CN102101889A - 一种非洲猪瘟病毒vp73基因的原核表达蛋白及其制备方法 - Google Patents
一种非洲猪瘟病毒vp73基因的原核表达蛋白及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鉴定非洲猪瘟病毒抗体的VP73基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73基因序列，人工合成的VP73基因全长序列，构建了重组表达载体pET32a-VP73，测序验证后转化原核表达受体菌E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，重组融合蛋白分子量约65KD。经镍柱亲和层析纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应并且与猪瘟、猪细小、猪圆环、猪蓝耳、猪流感和猪伪狂犬等病毒血清无交叉反应。实验表明，表达的蛋白具有检测灵敏度高，特异性强，应用该抗原进行检测时绝无散毒危险，可作为鉴定非洲猪瘟病毒抗体的ELISA方法的检测抗原。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鉴定非洲猪瘟病毒抗体的VP73基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。
(二)背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。其临床症状主要特征包括高热、病程短、高死亡率、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能改变等。由于该病高传染性、高死亡率，给养猪业造成了巨大的经济损失，且野生宿主不可能被根除，因此对该病的防控面临着巨大挑战。
ASF尽管在我国从未发生，但随着国际间交往和进出口贸易的日益频繁，ASF跨边境传播的风险越来越大，如不引起足够重视，一旦发生该病将导致灾难性后果。由于ASF保护性免疫反应的复杂性，目前尚无理想的疫苗用于主动或被动免疫，防治上主要采用严格的诊断和检疫措施，因此建立快速、无感染性的诊断方法对我国十分必要。
(三)发明内容
本发明提供的非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法目的在于通过大肠杆菌表达系统表达VP73蛋白，为建立ASFV的ELISA检测方法提供检测抗原。提供一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高的原核表达检测抗原及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
非洲猪瘟病毒VP73基因片段含有1188个碱基，编码396个氨基酸残基，在用原核表达载体pET32a进行表达时，VP73基因片段与融合表达载体上的硫氧还蛋白(Trx)得到融合表达，融合蛋白Trx-VP73的分子量约为65KD。
VP73基因片段的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为：
1 ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC
1 M A S G G A F C L I A N D G K A D K I I
61 TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT
21 L A Q D L L N S R I S N I K N V N K S Y
121 GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC
41 G K P D P E P T L S Q I E E T H L V H F
181 AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT
61 N A H F K P Y V P V G F E Y N K V R P H
241 ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT
81 T G T P T L G N K L T F G I P Q Y G D F
301 TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT
101 F H D M V G H H I L G A C H S S W Q D A
361 CCTATTCAGGGTACCGCCCAGATGGGTGCCCATGGTCAGTTGCAAACCTTTCCTAGAAAC
121 P I Q G T A Q M G A H G Q L Q T F P R N
421 GGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTGGAGGGTGCCGTTTACACCTTGGTTGATCCA
141 G Y D W D N Q T P L E G A V Y T L V D P
481 TTCGGAAGACCTATTGTTCCAGGAACAAAGAATGCTTACAGAAACTTGGTTTACTACTGC
161 F G R P I V P G T K N A Y R N L V Y Y C
541 GAATACCCAGGAGAAAGATTGTATGAAAACGTTAGATTCGATGTTAATGGAAATTCCTTG
181 E Y P G E R L Y E N V R F D V N G N S L
601 GACGAATATTCCTCTGATGTCACAACCTTGGTCAGAAAATTTTGCATCCCAGGAGATAAA
201 D E Y S S D V T T L V R K F C I P G D K
661 ATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGTCAGGAGGTTTCTGTCGAGGGAACTTCCGGACCT
221 M T G Y K H L V G Q E V S V E G T S G P
721 TTGTTGTGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCTCACCAATCTAAACCTATTTTGACCGAT
241 L L C N I H D L H K P H Q S K P I L T D
781 GAAAATGATACCCAGAGAACCTGCTCTCATACCAACCCTAAATTCTTGTCCCAACATTTT
261 E N D T Q R T C S H T N P K F L S Q H F
841 CCAGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACCGAC
281 P E N S H N I Q T A G K Q D I T P I T D
901 GCAACCTATTTGGACATCAGAAGAAATGTTCATTACTCTTGTAATGGACCTCAAACCCCT
301 A T Y L D I R R N V H Y S C N G P Q T P
961 AAATACTATCAGCCACCTTTGGCTTTGTGGATTAAGTTGAGATTTTGGTTCAACGAGAAC
321 K Y Y Q P P L A L W I K L R F W F N E N
1021 GTCAACTTGGCTATTCCATCTGTTTCCATTCCATTCGGTGAGAGATTCATCACCATCAAA
341 V N L A I P S V S I P F G E R F I T I K
1081 TTGGCATCTCAAAAGGATTTGGTCAATGAATTTCCTGGATTGTTCATCAGACAGTCTAGA
361 L A S Q K D L V N E F P G L F I R Q S R
1141 TTCATCCCTGGAAGACCATCCAGAAGAAATATCAGATTCAAACCATGG
381 F I P G R P S R R N I R F K P W
本发明提供的非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法，其步骤如下：
1.人工合成VP73基因序列；
2.将VP73基因定向克隆至pET32a原核表达载体；
3.VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；
将重组表达载体pET32a-VP73转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，进行表达。
4.VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括：
(1)将E.coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以1％接种量，转接至新鲜配制的含有Amp(100μg/ml)的TB液体培养基200ml，37℃，250rpm振荡培养。
(2)待其OD600达到0.8-1.0，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，转移至30℃，250rpm振荡培养4h，12000rpm，4℃，3min离心收集菌体。
(3)将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(360W，30％，5min重复5次)，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。
(4)将包涵体沉淀分别用含2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea的PBS洗涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0.6mol/L NaCl，0.05mol/L NaH2PO4，10mM咪唑，8mol/L Urea，pH 8.0)。
(5)包涵体溶解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预先平衡)树脂结合1.5h，用4体积分别含40，60，80，120，150，200，250mmol/L咪唑的漂洗、洗脱缓冲液(0.6mol/LNaCl，0.05mol/LNaH2PO4，8mol/LUrea，pH 8.0)漂洗、洗脱蛋白，收集漂洗液和洗脱液，12％SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。
5、表达产物的Western-blot鉴定
(1)SDS-PAGE：将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V，40min后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。
(2)转膜：采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。
(3)封闭：电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4℃摇床缓慢摇动过夜。
(4)洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
(5)一抗孵育：将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用1％BSA倍比稀释(1∶3000)，摇床摇动1h。
(6)洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
(7)二抗孵育：将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用1％BSA倍比稀释(1∶5000)，摇床摇动1h。
(8)洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
(9)显色：30ml1×AP反应缓冲液buffer，BCIP、NBT各一管混匀，室温暗处缓慢摇动显色。
采用本发明的方法生产的产品可用于鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接-ELISA。
本发明的优点体现在：
1、由于该检测抗原是非洲猪瘟VP73基因片段原核表达蛋白，并非全病毒，因此应用该抗原进行检测时绝无散毒危险。
2、作为ELISA检测的抗原检测非洲猪瘟病毒抗体，其检测灵敏度高，特异性强，与猪瘟、猪细小、猪圆环、猪蓝耳、猪流感和猪伪狂犬等病毒血清无交叉反应。。
附图说明
图1Trx蛋白和Trx-VP73融合蛋白的SDS-PAGE蛋白质电泳图谱
图2Trx蛋白和Trx-VP73融合蛋白的Western blot鉴定图谱
下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1为SDS-PAGE蛋白质电泳图谱，其中泳道1为泳道纯化的Trx蛋白；2为蛋白质分子量标准，从上至下依次为：94.0kDa，66.2kDa，45.0kDa，35.0kDa，28.5kDa，20.0kDa，14.4kDa；泳道3为融合蛋白Trx-VP73。
图2为Trx蛋白和Trx-VP73融合蛋白的Western blot鉴定图谱，其中泳道1为纯化的Trx蛋白；2为蛋白质分子量标准，从上至下依次为：100kDa，62kDa，40kDa，30kDa，24kDa，14KDa；泳道3为融合蛋白Trx-VP73。
(四)具体实施方式
本发明提供的一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法的具体实施方式如下：
1.人工合成VP73基因序列；
2.将VP73基因定向克隆至pET32a原核表达载体；
3.VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；
将重组表达载体pET32a-VP73转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，进行表达。
4.VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括：
(1)将E.coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以1％接种量，转接至新鲜配制的含有Amp(100μg/ml)的TB液体培养基200ml，37℃，250rpm振荡培养。
(2)待其OD600达到0.8-1.0，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，转移至30℃，250rpm振荡培养4h，12000rpm，4℃，3min离心收集菌体。
(3)将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(360W，30％，5min重复5次)，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。
(4)将包涵体沉淀分别用含2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea的PBS洗涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0.6mol/LNaCl，0.05mol/LNaH2PO4，10mM咪唑，8mol/L Urea，pH 8.0)。
(5)包涵体溶解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预先平衡)树脂结合1.5h，用4体积分别含40，60，80，120，150，200，250mmol/L咪唑的漂洗、洗脱缓冲液(0.6mol/LNaCl，0.05mol/L NaH2PO4，8mol/L Urea，pH 8.0)漂洗、洗脱蛋白，收集漂洗液和洗脱液，12％SDS-PAGE电泳检测和非洲猪瘟阳性血清Western blot鉴定。
5、表达产物的Western-blot鉴定
(1)SDS-PAGE：将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V，40min后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。
(2)转膜：采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。
(3)封闭：电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4℃摇床缓慢摇动过夜。
(4)洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
(5)一抗孵育：将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用1％BSA倍比稀释(1∶3000)，摇床摇动1h。
(6)洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
(7)二抗孵育：将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用1％BSA倍比稀释(1∶5000)，摇床摇动1h。
(8)洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
(9)显色：30ml1×AP反应缓冲液buffer，BCIP、NBT各一管混匀，室温暗处缓慢摇动显色。
序列表
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白技其制备方法
<160>1
<210>1
<211>1188
<212>DNA
<213>非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400>1
atggcatccg gaggagcttt ttgtttgatt gctaacgatg gaaaggccga caagattatc 60
ttggcccaag acttgttgaa ctctagaatt tctaacatta aaaatgtcaa caaatcctat 120
ggtaaaccag acccagaacc aactttgtcc caaatcgaag aaacacattt ggttcatttc 180
aatgctcatt ttaagcctta tgttccagtt ggattcgaat acaataaggt tagacctcat 240
accggtaccc caaccttggg aaacaaattg acctttggta ttccacagta cggagacttt 300
ttccatgata tggtcggaca ccatatcttg ggtgcatgtc attcttcctg gcaggatgct 360
cctattcagg gtaccgccca gatgggtgcc catggtcagt tgcaaacctt tcctagaaac 420
ggatatgact gggacaacca aacacctttg gagggtgccg tttacacctt ggttgatcca 480
ttcggaagac ctattgttcc aggaacaaag aatgcttaca gaaacttggt ttactactgc 540
gaatacccag gagaaagatt gtatgaaaac gttagattcg atgttaatgg aaattccttg 600
gacgaatatt cctctgatgt cacaaccttg gtcagaaaat tttgcatccc aggagataaa 660
atgactggat ataagcactt ggtcggtcag gaggtttctg tcgagggaac ttccggacct 720
ttgttgtgca acattcatga tttgcacaag cctcaccaat ctaaacctat tttgaccgat 780
gaaaatgata cccagagaac ctgctctcat accaacccta aattcttgtc ccaacatttt 840
ccagagaact ctcacaatat ccaaacagca ggtaaacaag atattactcc tattaccgac 900
gcaacctatt tggacatcag aagaaatgtt cattactctt gtaatggacc tcaaacccct 960
aaatactatc agccaccttt ggctttgtgg attaagttga gattttggtt caacgagaac 1020
gtcaacttgg ctattccatc tgtttccatt ccattcggtg agagattcat caccatcaaa 1080
ttggcatctc aaaaggattt ggtcaatgaa tttcctggat tgttcatcag acagtctaga 1140
ttcatccctg gaagaccatc cagaagaaat atcagattca aaccatgg 1188
Claims (2)
1.一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白，其特征是该重组表达蛋白为硫氧还蛋白与非洲猪瘟病毒VP73基因编码的融合蛋白，其中非洲猪瘟病毒VP73基因的核苷酸序列为：
1 ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC
61 TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT
121 GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC
181 AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT
241 ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT
301 TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT
361 CCTATTCAGGGTACCGCCCAGATGGGTGCCCATGGTCAGTTGCAAACCTTTCCTAGAAAC
421 GGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTGGAGGGTGCCGTTTACACCTTGGTTGATCCA
481 TTCGGAAGACCTATTGTTCCAGGAACAAAGAATGCTTACAGAAACTTGGTTTACTACTGC
541 GAATACCCAGGAGAAAGATTGTATGAAAACGTTAGATTCGATGTTAATGGAAATTCCTTG
601 GACGAATATTCCTCTGATGTCACAACCTTGGTCAGAAAATTTTGCATCCCAGGAGATAAA
661 ATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGTCAGGAGGTTTCTGTCGAGGGAACTTCCGGACCT
721 TTGTTGTGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCTCACCAATCTAAACCTATTTTGACCGAT
781 GAAAATGATACCCAGAGAACCTGCTCTCATACCAACCCTAAATTCTTGTCCCAACATTTT
841 CCAGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACCGAC
901 GCAACCTATTTGGACATCAGAAGAAATGTTCATTACTCTTGTAATGGACCTCAAACCCCT
961 AAATACTATCAGCCACCTTTGGCTTTGTGGATTAAGTTGAGATTTTGGTTCAACGAGAAC
1021 GTCAACTTGGCTATTCCATCTGTTTCCATTCCATTCGGTGAGAGATTCATCACCATCAAA
1081 TTGGCATCTCAAAAGGATTTGGTCAATGAATTTCCTGGATTGTTCATCAGACAGTCTAGA
1141 TTCATCCCTGGAAGACCATCCAGAAGAAATATCAGATTCAAACCATGG
2.一种制备权利要求1所述的硫氧还蛋白与非洲猪瘟病毒VP73基因编码的融合蛋白的方法，其特征是：
(1)人工合成VP73基因序列；
(2)将VP73基因定向克隆至pET32a原核表达载体；
(3)VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；
将重组表达载体pET32a-VP73转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)7809，进行表达。
(4)VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括：
a.将E.coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以1％接种量，转接至新鲜配制的含有Amp(100μg/ml)的TB液体培养基200ml，37℃，250rpm振荡培养。
b.待其OD600达到0.8-1.0，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L，转移至30℃，250rpm振荡培养4h，12000rpm，4℃，3min离心收集菌体。
c.将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(360W，30％，5min重复5次)，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，得包涵体沉淀。
d.将包涵体沉淀分别用含2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea的PBS洗涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0.6mol/LNaCl，0.05mol/LNaH2PO4，10mM咪唑，8mol/L Urea，pH8.0)。
e.包涵体溶解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预先平衡)树脂结合1.5h，用4体积分别含40，60，80，120，150，200，250mmol/L咪唑的漂洗、洗脱缓冲液(0.6mol/LNaCl，0.05mol/LNaH2PO4，8mol/L Urea，pH8.0)漂洗、洗脱蛋白，收集漂洗液和洗脱液。12％SDS-PAGE电泳检测后，收集目的蛋白即为纯化蛋白。
(5)表达产物的Western-blot鉴定，主要包括：
a.SDS-PAGE：将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V，40min后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。
b.转膜：采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。
c.封闭：电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4℃摇床缓慢摇动过夜。
d.洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
e.一抗孵育：将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用1％BSA倍比稀释(1∶3000)，摇床摇动1h。
f.洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
g.二抗孵育：将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用1％BSA倍比稀释(1∶5000)，摇床摇动1h。
h.洗膜：TTBS洗膜4次，每次10min。
i.显色：30ml1×AP反应缓冲液buffer，BCIP、NBT各一管混匀，室温暗处缓慢摇动显色。
结果，纯化后的Trx-VP73融合蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清有特异性反应条带。
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