CN114457196A - 一种通过高通量二维pcr单管闭管检测多种高危型hpv的方法 - Google Patents

一种通过高通量二维pcr单管闭管检测多种高危型hpv的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，主要包括建立二维PCR的探针及标签库、设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化和二维PCR技术应用及性能评估三大步骤。本发明建立了高通量二维PCR单管闭管检测13种高危型HPV的检测方法，通过对方法的灵敏度、特异性等一系列指标分析评估应用于临床筛查的潜力，为临床的快速筛查诊治提供依据。

Description

一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法。
背景技术
宫颈癌位居女性恶性肿瘤发病率第二位，占全世界因癌症死亡的女性的7％以上。宫颈癌前病变又称为宫颈上皮内瘤变(CINs)，和宫颈癌与经性传播的高危HPV感染密切相关。目前，全球HPV的感染率持续上升，数据统计，每年约有50万患者被诊断为宫颈癌，在全球范围内造成超过25万患者死亡；在中国宫颈癌发病率同样呈现上升趋势，并趋于向年轻化。85％宫颈癌发生在筛查计划无效的发展中国家，近一半的宫颈癌患者在诊断前没有进行筛查，另外10％的患者在过去五年内没有进行筛查。早期筛查与干预是降低宫颈癌发病率与死亡率的有效手段。HPV检测联合细胞学检查作为早期筛查手段可以发现癌前病变及早期宫颈癌，给临床诊断提供依据。
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种小型环状双链DNA病毒，其基因组分为3个区域，包括早期转录区(E区，包含基因E1－E7)、晚期转录区(L区，包含基因L1和L2)和非编码区(也称长控制区，位于L1和E6开放阅读框架之间)。根据编码衣壳蛋白L1区基因序列差异，可将HPV分为不同亚型。HPV的类型分为低风险(引起疣)和高风险(致癌)。高危型HPV有HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68，共13种；低危型HPV有HPV-6、-11、-42、-43、-44，共5种。宫颈癌前病变又称为宫颈上皮内瘤变(CINs)，和宫颈癌与经性传播的高危HPV感染密切相关，持续的高危型HPV感染导致99％以上的宫颈癌。其中HPV16型和18型是导致70％宫颈癌的高危亚型。持续的低风险基因型HPV-6和HPV-11可致大多数的生殖器疣和呼吸道乳头状瘤病，但很少与癌症相关。高风险HPV基因型还可导致肛门癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌和口咽癌。因此HPV检测有利于生殖器疣、呼吸道乳头状瘤病以及包括宫颈癌在内的多种肿瘤的早期筛查和预防。
目前HPV的检测主要是基于DNA水平的分子生物学方法。对于主要有第二代杂交捕获技术(HC2)、PCR、基因芯片等。HC2是第一个通过美国FDA批准的HPV临床诊断方法，其优势是操作方便，适于大范围人群筛查，结果客观、稳定、重复性好，但它只能区分高危型和低危型，而不能进行HPV个体基因分型；基因芯片技术是一种依赖于固相载体的技术，有众多的优点，但它主要运用于研究宫颈疾病和HPV各亚型的关系中，临床检测中大规模运用与推广尚有难度；PCR技术检测靶基因便捷快速、不需要昂贵的仪器和试剂、操作简单，非常适用于临床标本的大规模筛检。HPV的DNA的检测，有特异引物和通用引物两种方法。但传统PCR的单管单基因检测逐渐显露出通量过小、大批量多基因检测耗时长的弊端。而基于多重PCR的高通量基因检测技术根据产物鉴定方法的不同，主要分为开管检测和闭管检测两大类。开管检测取出PCR产物借助电泳、质谱、液相芯片和测序等技术鉴别产物。需要额外设备，步骤繁琐，检测时间较长，且开盖容易造成实验室污染，从而导致假阳性结果。闭管检测无需开盖操作，通过分析荧光进行产物鉴别，主要分为高分辨熔解曲线法、荧光熔解曲线分析法和基于多色荧光通道的TaqMan探针技术等。这些方法虽然检测时间短，污染风险小，但仍然存在单管反应检测通量不足的问题。
因此，如果在闭管条件下，单管PCR反应就能实现批量基因的筛查或分型，将会大大提升临床疾病的诊治速度。
前面的叙述在于提供一般的背景信息，并不一定构成现有技术。
发明内容
针对现有技术的不足，根据本发明的实施例，希望提出一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，旨在建立高通量二维PCR单管闭管检测13种高危型HPV的检测方法，通过对方法的灵敏度、特异性等一系列指标分析评估应用于临床筛查的潜力，为临床的快速筛查诊治提供依据。
根据实施例，本发明提供的一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，包括以下步骤：
S1：建立二维PCR的探针及标签库；
S2：设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化；
S3：二维PCR技术应用及性能评估。
步骤S1、S2和S3具体分述如下：
1、建立二维PCR的探针及标签库
1.1、针对常用的FAM、VIC、Cy5三个荧光检测通道，设计三个探针序列，并在5’端添加相应的荧光基团，3’端由磷酸基团封闭(表1)。
表1.各荧光通道探针序列汇总表
Figure BDA0003525092400000031
1.2：针对标签的反向互补序列即前标签设计多组与前标签同源的序列。
1.3：将每组前标签序列与其对应的碱基猝灭探针进行熔解温度的探索，每管25μLPCR反应体系组成如下：2.5μL的10x无镁离子缓冲液,1.5μL的25mM镁离子溶液，0.5μL的4×10mM dNTPs，0.25μL的5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1μL 10μM的前标签，0.1μL的10μM的探针，加入去离子水补足反应体系至25μL。PCR反应程序如下:95℃10秒，30℃4分钟，而后荧光信号收集时温度持续上升至80℃。并依据获得的熔解温度和熔解曲线的优劣对前标签序列进行筛选,建立合适的探针及标签库。
2、设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化。
2.1选择包括16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的共计13种高危型HPV基因亚型。人血红蛋白β亚基(HBB)和血红蛋白δ亚基(HBD)基因作为内参基因，用同一对引物扩增这两个基因，以下简称HBB&HBD基因，并视为一个待检基因。
2.2：采用三荧光通道检测模式:FAM荧光检测通道检测HPV16、18、31、33、58型及HBB&HBD基因；VIC荧光检测通道检测HPV35、39、45、51、52型；Cy5荧光检测通道中检测HPV56、59、68型。
2.3制备FAM荧光检测通道、VIC荧光检测通道、Cy5荧光检测通道三个检测通道的引物及探针，引物及探针均按照要求用缓冲液稀释为10μM，由于二维PCR体系中所用引物探针较多，故稀释样本均注明浓度和名称。探针应注意避光保存。
2.4制备包含不同HPV扩增子的质粒样本，质粒样本原液进行稀释，稀释完成后，每个HPV亚型质粒样本选用七个稀释的样本，浓度在10^1拷贝/μL到10^7拷贝/μL进行后续实验，余质粒样本予以冻存。
2.5进行单对引物单基因检测实验，以保证引物能成功扩增靶基因，探针能成功检测出待检靶基因，PCR反应体系如下：2.5μL的10×无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子熔液，0.5μL的4×10Mm dNTPs，0.25μL的5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.1μL的10μM带标签引物，0.1μL的10μM的不带标签引物，0.1μL的10μM探针，然后加入去离子水补足反应体系至23μL。每个HPV样本做3个孔。PCR反应程序为：95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后温度由30℃持续上升至80℃持续收集荧光信号；最后40℃持续30秒。
2.6运用热启动Taq酶体系初步设计二维PCR反应体系。初步设计每管25μL二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×Immobuffer缓冲液，0.5μL 50mM镁离子熔液，0.7μL的4×2.5mM dNTPs，0.5μL的5U/μL IMMOLASE DNA聚合酶，0.4μL的浓度为10μM探针，0.1μL浓度为10μM的每个带标签靶基因特异性引物，0.1μL浓度为10μM的每个靶基因不带标签引物，而后加入去离子水使得PCR反应体系达到23μL，最后加入2μL样本。PCR反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
2.7带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验：将带标签引物固定在每25μL反应体系0.1μL，而后调整不带标签引物的量从高到底为0.2μL，0.3μL，0.6μL和0.8μL，PCR反应体系中其余组分均保持一样，进行二维PCR反应寻找带标签引物与不带标签引物用量最优比例。
2.8探针浓度优化实验：在带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验结果基础上设计探针的用量由低到高分别为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL以及0.5μL共5个反应体系，除了探针的用量和相应的去离子水的用量不同外，其余反应体系的组成成分相同。进行二维PCR反应寻找最优探针浓度。
2.9镁离子浓度优化实验：设计镁离子量由低到高分别为0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL共5个反应体系，其余反应体系与引物和探针优化后的相同。进行二维PCR反应寻找最佳镁离子浓度。
3、二维PCR技术应用及性能评估
3.1收集经流式荧光杂交法测得的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型共13种高危型HPV阳性的宫颈脱落细胞标本各50份，总共650份宫颈脱落细胞标本；HPV均为阴性的正常宫颈脱落细胞样本50份；HBV阳性的标本10份，HCV阳性的标本10份。收集的样本置于-20℃存放。
3.2通过核酸提取试剂盒抽提DNA以及RNA，HCV RNA经逆转录成c DNA,核酸置于-20℃保存。
3.3高通量二维PCR体系特异性实验设计：优化后得二维PCR体系中加入探针以及相应的所有靶基因上下游引物，分别检测包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的质粒样本以及HBV、HCV临床样本。
3.4高通量二维PCR体系灵敏度实验设计：将各型的质粒样本原液予以十倍梯度稀释，10^8拷贝/μL以上浓度的样本予以封存，各型质粒选用浓度为10^7拷贝/μL到10^1拷贝/μL用于灵敏度实验，通过实验观察各型质粒的最低检出限。
3.5临床标本检测实验设计：运用优化后的高通量二维PCR反应体系对临床样本分别从灵敏度、特异性、交叉反应、最低检出限及干扰实验等方面进行检测，并将检测结果与流式荧光杂交法实验结果相比较。
3.6汇总实验数据，进行统计分析，从灵敏度及特异性等方面对高通量二维PCR进行方法学验证，评估高通量二维PCR单管闭管检测多种HPV筛查宫颈癌的价值及潜力。
相对于现有技术，本发明运用在碱基淬灭探针技术的基础上开创的一种高通量二维PCR(Two-dimensional PCR,2D PCR)技术实现单管闭管检测13种高危型HPV用于宫颈癌筛查，本发明方法可在单管中、闭管条件下，高通量检测并鉴定多种靶基因，操作简单且无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，适宜于大规模筛查。碱基猝灭探针技术是指设计与靶基因不发生非特异性结合的探针序列，在探针5’端标记荧光基团，探针3’端用磷酸基团封闭。PCR结束时，由于碱基淬灭探针与靶DNA序列在较低温度条件下(如30℃)杂交，荧光基团发出的荧光被邻近的碱基(A，T，C或G)淬灭；当温度缓慢升高时，探针熔解脱离靶DNA，荧光急剧增加。根据不同等位基因间熔解温度(Tm)值有明显差异，探针可以依据Tm值准确识别靶序列。该技术以前多用于单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphism,SNP)的检测。
基于碱基猝灭探针基础上设计一组与检测探针序列同源且与检测探针反向互补的引物标签。二维PCR引物由带标签和不带标签的引物组成。靶基因特异性上游或下游引物中选取一条，在引物的5’末端引入一段标签序列组成带标签引物和不带标签引物，独立标签不具备靶基因特异性，与靶基因特异性引物链接后标签序列特异性地指代该靶基因。在PCR扩增过程中，标签序列会被另一条引物引导扩增产生标签的反向互补序列。在熔解曲线分析过程中，探针靶向识别于标签的反向互补序列，通过Tm值准确识别靶基因。因而在同一荧光检测通道中，只需一条探针即可识别多个靶基因，提高了检测通量，如果增设荧光通道，即可通过数条探针识别大量靶基因，每一个靶基因的Tm值都对应着一个温度以及荧光通道，相当于坐标系中一个点同时对应横坐标和纵坐标，此即为高通量二维PCR。运用这种方法可望实现单管闭管多种HPV分型检测，操作简单，反应时间短，无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，结果可靠稳定，可普及于众多医院，具有良好的经济效益和社会效益，适宜于大批量筛查工作。
宫颈癌位居女性恶性肿瘤发病率第二位。在我国，宫颈癌患病率呈现上升趋势，并趋于向年轻化发展。宫颈癌前病变和宫颈癌与经性传播的高危HPV感染密切相关，而持续高危HPV感染导致99％以上的宫颈癌。HPV基因分型检测有利于早期发现癌前病变以及早期宫颈癌，降低宫颈癌发病率与死亡率。中国人口基数大，对于宫颈癌的广泛筛查也是不可或缺，高通量二维PCR检测方法可单管闭管检测多种HPV基因亚型，灵敏度高，特异性高，操作简单且闭管可避免实验室污染和假阳性得状况，且无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，借助PCR仪器通过PCR反应以及熔解曲线分析即可得出结果。可用于大规模宫颈癌初筛，无需特殊设备，可适用于大多医院，价格适宜，操作简单，结果稳定可重复，有利于节省国家公共卫生资源，合理运用国家公共卫生资源促进医学发展。
亦即，本发明检测方法具有如下明显的有益效果：
(1)检测通量高：高通量二维PCR区别于传统PCR单管单基因检测，与多重PCR相比具有更高通量检测的优点，通过碱基猝灭探针与标签序列反向互补结合的原理，运用一个探针可单管检测多种靶基因，操作简单，降低成本，有较高的科学技术应用价值。
(2)结果判读简单：高通量二维PCR将PCR反应与熔解曲线分析相结合，通过熔解温度来检测靶基因，从而实现闭管检测，较开管检测而言避免额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，简略操作步骤，降低检测成本，避免因开管产物外溢造成实验室污染引起结果假阳性，提高结果的准确性。
(3)可实现多通道检测：高通量二维PCR通过多个结合不同荧光基团的探针序列以及多个分别扩增不同HPV基因型的带标签和不带标签引物序列单管检测实现多通量检测，每一个靶基因检测结果都对应着相应的温度以及荧光通道，通过增加荧光通道可实现单管检测更多靶基因的目标,具有单管闭管检测实现高通量检测的优点。
建立高通量二维PCR单管闭管检测13种高危型HPV筛查宫颈癌，基于碱基猝灭探针基础上的二维PCR技术，根据一个靶基因同时对应熔解温度以及荧光检测通道的原理，实现一种荧光通道检测多个基因，通过增加荧光通道进而可以实现单管闭管高通量检测的目标，该技术操作简单，仪器设备要求简单，闭管操作可避免引起实验室污染，且无需额外的产物鉴定仪器以及复杂的处理过程，有望推广至基层医院，进而实现大规模的HPV检测，早期发现宫颈癌癌前病变以及早期宫颈癌，实现宫颈癌筛查，降低宫颈癌的发病率和死亡率。转化生产试剂盒如果能投入临床使用，实现单管13个型别的检测，将大大减低检测成本。
附图说明
图1为本发明实施的一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法流程图。
图2为图1中检测多种高危型HPV的方法步骤S1的流程图。
图3为图1中检测多种高危型HPV的方法步骤S2的流程图。
图4为图1中检测多种高危型HPV的方法步骤S3的流程图。
图5为单对引物单基因检测部分实验的线性示意图。
图6为高通量二维PCR体系特异性部分实验的线性示意图。
图7为高通量二维PCR体系灵敏度部分实验的线性示意图。
图8为临床样本检测部分实验的线性示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
本发明的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。
本发明的目的在于提供一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，该方法主要通过建立高通量二维PCR单管闭管，检测多种型别HPV，进而筛查宫颈癌。
图1为本发明实施例的一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法流程图。请参照图1，包括以下步骤：
S1：建立二维PCR的探针及标签库；
S2：设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化；
S3：二维PCR技术应用及性能评估。
图2为图1中检测多种高危型HPV的方法步骤S1的流程图。请参照图1，所述步骤S1包括：
S11：针对常用的FAM、VIC、Cy5三个荧光检测通道，设计三个探针序列，并在5'端添加相应的荧光基团，3'端由磷酸基团封闭；如下表(各荧光通道探针序列汇总表)所示：
Figure BDA0003525092400000091
S12：针对标签的反向互补序列即前标签设计多组与前标签同源的序列，以FAM荧光通道为例，前标签如表2所示：
表2FAM前标签基团序列
Figure BDA0003525092400000092
S13：将每组前标签序列与其对应的碱基猝灭探针进行熔解温度的探索，以FAM荧光通道为例，猝灭探针基团序列如表3所示；每管25μL PCR反应体系组成如下：2.5μL的10x无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子溶液，0.5μL的4×10mM dNTPs，0.25μL的5U/μL TaqDNA聚合酶，0.1μL 10μM的前标签，0.1μL的10μM的探针，加入去离子水补足反应体系至25μL。PCR反应程序如下：95℃10秒，30℃4分钟，而后荧光信号收集时温度持续上升至80℃。并依据获得的熔解温度和熔解曲线的优劣对前标签序列进行筛选,建立合适的探针及标签库。
表3FAM猝灭探针基团序列
Figure BDA0003525092400000101
图3为图1中检测多种高危型HPV的方法步骤S2的流程图。请参照图3，所述步骤S2包括：
S21：研究选择了16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的共计13种高危型HPV基因亚型；人血红蛋白β亚基(HBB)和血红蛋白δ亚基(HBD)基因作为内参基因，用同一对引物扩增这两个基因，以下简称HBB&HBD基因，并视为一个待检基因；
S22：设计三荧光通道检测模式：
三荧光通道检测模式:FAM荧光检测通道检测HPV16、18、31、33、58型及HBB&HBD基因；VIC荧光检测通道检测HPV35、39、45、51、52型；Cy5荧光检测通道中检测HPV56、59、68型。
S23：制备FAM荧光检测通道、VIC荧光检测通道及Cy5荧光检测通道的引物及探针，以FAM荧光检测通道为例，如表4所示；引物及探针均按照要求用缓冲液稀释为10μM，由于二维PCR体系中所用引物探针较多，故稀释样本均注明浓度和名称。探针应注意避光保存。
表4FAM荧光检测通道HPV亚型引物
Figure BDA0003525092400000111
S24：制备包含不同HPV扩增子的质粒样本，质粒样本原液进行稀释，稀释完成后，每个HPV亚型质粒样本选用七个稀释的样本，浓度在10^1拷贝/μL到10^7拷贝/μL进行后续实验，余质粒样本予以冻存。
S25：进行单对引物单基因检测实验，以保证引物能成功扩增靶基因，探针能成功检测出待检靶基因(如图5所示)；
PCR反应体系如下：2.5μL的10×无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子熔液，0.5μL的4×10Mm dNTPs，0.25μL的5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.1μL的10μM带标签引物，0.1μL的10μM的不带标签引物，0.1μL的10μM探针，然后加入去离子水补足反应体系至23μL。每个HPV样本做3个孔。
PCR反应程序为：95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后温度由30℃持续上升至80℃持续收集荧光信号；最后40℃持续30秒。
S26：运用热启动Taq酶体系初步设计二维PCR反应体系；
初步设计每管25μL二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×Immobuffer缓冲液，0.5μL 50mM镁离子熔液，0.7μL的4×2.5mM dNTPs，0.5μL的5U/μL IMMOLASE DNA聚合酶，0.4μL的浓度为10μM探针，0.1μL浓度为10μM的每个带标签靶基因特异性引物，0.1μL浓度为10μM的每个靶基因不带标签引物，而后加入去离子水使得PCR反应体系达到23μL，最后加入2μL样本。
PCR反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
S27：带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验；
将带标签引物固定在每25μL反应体系0.1μL，而后调整不带标签引物的量从高到低为0.2μL，0.3μL，0.6μL和0.8μL，PCR反应体系中其余组分均保持一样，进行二维PCR反应寻找带标签引物与不带标签引物用量最优比例。
S28：探针浓度优化实验；
在带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验结果基础上设计探针的用量由低到高分别为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL以及0.5μL共5个反应体系，除了探针的用量和相应的去离子水的用量不同外，其余反应体系的组成成分相同。进行二维PCR反应寻找最优探针浓度。
S29：镁离子浓度优化实验；
设计镁离子量由低到高分别为0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL共5个反应体系，其余反应体系与引物和探针优化后的相同。进行二维PCR反应寻找最佳镁离子浓度。
图4为图1中检测多种高危型HPV的方法步骤S3的流程图。请参照图4，所述步骤S3包括：
S31：收集经流式荧光杂交法测得的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型共13种高危型HPV阳性的宫颈脱落细胞标本各50份，HPV均为阴性的正常宫颈脱落细胞样本50份，HBV阳性的标本10份，HCV阳性的标本10份；收集的样本置于-20℃存放。
S32：通过核酸提取试剂盒抽提DNA以及RNA，HCV RNA经逆转录成cDNA，核酸置于-20℃保存。
S33：高通量二维PCR体系特异性实验设计；
优化后得二维PCR体系中加入探针以及相应的所有靶基因上下游引物，分别检测包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的质粒样本以及HBV、HCV临床样本(如图6所示)。
S34：高通量二维PCR体系灵敏度实验设计；
将各型的质粒样本原液予以十倍梯度稀释，10^8拷贝/μL以上浓度的样本予以封存，各型质粒选用浓度为10^7拷贝/μL到10^1拷贝/μL用于灵敏度实验，通过实验观察各型质粒的最低检出限(如图7所示)。
S35：临床标本检测实验设计；
运用优化后的高通量二维PCR反应体系对临床样本分别从灵敏度、特异性、交叉反应、最低检出限及干扰实验等方面进行检测，并将检测结果与流式荧光杂交法实验结果相比较(如图8所示)。
S36：汇总实验数据，进行统计分析，从灵敏度及特异性等方面对高通量二维PCR进行方法学验证，评估高通量二维PCR单管闭管检测多种HPV筛查宫颈癌的价值及潜力。
需要说明的是：
本发明运用在碱基淬灭探针技术的基础上开创的一种高通量二维PCR(Two-dimensional PCR,2D PCR)技术实现单管闭管检测13种高危型HPV用于宫颈癌筛查，此技术可在单管中、闭管条件下，高通量检测并鉴定多种靶基因，操作简单且无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，适宜于大规模筛查。
碱基猝灭探针技术是指设计与靶基因不发生非特异性结合的探针序列，在探针5'端标记荧光基团，探针3'端用磷酸基团封闭。PCR结束时，由于碱基淬灭探针与靶DNA序列在较低温度条件下(如30℃)杂交，荧光基团发出的荧光被邻近的碱基(A，T，C或G)淬灭；当温度缓慢升高时，探针熔解脱离靶DNA，荧光急剧增加。根据不同等位基因间熔解温度(Tm)值有明显差异，探针可以依据Tm值准确识别靶序列。该技术以前多用于单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)的检测。
基于碱基猝灭探针基础上设计一组与检测探针序列同源且与检测探针反向互补的引物标签。二维PCR引物由带标签和不带标签的引物组成。靶基因特异性上游或下游引物中选取一条，在引物的5'末端引入一段标签序列组成带标签引物和不带标签引物，独立标签不具备靶基因特异性，与靶基因特异性引物链接后标签序列特异性地指代该靶基因。在PCR扩增过程中，标签序列会被另一条引物引导扩增产生标签的反向互补序列。在熔解曲线分析过程中，探针靶向识别于标签的反向互补序列，通过Tm值准确识别靶基因。因而在同一荧光检测通道中，只需一条探针即可识别多个靶基因，提高了检测通量，如果增设荧光通道，即可通过数条探针识别大量靶基因，每一个靶基因的Tm值都对应着一个温度以及荧光通道，相当于坐标系中一个点同时对应横坐标和纵坐标，此即为高通量二维PCR。运用这种方法可望实现单管闭管多种HPV分型检测，操作简单，反应时间短，无需额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，结果可靠稳定，可普及于众多医院，具有良好的经济效益和社会效益，适宜于大批量筛查工作。
基于上文的描述可知，本发明优点在于：
1、检测通量高：高通量二维PCR区别于传统PCR单管单基因检测，与多重PCR相比具有更高通量检测的优点，通过碱基猝灭探针与标签序列反向互补结合的原理，运用一个探针可单管检测多种靶基因，操作简单，降低成本，有较高的科学技术应用价值。
2、结果判读简单：高通量二维PCR将PCR反应与熔解曲线分析相结合，通过熔解温度来检测靶基因，从而实现闭管检测，较开管检测而言避免额外的产物鉴定仪器设备和复杂的处理过程，简略操作步骤，降低检测成本，避免因开管产物外溢造成实验室污染引起结果假阳性，提高结果的准确性。
3、可实现多通道检测：高通量二维PCR通过多个结合不同荧光基团的探针序列以及多个分别扩增不同HPV基因型的带标签和不带标签引物序列单管检测实现多通量检测，每一个靶基因检测结果都对应着相应的温度以及荧光通道，通过增加荧光通道可实现单管检测更多靶基因的目标，具有单管闭管检测实现高通量检测的优点。

Claims (6)

1.一种通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，包括以下步骤：
S1：建立二维PCR的探针及标签库；
S2：设计高通量二维PCR反应体系并进一步优化；
S3：二维PCR技术应用及性能评估。
2.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，所述步骤S1包括：
S11：针对常用的FAM、VIC、Cy5三个荧光检测通道，设计三个探针序列，并在5'端添加相应的荧光基团，3'端由磷酸基团封闭，如表1所示：
表1
Figure FDA0003525092390000011
S12：针对标签的反向互补序列即前标签设计多组与前标签同源的序列，以FAM荧光通道为例，前标签如表2所示：
表2
Figure FDA0003525092390000012
S13：将每组前标签序列与其对应的碱基猝灭探针进行熔解温度的探索，以FAM荧光通道为例，猝灭探针基团序列如表3所示；每管25μL PCR反应体系组成如下：2.5μL的10x无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子溶液，0.5μL的4×10mM dNTPs，0.25μL的5U/μL Taq DNA聚合酶，0.1μL 10μM的前标签，0.1μL的10μM的探针，加入去离子水补足反应体系至25μL；PCR反应程序如下：95℃10秒，30℃4分钟，而后荧光信号收集时温度持续上升至80℃；并依据获得的熔解温度和熔解曲线的优劣对前标签序列进行筛选,建立合适的探针及标签库。
表3
Figure FDA0003525092390000021
3.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，所述步骤S2包括：
S21：选择16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的共计13种高危型HPV基因亚型；人血红蛋白β亚基和血红蛋白δ亚基基因作为内参基因，用同一对引物扩增这两个基因，以下称HBB&HBD基因，并视为一个待检基因；
S22：设计三荧光通道检测模式：FAM荧光检测通道检测HPV16、18、31、33、58型及HBB&HBD基因；VIC荧光检测通道检测HPV35、39、45、51、52型；Cy5荧光检测通道中检测HPV56、59、68型；
S23：制备FAM荧光检测通道、VIC荧光检测通道及Cy5荧光检测通道的引物及探针，以FAM荧光检测通道为例，如表4所示；引物及探针均按照要求用缓冲液稀释为10μM；
表4
Figure FDA0003525092390000031
S24：制备包含不同HPV扩增子的质粒样本，质粒样本原液进行稀释，稀释完成后，每个HPV亚型质粒样本选用七个稀释的样本，浓度在10^1拷贝/μL到10^7拷贝/μL进行后续实验，余质粒样本予以冻存；
S25：进行单对引物单基因检测实验，以保证引物能成功扩增靶基因，探针能成功检测出待检靶基因；
S26：运用热启动Taq酶体系设计二维PCR反应体系；
设计每管25μL二维PCR反应体系为：2.5μL的无镁离子10×Immobuffer缓冲液，0.5μL50mM镁离子熔液，0.7μL的4×2.5mM dNTPs，0.5μL的5U/μL IMMOLASE DNA聚合酶，0.4μL的浓度为10μM探针，0.1μL浓度为10μM的每个带标签靶基因特异性引物，0.1μL浓度为10μM的每个靶基因不带标签引物，而后加入去离子水使得PCR反应体系达到23μL，最后加入2μL样本；
S27：带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验；
将带标签引物固定在每25μL反应体系0.1μL，而后调整不带标签引物的量从高到低为0.2μL，0.3μL，0.6μL和0.8μL，PCR反应体系中其余组分均保持一样，进行二维PCR反应寻找带标签引物与不带标签引物用量最优比例；
S28：探针浓度优化实验；
在带标签引物与不带标签引物用量比例优化实验结果基础上设计探针的用量由低到高分别为0.1μL、0.2μL、0.3μL、0.4μL以及0.5μL共5个反应体系，除了探针的用量和相应的去离子水的用量不同外，其余反应体系的组成成分相同；进行二维PCR反应寻找最优探针浓度；
S29：镁离子浓度优化实验；
设计镁离子量由低到高分别为0.5μL、0.75μL、1μL、1.25μL、1.5μL共5个反应体系，其余反应体系与引物和探针优化后的相同；进行二维PCR反应寻找最佳镁离子浓度。
4.根据权利要求3所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，步骤S25中，PCR反应体系如下：2.5μL的10×无镁离子缓冲液，1.5μL的25mM镁离子熔液，0.5μL的4×10Mm dNTPs，0.25μL的5U/μL的Taq DNA聚合酶，0.1μL的10μM带标签引物，0.1μL的10μM的不带标签引物，0.1μL的10μM探针，然后加入去离子水补足反应体系至23μL；每个HPV样本做3个孔。
PCR反应程序为：95℃2分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后温度由30℃持续上升至80℃持续收集荧光信号；最后40℃持续30秒。
5.根据权利要求3所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，步骤S26中，PCR反应程序为：95℃10分钟；95℃10秒，60℃30秒持续40个循环；随后由30℃连续升温至80℃并持续收集荧光信号；40℃冷却30秒。
6.根据权利要求1所述的通过高通量二维PCR单管闭管检测多种高危型HPV的方法，其特征是，所述步骤S3包括：
S31：收集经流式荧光杂交法测得的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型共13种高危型HPV阳性的宫颈脱落细胞标本各50份，HPV均为阴性的正常宫颈脱落细胞样本50份，HBV阳性的标本10份，HCV阳性的标本10份；收集的样本置于-20℃存放；
S32：通过核酸提取试剂盒抽提DNA以及RNA，HCV RNA经逆转录成cDNA，核酸置于-20℃保存；
S33：高通量二维PCR体系特异性实验设计；
优化后得二维PCR体系中加入探针以及相应的所有靶基因上下游引物，分别检测包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、56、52、58、59、68型在内的质粒样本以及HBV、HCV临床样本；
S34：高通量二维PCR体系灵敏度实验设计；
将各型的质粒样本原液予以十倍梯度稀释，10^8拷贝/μL以上浓度的样本予以封存，各型质粒选用浓度为10^7拷贝/μL到10^1拷贝/μL用于灵敏度实验，通过实验观察各型质粒的最低检出限；
S35：临床标本检测实验设计；
运用优化后的高通量二维PCR反应体系对临床样本分别从灵敏度、特异性、交叉反应、最低检出限及干扰实验等方面进行检测，并将检测结果与流式荧光杂交法实验结果相比较；
S36：汇总实验数据，进行统计分析，从灵敏度及特异性等方面对高通量二维PCR进行方法学验证，评估高通量二维PCR单管闭管检测多种HPV筛查宫颈癌的价值及潜力。
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