菌细胞转化和药用组合物的方法。

本发明获得HPV18 L1蛋白的方法，其包括在表达系统中表达重组的HPV18 L1蛋白及其五聚体，然后将含有该重组蛋白的裂解上清进行纯化处理。具体获得HPV18 L1蛋白五聚体的方法包括：

1. 从临床样本中克隆或人工合成编码HPV18 L1全长蛋白基因或截短蛋白基因的片段。

2. 在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的L1蛋白。

3. 纯化HPV18 L1重组蛋白。

在一个实施方案中，获得重组HPV18 L1蛋白的优选方法包括：

1. N端1-15个氨基酸全部或任意部分被GSGGG取代、H4结构域被GGGSG序列取代的HPV18 L1重组蛋白。

2. 在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的L1蛋白。

3. 纯化HPV18 L1重组蛋白。

在优选的实施例1方案中N端截短8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域被GGGSG序列取代，同时C端截短21个氨基酸，SEQ ID NO：2。

在一个优选的实施例2方案中N端截短8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域被GGGSG序列取代，同时C端截短10个氨基酸，SEQ ID NO：4。

在一个优选的实施例3方案中N端截短15个氨基酸被GSGAG取代，H4结构域被GAGSG序列取代，同时C端截短10个氨基酸，SEQ ID NO：6。

在一个优选的实施例4方案中N端截短15个氨基酸被ASASG取代，H4结构域被GGGSG序列取代，同时C端截短21个氨基酸，SEQ ID NO：8。

在一个优选的实施例5方案中N端截短8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域被GGGSG序列取代，同时C端保留不截短，SEQ ID NO：10。

在对比的实施例6方案中N端前8个氨基酸被GSGGG取代，H4结构域不取代，C端保留不截短。

本发明另提供了本发明药用组合物在制备预防或治疗HPV18型感染及导致疾病药物中的应用。

本发明还涉及一种预防宫颈癌或HPV感染的疫苗，其包含本发明重组的HPV18 L1五聚体，或者由五聚体组成的多聚体，包括1、2、 3、 4、 5……200个五聚体。优选该疫苗还包含至少一种选自HPV18 L1五聚体，HPV18 L1五聚体HPV18 L1五聚体，HPV31 L1五聚体，HPV33 L1五聚体，HPV45 L1五聚体，HPV52 L1五聚体，HPV58 L1五聚体，以及由上述五聚体组成的多聚体。该疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。

优选地，所述疫苗每剂含有本发明重组的HPV18 L1蛋白的量为1μg-200μg,优选5μg-50μg。所述疫苗含有本发明重组的HPV18 L1与HPV6 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗，重组的HPV18 L1与HPV11 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗，重组的HPV18 L1与HPV16 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗，重组的HPV18 L1与HPV31 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗，重组的HPV18 L1与HPV33 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗，重组的HPV18 L1与HPV45 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗, 重组的HPV18 L1与HPV52 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗, 重组的HPV18 L1与HPV58 L1按照0.5-2：1比例组成的疫苗,以及由重组的HPV18 L1五聚体与上述各型HPV L1五聚体组成的二价、三价、四价、五价、六价、七价疫苗或在此基础上进一步组合形成的九价疫苗。

本发明还涉及一种制备用于预防宫颈癌或HPV感染疫苗的方法，其包含本发明重组的HPV18 L1五聚体，或者由五聚体组成的多聚体与任选的一种或多种选自HPV18，16，18，31，33，45，52，和58的HPV型别的五聚体及疫苗用载体或者赋形剂混合。

本发明进一步涉及包含本发明重组的HPV18 L1五聚体，或者由五聚体组成的多聚体在制备用于预防宫颈癌或HPV18感染疫苗中的用途。

本发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌（菌株）与表达载体组成，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：GI698，ER2566，BL21 (DE3)，B834 (DE3)，BLR (DE3)等。

根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒，噬菌体，柯斯质粒等。

根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于：Tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，磷酸铝、无定型羟基磷酸硫酸铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱、疏水相互作用色谱、吸附层析法（例如羟基磷灰石色谱）、凝胶过滤（凝胶排阻）层析、亲和层析法。

根据本发明，术语“HPV18 L1 H4结构域”是指HPV18 L1 DNA序列中“FGVPP PPTTSLVDT

RFVQSVAITC QKDAAPA”，在Genebank登录号为ABP99791的L1序列中第466位氨基酸至497位，或其它HPV18 L1序列中与之对应的氨基酸位置。

根据本发明，在本发明获得的重组HPV18 L1蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。

根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；

根据本发明，在本发明获得的重组HPV18 L1蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCI、KCI、NH4CI、(NH4) 2S04中的一种或几种。优选NaCI。所用的还原剂包括但不限于DTT，2一巯基乙醇。所用量包括但不限于lOmM-lOOmM。

根据本发明，所述的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于注射或鼻腔或口腔吸入或者阴道给药，优选注射剂。

根据本发明，术语“价”是指组成疫苗的组分所包含的基因型的数量。举例来说HPV16和18型抗原组成的疫苗称为“二价”疫苗。

本发明人经研究发现，经过对HPV18 L1蛋白N端、C端和H4区域的基因重组，再利用大肠杆菌表达系统进行表达即可获得大量的重组GST-HPV18 L1五聚体融合蛋白，该GST-HPV18 L1五聚体蛋白经亲和层析纯化后可得到高产率的HPV18 L1五聚体蛋白，纯度至少85%以上。进一步纯化后的HPV18 L1五聚体蛋白可达到98%以上的纯度并可诱导针对HPV18 保护性抗体。本发明基于以上发明现已完成，为大规模工业化生产预防宫颈癌的疫苗提供了一种新方法。

本发明中在N端增加GSGGG或GSGAG，并且与GST蛋白相融合，可大大提高L1蛋白的可溶性，以及提高酶切效率，降低纯化成本，同时利用蛋白酶酶解方法切除GST蛋白，去除了外源杂质的引入；用GSGGG或GAGAS取代H4结构域，可以阻止L1五聚体蛋白进一步聚合，从而得到均一、稳定的五聚体蛋白，例如通过实施例12的实验，发现不同氨基酸序列组成的蛋白产物稳定性不同。其中序列H4结构域经过取代的蛋白产物与H4结构域未经取代的蛋白产物相比更稳定；C端截断氨基酸能够有效避免C端降解、减少由于蛋白降解而导致的产物不纯，从而影响五聚体蛋白疫苗的稳定性。

本发明序列对H4结构域改造所得的HPV18 L1蛋白只能形成五聚体，而且此五聚体具有良好的免疫原性，可以诱导高滴度的针对HPV18的中和抗体，预防HPV18对人体的感染，是一种良好的疫苗形式。此外，本发明中采用的重组HPV18 L1蛋白在保留全长HPV18 L1蛋白的抗原性及五聚体颗粒组装能力的同时，易于在真核表达系统和原核表达系统中表达，增加蛋白的溶解性、提高产量、降低生产成本，可应用于大规模工业化生产。

在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面的有益效果将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。

附图说明

图l实施例制备的HPV18 L1五聚体透射电镜观察(100，000倍)结果；结果显示，视野中可见直径为13nm左右的五聚体，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。

图2-A 按照实施例1制备的五聚体的动态光散射观测结果，结果显示五聚体的粒径与粒度分布图。

图2-B按照实施例6制备的 HPV18 L1五聚体的动态光散射观测结果，结果显示五聚体的粒径与粒度分布图。

图3 实施例1 HPV18 L1五聚体蛋白的高压液相分子筛色谱图，图中显示经高度纯化的五聚体蛋白纯度。

图4 实施例制备的HPV18 L1五聚体疫苗接种小鼠后，在第二次加强免疫3周后，检测中和抗体的平均滴度水平。

下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。

实施例l：具有HPV18 L1序列2的工程菌的构建

1、HPV18 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID NO：1，其源自GeneBank，序列号为GenBank: M14119.1。

2、含有SEQ ID NO：1基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5’- CGCGGA TCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT -3’；在H4结构的5’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含XhoI内切酶位点，反向引物序列：5’-GCTCTCCTCGAG TTA ACGTTTACGA GGGCCTACGG T -3’, 其5’端引入限制性内切酶XhoI位点，XhoI位点序列为CTCGAG。经PCR反应扩增得到HPV18B。

3、含有SEQ ID NO：1基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶BamH I位点，BamH I位点序列为GGATCC，正向引物序列：5’-CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA ATATTACATTACCATCTACTA -3’；在H4结构的3’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA，反向引物序列：GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T ；经PCR反应扩增扩增得到HPV18A。

4、HPV18A片段与HPV18B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端，使用T4 DNA连接酶连接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一个删除了H4结构域的、原H4结构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV18C。

5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4连接酶连接HPV18c和表达质粒。BamH I/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆pGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(-)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

6、连接产物经电转化或CaCl2法将重组质粒转化至大肠杆菌中，优选转化大肠杆菌BL21宿主细胞。将转化的BL21细胞涂于含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，经37℃培养，挑取单克隆菌落接种于LB液体培养基中37℃培养12 小时，从中取1ml菌液制备甘油管菌种于-70℃保存。

上述各步骤中PCR反应体系包含20μg DNA模板、lx PCR缓冲液、正向和反向特异引物（浓度均为0.2μΜ )、1.5mM镁离子、1.0 单位的 Taq DNA聚合酶；反应条件为：摄氏 95℃变性 5分钟，经 36个 PCR 循环放大，每一循环为 94℃ 30秒， 55℃ 30秒，72℃ 2分钟，反应产物在 72℃下温育10分钟，然后停止反应。

实施例2：具有HPV18 L1序列4的工程菌的构建

1、HPV18 L1基因全长的目标基因片断购自北京安贞医院妇科门诊含有野生型HPV18病毒的临床细胞样本废弃物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3（GenBank: FN870689.1）。

2、含有SEQ ID NO：3基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5’- CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT -3’；在H4结构的5’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含XhoI内切酶位点，反向引物序列：5’-GCTCTCCTCGAG TTA AGGTTTAGAA GACGTAGTGG C -3’, 其5’端引入限制性内切酶XhoI位点，XhoI位点序列为CTCGAG。经PCR反应，扩增得到HPV18B。

3、含有SEQ ID NO：3基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶BamH I位点正向引物序列：5’-CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA ATATTACATTACCATCTACTA-3’；在H4结构的3’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA，反向引物序列：GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T ；经PCR反应，扩增得到HPV18A。

5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4连接酶连接HPV18c和表达质粒。BamH I/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆pGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(-)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

实施例3：具有HPV18 L1序列6的工程菌的构建

1、HPV18 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID NO：5，其源自GeneBank，序列号为GenBank: FN870694.1。

2、含有SEQ ID NO：3基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5’- CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT-3’；在H4结构的5’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含XhoI内切酶位点，反向引物序列：5’-GCTCTCCTCGAG TTA AGGTTTAGAA GACGTAGTGG C -3’, 其5’端引入限制性内切酶XhoI位点，XhoI位点序列为CTCGAG。PCR反应，扩增得到HPV18B。

3、含有SEQ ID NO：3基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶BamH I位点正向引物序列：5’-CGCGGAGGATCC GGA GCC GGA CCTCTGTATGGCCCATTGTAT -3’；在H4结构的3’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA，反向引物序列：5’-GCTCTCTCCGGA TCC GGC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T -3’；经PCR反应，扩增得到HPV18A。

4、HPV18A片段与HPV18B共同用限制性内切酶AccIII酶切，形成特异粘性末端，使用T4 DNA连接酶连接HPV18A和HPV18B片段，使之形成一个删除了H4结构域的、原来的H4结构域被编码连接多肽GGGSG的核苷碱基序列取代的HPV18C。

5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4连接酶连接HPV18c和表达质粒。BamH I/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆pGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(-)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

其余操作步骤参照实施例1的方法。

实施例4：具有HPV18 L1序列8的工程菌的构建

1、HPV18 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID NO：7，其源自GeneBank，序列号为GenBank: HE574702.1。

2、含有SEQ ID NO：7基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5’- CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT-3’；在H4结构的5’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含XhoI内切酶位点，反向引物序列：5’-GCTCTCCTCGAG TTA ACGTTTGCGA GGGCCTATGG T -3’, 其5’端引入限制性内切酶XhoI位点，XhoI位点序列为CTCGAG。经PCR反应，扩增得到HPV18B。

3、含有SEQ ID NO：7基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶Nhe I 位点正向引物序列：5’-CGCGGA GCTAGCGCC TCC GGA CCTCTGTATGGCCCATTGTAT -3’；在H4结构的3’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA，反向引物序列：5’-GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T-3’；经PCR反应，扩增得到HPV18A。

5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4连接酶连接HPV18c和表达质粒。BamH I/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆pGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(-)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

其余操作步骤参照实施例1的方法。

实施例5：具有HPV18 L1序列10的工程菌的构建

1、HPV18 L1基因全长由金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成，其核苷酸序列SEQ ID NO：9，其源自GeneBank，序列号为GenBank: AF335603.1。

2、含有SEQ ID NO：9基因片段做PCR反应的模板。以正向引物序列：5’- CGCGGATCCGGA GAAAATAAGGATCCCTATGAT-3’；在H4结构的5’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA。下游包含XhoI内切酶位点，反向引物序列：5’-GCTCTCCTCGAG TTA CTTCCTGGCA CGTACACGCA C -3’, 其5’端引入限制性内切酶XhoI位点，XhoI位点序列为CTCGAG。经PCR反应，扩增得到HPV18B。

3、含有SEQ ID NO：9基因片段做PCR反应的模板。以含有引入的限制性内切酶BamH I位点正向引物序列：5’-CGCGGAGGATCC GGA GGA GGA ATATTACATTACCATCTACTA -3’；在H4结构的3’端引入限制性内切酶AccIII位点，AccIII位点序列为TCCGGA，反向引物序列：5’-GCTCTCTCCGGA TCC TCC TCC GTTCCAATCC TCTAAAATAC T -3’；经PCR反应，扩增得到HPV18A。

5、表达质粒pGEX-4T-2用BamH I和XhoI酶切消化，再用T4连接酶连接HPV18c和表达质粒。BamH I/XhoI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆pGEX-4T-2-HPV18C。利用M13(+)/(-)引物，测得质粒中插入的目的核苷酸序列正确，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：10。

其余操作步骤参照实施例1的方法。

实施例6：具有HPV18 L1序列11的工程菌的构建

以合成的含有SEQ ID NO： 1基因片段做PCR反应的模板，N端前8个氨基酸被GSGGG取代，C端不截短氨基酸，按照上述实施例1的方法PCR扩增，得到其目的氨基酸序列为SEQ ID NO：11。

实施例7：重组HPV18 L1蛋白的大量表达与纯化

蛋白表达：在-70℃中分别取出实施例1- 6的冻存菌种，平板活化，37℃培养14-20h，挑菌苔于80mL种子培养基中，37℃培养10-12h；然后接种于50L种子罐在37℃下培养10-12h；之后接种于500L发酵罐中，发酵培养、诱导表达；诱导表达结束后离心收集菌体。用pH7.4磷酸盐缓冲液重悬菌体，之后破碎，破碎方法可用但不限于：高压匀浆、超声波破碎或溶菌酶溶解等化学或物理手段。离心，获得上清液。可采用Lowry法检测总蛋白量，用Elisa法检测L1含量。

蛋白纯化：上清液可用但不限于盐析、等电点沉淀、离子交换层析、亲和层析、分子筛等分离纯化方法，得到纯度98%HPV18 L1的五聚体。用电镜观察纯化产物，直径均为10nm左右的五聚体蛋白。

纯化方法具体步骤为将上清溶液中的L1蛋白经亲和色谱纯化：预装谷胱甘肽-琼脂糖树脂(GE公司生产的Glutathione Sepharose 4 B)色谱柱。取浓度为50％的Glutathione Sepharose 4 B树脂匀浆放入色谱柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml树脂匀浆)。用5-10倍的柱床体积的缓冲液A (组分为：50mmol/L Tric-HCl，200mmol/L NaCl，1mmol/LEDTA，pH 8.0)洗涤树脂，然后将蛋白清液加入色谱柱中，与树脂混合均匀并在室温下作用20分钟后放出滤过液，用10倍柱床体积的缓冲液A洗涤树脂柱。将精确蛋白酶（Prescission Protease，简称PP酶）用缓冲液A稀释，上样并柱上循环酶切120min。放出酶切液，用适量的缓冲液A洗脱并收集目的蛋白。

离子交换色谱纯化：将上述收集的目的蛋白用Source Q或Mono Q（GE公司）阴离子交换柱进行离子交换层析，收集目的蛋白。

分子筛色谱纯化：将离子交换色谱收集的目的蛋白用分子量在10-600kDa的凝胶过滤介质进行分子筛层析，最终获得纯度大于98%的高纯度HPV18 L1五聚体蛋白。

实施例8：HPV18 L1 五聚体的形态学检测

将实施例1-6构建的工程菌株送上海生工公司测序，测得质粒中插入的目的DNA序列，其编码的氨基酸序列为SEQID NO：2、SEQID NO：4、SEQID NO：6、SEQID NO：8、SEQID NO：10 、SEQID NO：11所示，其中实施例1-5结果表明原来全长序列中H4结构域不复存在，取而代之的是编码连接多肽GGGSG或GAGSG序列的“GGA GGA GGA TCC GGA”或“GGA GCC GGA TCC GGA”核苷酸序列。

将实施例1-6方法获得的工程菌株采用实施例7的方法表达纯化得到的产物HPV18 L1五聚体蛋白，透射电镜观察(100，000倍)，结果显示，视野中可见直径为13nm左右的五聚体，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。其中实施1序列所得样品的电镜照片见附图1。

进行颗粒粒径测定。仪器为马尔文 Zetasizer NanoZS的动态光散射粒径仪，使用算法为Regulation算法。样品经0.22 u m滤膜过滤后进行测量，结果见表1。结果表明，六种五聚体平均粒径基本一致12.89-14.48nm，但分散性指数PdI（表明蛋白的均一性）存在显著差异，其中实施例1-5样品的分散性指数较小，说明样品很均一。实施例6样品的分散性指数较大，说明样品不均一。

表1 五聚体平均粒径和分散性指数

纯化后蛋白原液	平均粒径（nm）	分散性指数PdI
			实施例1 HPV18 L1五聚体	12.89	0.058
实施例2 HPV18 L1五聚体	13.45	0.087
			实施例3 HPV18 L1五聚体	13.78	0.075
实施例4 HPV18 L1五聚体	13.56	0.069
			实施例5 HPV18 L1五聚体	14.48	0.098
实施例6 HPV18 L1五聚体	14.24	0.140

其中实施例1所制备的HPV18 L1五聚体颗粒的水化分子动力学平均粒径为12.89nm，分散性指数PdI为0.058（具体见附图2-A）；实施例6所制备的HPV18 L1五聚体颗粒的水化分子动力学平均粒径为14.24nm，分散性指数PdI为0.140（具体见附图2-B）。

实施例9：蛋白原液纯度检测

色谱柱为TSK-GEL G3000 SWxl，或相同填料，分离范围10KDa-500 KDa的色谱柱；以pH6.8 的0.1mol/l磷酸盐缓冲液（称取磷酸氢二钠25.8g，磷酸二氢钠4.37g，加超纯水使溶解，用磷酸调pH至6.8，超纯水定容成1000ml）为流动相；流速为1ml/min；检测波长280nm；柱温25℃，上样量不得小于20ug，样品主峰理论塔板数不低于1000，拖尾因子小于2.0，连续进样5针，峰面积的相对标准偏差不得大于3%。

取实施例7所得的HPV蛋白原液，分别稀释浓度为1mg/ml，上样量20ul注入高压液相色谱仪，按照上述方法检测，按面积百分比计算纯度，结果见下表2及附图3（实施1所制备的HPV18 L1五聚体的分子筛层析色谱图），所有处理蛋白纯度均大于98%。

表2 纯化后蛋白原液的纯度

纯化后蛋白原液	纯度（%）
		实施例1 HPV18 L1五聚体	99.53
实施例2 HPV18 L1五聚体	99.12
		实施例3 HPV18 L1五聚体	99.36
实施例4 HPV18 L1五聚体	99.16
		实施例5 HPV18 L1五聚体	99.52
实施例6 HPV18 L1五聚体	97.33

实施例10：含有HPV18 L1五聚体蛋白疫苗的制备

分别将实施例1-6制备后经实施例7步骤纯化的HPV18 L1五聚体蛋白原液用pH7.2的硼酸缓冲盐稀释成100μg/ml的蛋白液，取1ml稀释后的蛋白液加入50μg/ml氢氧化铝佐剂，充分混合吸附2小时，即获得40μg/ml的HPV18 L1五聚体蛋白疫苗，于4℃避光保存。

实施例11：HPV18 L1 五聚体疫苗的免疫原性测定

小鼠的免疫原性：将实施例10制备的HPV18 L1五聚体蛋白疫苗用疫苗稀释剂分别稀释成表1所示剂量，以每只0.5mL腹腔注射BALB/C小鼠，每个处理组10只。每3周免疫一次，共免疫2次。每次免疫后三周分别采取每只小鼠血清，采用假病毒细胞中和实验法分别测定每次免疫后的小鼠血清中针对HPV18的中和抗体滴度。结果如表3所示，在第二次加强免疫3周后，检测中和抗体的平均滴度水平如附图4所示。

表3 假病毒细胞中和实验法检测HPV18 L1五聚体蛋白中和抗体水平

结果表明，实施例制备的HPV18 L1五聚体蛋白接种小鼠，第一次免疫3周后即可产生中和抗体；二次免疫后的中和抗体即可达到很高的水平，分别如表所示。实验结果证明，各个实施例所得样品制备的HPV L1五聚体蛋白疫苗可以在动物体内产生中和抗体。说明本发明制备的HPV L1五聚体蛋白疫苗在人体临床试验中具有免疫原性，即能预防或治疗HPV18病毒引起的疾病。

实施例12：HPV18 L1蛋白产率比较

将实施1-6方法构建的工程菌参照实施例7的方法，制备HPV18 L1蛋白，计算表达量(用Lowry法检测总蛋白量，用Elisa法检测L1含量)，之后放置6-20小时比较蛋白的稳定性，结果如表4所示。

表4 蛋白含量及稳定性实验

蛋白类型	表达得到L1蛋白占总蛋白的百分比	蛋白稳定性
			含有SEQ ID NO：2的蛋白	17.5%	在4℃时 >15小时
含有SEQ ID NO：4的蛋白	18.9%	在4℃时 >15小时
			含有SEQ ID NO：6的蛋白	16.5%	在4℃时 >15小时
含有SEQ ID NO：8的蛋白	17.1%	在4℃时 >15小时
			含有SEQ ID NO：10的蛋白	15.2%	在4℃时 >15小时
含有SEQ ID NO：11的蛋白	7.1%	在4℃时6小时出现沉淀

结果表明，不同氨基酸序列组成的蛋白产物稳定性不同。其中SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10，比H4结构域未改造的SEQ ID NO：11制备HPV18 L1蛋白纯化产物，放置6-15小时比较蛋白的稳定性，含有SEQ ID NO：11序列的蛋白纯化产物在6小时即出现沉淀，含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10序列的蛋白纯化产物在15小时观察未出现沉淀，依然保持稳定。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京康乐卫士生物技术股份有限公司

<120> 重组的人乳头瘤病毒18型L1蛋白及其用途

<130> 2013

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60

ttgtatcacc cacagaccct gcctctacac agtatattgg tatacatggt acacattatt 120

atttgtggcc attatattat tttattccta aaaagcgtaa acgtgttccc tatttttttg 180

cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatacc ttccacctcc ttctgtggca 240

agagttgtaa atactgatga ttatgtgact cgcacaagca tattttatca tgctggcagt 300

tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360

caggatattc ctaaggtttc tgcataccaa tatagagtat ttcgggtgca gttacctgac 420

ccaaataaat ttggtttacc tgataatagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480

tgggcctgtg ctggtgtgga aattggccgt ggtcagcctt taggtgttgg ccttagtggg 540

catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgctac gtctaatgtt 600

tctgaggacg ttagggacaa tgtgtctgta gattataagc agacacagtt atgtattttg 660

ggctgtgccc ctgctattgg ggaacactgg gctaaaggca ctgcttgtaa atcgcgtcct 720

ttatcacagg gcgattgccc ccctttagaa cttaaaaaca cagttttgga agatggtgat 780

atggtagata ctggatatgg tgccatggac tttagtacat tgcaagatac taaatgtgag 840

gtacccttgg atatttgtca gtctatttgt aaatatcctg attatttaca aatgtctgcg 900

gatccttatg gggattccat gtttttttgc ttacggcgtg agcagctttt tgctaggcat 960

ttttggaata gggcaggtac tatgggtgac actgtgcctc aatccttata tattaaaggc 1020

acaggtatgc gtgcttcacc tggcagctgt gtgtattctc cctctccaag tggctctatt 1080

gttacctctg actcccagtt gtttaataaa ccatattggt tacataaggc acagggtcat 1140

aacaatggta tctgctggca taatcaatta tttgttactg tggtagatac cactcgtagt 1200

accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260

aaatttaagc agtatagcag acatgttgaa gaatatgatt tgcagtttat ttttcagtta 1320

tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc ccgccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

cgttttgtac aatctgttgc tattacctgt caaaaggatg ctgcaccagc cgaaaataag 1500

gatccctatg ataagttaaa gttttggaat gtggatttaa aggaaaagtt ttctttagac 1560

ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

accgtaggcc ctcgtaaacg ttctgctcca tctgccacta cgtcttctaa acctgccaag 1680

cgtgtgcgtg tacgtgccag aaagtaa 1707

<210> 2

<211> 517

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Ser Gly Gly Gly Ile Leu His Tyr His Leu Leu Pro Leu Tyr Gly

1 5 10 15

Pro Leu Tyr His Pro Gln Thr Leu Pro Leu His Ser Ile Leu Val Tyr

20 25 30

Met Val His Ile Ile Ile Cys Gly His Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Lys

35 40 45

Ser Val Asn Val Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu Trp Arg Pro

50 55 60

Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val

65 70 75 80

Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser Ile Phe Tyr His Ala Gly

85 90 95

Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro Tyr Phe Arg Val Pro Ala

100 105 110

Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr

115 120 125

Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro

130 135 140

Asp Asn Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser

165 170 175

Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala

180 185 190

Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp

195 200 205

Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly

210 215 220

Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro Leu Ser Gln

225 230 235 240

Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly

245 250 255

Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln

260 265 270

Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys

275 280 285

Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met

290 295 300

Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala Arg His Phe Trp Asn

305 310 315 320

Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Gln Ser Leu Tyr Ile Lys

325 330 335

Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser

340 345 350

Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro

355 360 365

Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp His

370 375 380

Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu

385 390 395 400

Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln Tyr Asp Ala

405 410 415

Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln

420 425 430

Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser

435 440 445

Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn

465 470 475 480

Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu

485 490 495

Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Val

500 505 510

Gly Pro Arg Lys Arg

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<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

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atttgtggcc attatattat tttattccta aaaagcgtaa acgtgttccc tatttttttg 180

cagatggctt tgtggcggcc tagtgacaat accgtatacc ttccacctcc ttctgtggca 240

agagttgtaa atactgatga ttatgtgact cgcacaagca tattttatca tgctggcagt 300

tctagattat taactgttgg taatccatat tttagggttc ctgcaggtgg tggcaataag 360

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ccaaataaat ttggtttacc tgataatagt atttataatc ctgaaacaca acgtttagtg 480

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catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgctac gtctaatgtt 600

tctgaggacg ttagggacaa tgtgtctgta gattataagc agacacagtt atgtattttg 660

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ttatcacagg gcgattgccc ccctttagaa cttaaaaaca cagttttgga agatggtgat 780

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gatccttatg gggattccat gtttttttgc ttacggcgtg agcagctttt tgctaggcat 960

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tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc ccgccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

cgttttgtac aatctgttgc tattacctgt caaaaggatg ctgcaccagc tgaaaataag 1500

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ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

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20 25 30

Met Val His Ile Ile Ile Cys Gly His Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Lys

35 40 45

Ser Val Asn Val Phe Pro Ile Phe Leu Gln Met Ala Leu Trp Arg Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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130 135 140

Asp Asn Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys

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165 170 175

Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala

180 185 190

Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp

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Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly

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<211> 1707

<212> DNA

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catccatttt ataataaatt agatgacact gaaagttccc atgccgccac gtctaatgtt 600

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gttacctctg actcccagtt gtttaataaa ccatattggt tacataaggc acagggtcat 1140

aacaatggtg tttgctggca taatcaatta tttgttactg tggtagatac cactcgcagt 1200

accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260

aaatttaagc agtatagcag acatgttgag gaatatgatt tgcagtttat ttttcagttg 1320

cgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc ccgccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

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ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

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cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707

<210> 6

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

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1 5 10 15

Leu Pro Leu His Ser Ile Leu Val Tyr Met Val His Ile Ile Ile Cys

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Gly His Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Arg Asn Val Asn Val Phe Pro Ile

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Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu

115 120 125

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Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Ala Gly Val Glu Ile Gly Arg

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Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys

165 170 175

Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu

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Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys

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Leu Lys Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr

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Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro

260 265 270

Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met

275 280 285

Ser Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu

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Gln Leu Phe Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp

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Thr Val Pro Gln Ser Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser

325 330 335

Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr

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Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln

355 360 365

Gly His Asn Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val

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Ser Pro Val Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser

405 410 415

Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Arg Thr

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Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser

435 440 445

Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ser Gly Glu Asn Lys Asp

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Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe

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Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln

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Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg Ser Ala

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Pro Ser Ala Thr Thr Ser Ser Lys Pro

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<210> 7

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

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acaggtatgc gtgcttcacc tggcagctgt gtgtattctc cctctccaag tggctctatt 1080

gttacctctg actcccagtt gtttaataaa ccatattggt tacataaggc acagggtcat 1140

aacaatggtg tttgctggca taatcaatta tttgttactg tggtagatac cactcgcagt 1200

accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260

aaatttaagc agtatagcag acatgttgag gaatatgatt tgcagtttat ttttcagttg 1320

tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc ccgccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

cgttttgtac aatctgttgc tattacctgt caaaaggatg ctgcaccggc tgaaaataag 1500

gatccctatg ataagttaaa gttttggaat gtggatttaa aggaaaagtt ttctttagac 1560

ttagatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

accataggcc ctcgcaaacg ttctgctcca tctgccacta cgtcttctaa acctgccaag 1680

cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707

<210> 8

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ala Ser Ala Ser Gly Pro Leu Tyr Gly Pro Leu Tyr His Pro Gln Pro

1 5 10 15

Leu Pro Leu His Ser Ile Leu Val Tyr Met Val His Ile Ile Ile Cys

20 25 30

Gly His Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Arg Asn Val Asn Val Phe Pro Ile

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Phe Leu Gln Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu

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Pro Pro Pro Ser Val Ala Arg Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr

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Arg Thr Ser Ile Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val

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Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Gln Leu

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Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Asn Ser Ile Tyr Asn Pro

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Glu Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Ile Gly Arg

145 150 155 160

Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys

165 170 175

Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu

180 185 190

Asp Val Arg Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys

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Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr

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Ala Cys Lys Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu

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Leu Lys Asn Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr

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Gly Ala Met Asp Phe Ser Thr Leu Gln Asp Thr Lys Cys Glu Val Pro

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Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met

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Gly His Asn Asn Gly Val Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Val Thr Val

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Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln

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Ala Gly Leu Arg Arg Lys Pro Thr Ile Gly Pro Arg Lys Arg

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<210> 9

<211> 1707

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgtgcctgt atacacgggt cctgatatta cattaccatc tactacctct gtatggccca 60

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accaatttaa caatatgtgc ttctacacag tctcctgtac ctgggcaata tgatgctacc 1260

aaatttaagc agtatagcag acatgttgag gaatatgatt tgcagtttat ttttcagttg 1320

tgtactatta ctttaactgc agatgttatg tcctatattc atagtatgaa tagcagtatt 1380

ttagaggatt ggaactttgg tgttcccccc ccgccaacta ctagtttggt ggatacatat 1440

cgttttgtac aatctgttgc tattacctgt caaaaggatg ctgcaccggc tgaaaataag 1500

gatccctatg ataagttaaa gttttggaat gtggatttaa aggaaaagtt ttctttagac 1560

ttaaatcaat atccccttgg acgtaaattt ttggttcagg ctggattgcg tcgcaagccc 1620

accataggcc ctcgcaaacg ttctgctcca tctgccacta cgtcttctaa acctgccaag 1680

cgtgtgcgtg tacgtgccag gaagtaa 1707

<210> 10

<211> 538

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Gly Ser Gly Gly Gly Ile Leu His Tyr His Leu Leu Pro Leu Tyr Gly

1 5 10 15

Pro Leu Tyr His Pro Gln Pro Leu Pro Leu His Ser Ile Leu Val Tyr

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Met Val His Ile Ile Ile Cys Gly His Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Arg

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Arg Val Phe Arg Val Gln Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Leu Pro

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Val Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Leu Ser

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Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Ser Ser His Ala

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Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly Cys Ala Pro Ala Ile Gly

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Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys Lys Ser Arg Pro Leu Ser Gln

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245 250 255

Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Gly Phe Ser Thr Leu Gln

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Asp Thr Lys Cys Glu Ile Pro Leu Asp Ile Cys Gln Ser Ile Cys Lys

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305 310 315 320

Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro Pro Ser Leu Tyr Ile Lys

325 330 335

Gly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser Cys Val Tyr Ser Pro Ser

340 345 350

Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro

355 360 365

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Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Leu

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Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val Pro Gly Gln Tyr Asp Ala

405 410 415

Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln

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Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Ser

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Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Trp Asn Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Gly Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lys Phe Trp Asn

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Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asn Gln Tyr Pro Leu

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<210> 11

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His

20 25 30

Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile

35 40 45

Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Ser Gly Gly

50 55 60

Gly Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val Ser

65 70 75 80

Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr

85 90 95

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100 105 110

Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg

115 120 125

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130 135 140

Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val

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Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly

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His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr

180 185 190

Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr

195 200 205

Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu

210 215 220

His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro Gly

225 230 235 240

Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp

245 250 255

Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala

260 265 270

Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr

275 280 285

Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe

290 295 300

Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn Arg

305 310 315 320

Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly

325 330 335

Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro

340 345 350

Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr

355 360 365

Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn

370 375 380

Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser

385 390 395 400

Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn

405 410 415

Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile

420 425 430

Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile

435 440 445

His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln

450 455 460

Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser

465 470 475 480

Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp

485 490 495

Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe

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Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln

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Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys Arg

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Claims

1.一种重组的HPV18 L1蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列在N端8-15个氨基酸全部或任意部分被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式；H4结构域被2-10个氨基酸序列取代，其氨基酸序列由G、S、A三者的任一组合方式。

2.如权利要求1所述的HPV18 L1蛋白，其特征在于其氨基酸序列C端截短0-21个氨基酸，优选截短10个或21个氨基酸。

3.如权利要求1或2所述的HPV18 L1蛋白，其特征在于其氨基酸序列N端前8-15个氨基酸被GSGGG、ASASG或GSGAG取代，H4结构域被GGGSG或GAGAS取代。

4.如权利要求3所述的HPV18 L1蛋白，其特征在于其氨基酸序列在N端前8、10或15个氨基酸优选被GSGGG或GAGA氨基酸序列取代。

5.如权利要求4所述的HPV18 L1蛋白，其特征在于其序列包含序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10。

6.编码权利要求1-5任一项的蛋白的多核苷酸。

7.包含权利要求5的多核苷酸的表达载体。

8.包含权利要求7的表达载体的细胞。

9.一种HPV18 L1蛋白五聚体，其特征在于该蛋白五聚体由权利要求1至5任一所述的蛋白形成。

10.一种HPV 疫苗，其特征在于该疫苗包括权利要求9所述的HPV18 L1 蛋白五聚体和药用佐剂。

11.如权利要求10所述的HPV疫苗的制备方法，其特征在于该方法为：

克隆或合成重组HPV18 L1蛋白的基因片段；

在大肠杆菌或酵母表达系统中表达重组的HPV18 L1蛋白；

纯化由HPV18 L1蛋白组成的五聚体；

HPV18 L1蛋白五聚体加入药用佐剂制成疫苗。

12.如权利要求9所述的HPV18 L1蛋白五聚体在预防和/或治疗包括HPV18感染及导致疾病的药物中的应用。

13.如权利要求10所述的HPV18 L1疫苗在预防和/或治疗包括HPV18感染及导致疾病的药物中的应用。