CN101085812B - 一种sars冠状病毒多肽抗原及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SARS冠状病毒多肽抗原及其应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1或者其衍生序列。本发明筛选的抗原表位LH21是由ORF3a基因所编码蛋白的N段，具有强免疫原性，该抗原表位具有临床诊断的应用价值，利用该表位制备的抗体可以应用于病毒抗原的检测。

Description

一种SARS冠状病毒多肽抗原及其应用

背景技术

非典型肺炎(SARS)是由一种新发现的冠状病毒(severe acuterespiratory syndrome associated coronavirus，Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2species)所引起。病毒的基因组由一条单链RNA组成，其中包含有14个开放式阅读框(ORF)。目前已知病毒编码的蛋白质包括：脂双层膜及其上的棒状膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜内部衣壳蛋白N，以及一些蛋白酶和复制酶，然而大多数的ORF是否编码蛋白质，以及他们的功能都不清楚(Rota PA，Oberste MS，The genome sequence ofthe ARS-associated coronavirus.Science.2003May 30；300(5624)：1399-404)。

ORF3a最近研究比较集中的SARS病毒基因之一。ORF3a(例如：序列为SEQ ID NO：4)编码了一个全长274个氨基酸的全新病毒蛋白(例如：序列为SEQ ID NO：5)，已有研究人员通过免疫印迹和蛋白质质谱的方法证明了这一病毒蛋白的存在，并推测其很可能是病毒的结构蛋白。通过生物信息学分析，该蛋白具有3个跨膜区，与其他已知蛋白的同源性很低(吴家睿，曾嵘等，申请号：200310108604.X)。虽然通过很多不同的实验方法都证明了3a蛋白的存在，但是关于这一蛋白功能的研究还很少，而现有的文献都没有能够阐明该蛋白在病毒周期中的作用。(Naoto Ito，Eric C.Mossel，KrishnaNarayanan，Vsevolod L.Popov，et al.，Severe acute respiratory syndromecoronavirus 3a protein is a viral structural protein，2005，J.Virol.79，3182-3186)。同时，也未见有利用其全蛋白或者部分多肽序列作为抗原免疫动物的报道。

目前通常使用的SARS临床检测手段如PCR检测病毒DNA等方法可靠性低、操作性差，操作不够方便。且目前的SARS免疫检测的检测成本较高。(Poon，Leo L.M.，Chan，Kwok Hung，et al.Early diagnosis of SARScoronavirus infection by real time RT-PCR.J.Clin.Virol.2003，28，233-238)。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明需要解决的技术问题为了克服上述缺陷，提供一系列强免疫原性的多肽抗原及其多克隆、单克隆抗体，同时指明其检测SARS冠状病毒抗体或者抗原的方法。

技术方案

本发明的技术方案之一提供是一种SARS冠状病毒多肽抗原，其特征在于，该多肽抗原具有适合于制备抗体的免疫原性，并具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO：1经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。特别地，所述的抗体为具有病毒和抗原特异性的多克隆抗体或单克隆抗体。

上述的SARS冠状病毒多肽抗原的一种优选方案为，与序列表中SEQ IDNO：4所述序列中的10-72位的碱基所编码蛋白质序列SEQ ID NO：5同源。

本发明的技术方案之二为提供一种抗体，该抗体特异性地与技术方案之一所述的SARS冠状病毒多肽抗原结合。

上述的抗体的一种优选方案为，该抗体是技术方案之一的SARS冠状病毒多肽抗原的多克隆抗体，且由下列制备方法所制备，步骤包括：

(1)提供技术方案之一所述的多肽；

(2)将多肽与载体蛋白偶连，并与佐剂一起免疫动物；

(3)取动物的抗血清过抗原偶连的亲和层析柱纯化，即得到所述的抗体。

上述的抗体的另一种优选方案为，该抗体是技术方案之一的SARS冠状病毒多肽抗原的单克隆抗体，是由下列制备方法所制备的，步骤包括：

(1)提供技术方案之一所述的多肽；

(2)将多肽与载体蛋白偶连，并与佐剂一起免疫小鼠；

(3)分离小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株融合；

(4)加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株；

(5)克隆化筛选，即可获得单克隆抗体细胞株；

(6)将单克隆抗体细胞株植入小鼠体内，分泌所需要的单克隆抗体。

本发明的技术方案之三为提供一种SARS冠状病毒抗体的检测方法，其特征在于，利用技术方案一所述的SARS冠状病毒多肽抗原包被检测基质，以ELISA法检测抗SARS冠状病毒抗体。

本领域的普通技术人员无需特别的实验即可理解，所述的ELISA法检测是指酶联免疫分析。即利用多肽抗原特异性地结合待测溶液中的SARS冠状病毒抗体，然后加入标记的二抗检测，最后读取波长为450nm的OD值。按照该方法，只要对照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的SARS冠状病毒抗原含量。其检测SARS冠状病毒抗体的步骤包括：

(1)以5ng/mL的浓度抗原多肽包被；

(2)一系列浓度梯度的SARS冠状病毒抗体、待测样品，37摄氏度共温育一个小时；

(3)在包被板上加入待测的共温育过的样品，37摄氏度孵育两个小时；

(4)加入HRP标记的抗人抗体作为二抗，37摄氏度孵育一个小时；

(5)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD；

(6)与标准曲线对照后即可获得抗原浓度。

这些步骤并不是一成不变的，本领域的普通技术人员可以根据实际情况进行合理的修改使之符合应用要求。比如在合适的过程中增加洗涤的步骤以降低检测结果的本底等等。

本发明的技术方案之四为提供一种SARS冠状病毒抗原的检测方法，其特征在于，利用技术方案之三所述的抗体包被检测基质，以免疫印记法检测SARS冠状病毒抗原。一种优选方式为，使用上述的多克隆抗体，更优选使用上述的单克隆抗体。

上述两种技术方案所述的免疫印记法是本领域的普通技术人员熟知的，借助抗体对抗原进行检测的方法，可以是定性的检测，也可以是定量的检测，达到检测目的的具体试验方案可以参考分子生物学的各实验手册、或者是购买市售的检测试剂盒，按照其说明书的指示进行检测操作。

有益效果

本发明制备了针对3a的特异性抗体，在3a蛋白的N段发现了三段人工设计多肽序列中的一段(LH21)是具有高抗原性的蛋白表位，其所在氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

应用该氨基酸序列设计合成的多肽可以应用于SARS的临床诊断。与目前通常使用的SARS临床检测手段相比，酶联免疫方法具有安全可靠，可操作性高，使用方便的特点，而利用抗原多肽作为抗原检测样品中的特异性抗体，则使得设计和生产检测试剂盒更加快速简便。利用LH-21设计制造的SARS检测试剂盒具有极高的特异性和亲和力，为降低检测成本，节省检测时间，提高准确率提供了可能。

应用合成的LH-21多肽免疫动物后获得了具有极高效价和特异性的单抗与多抗。这些抗体对病毒裂解液中的SARS病毒3a蛋白能够特异性的识别，可以在临床检测和病毒基础研究中发挥重要的作用。

附图说明

图1是使用anti-LH21抗体对SARS-CoV感染FRhK-4细胞提取物的聚丙稀酰胺凝胶电泳免疫印迹检测结果。

图2是使用LH-21多肽作为抗原包被，分别检测正常人和SARS病人血清中抗3a蛋白的抗体。

图3是LH21、LH22和LH23的抗原效价比较，显示LH21在三条多肽中的抗原性最强。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂和Sigma公司。

实施例1

针对3a蛋白特异性抗体的制备

利用生物软件，分析了3a蛋白的抗原性(病毒株为SARS coronavirusGZ50；Viruses；ssRNA positive-strand viruses，no DNA stage；Nidovirales；Coronaviridae；Coronavirus；Group 2species。GeneBank号为：AAS00004。来源为香港大学郑伯建教授)，在蛋白中选择了三条(抗原性较高的氨基酸序列，并命名为LH21(4-24位Amino acids SEQ ID NO：1FMRFFTLGSITAQPVKIDNAS)、LH22(211-231位Amino acids SEQ IDNO：2YYQLESTQITTDTGIENATFF)和LH23(251-271位Amino acids SEQID NO：3SSGVANPAMDPIYDEPTTTTS)。采用化学方法合成这三条多肽(吉尔生化(上海)有限公司)。将多肽分别溶解在PBS缓冲液中，通过戊二醛与载体蛋白BSA偶连。化学偶连2个小时后，加入glysin终止反应，并对反应体系透析过夜。使用偶连有载体蛋白的三种多肽抗原分别免疫兔子。先抗原稀释到1mg/mL，取1mL抗原与1mL完全弗氏佐剂乳化，对动物皮下，皮内，足掌三点注射，3周后，取同样剂量的抗原和不完全弗氏佐剂乳化，对动物进行加强免疫，第二次加强免疫后第七天，处死动物，取出抗血清。将抗原偶连到层析柱上，利用亲和层析的方法对抗血清进一步的纯化。洗脱下来的即为高亲和力和特异性的抗3a蛋白的多克隆抗体。

将三种抗体分别用于ELISA，以病毒裂解液为底物，检测所制备的抗体效价，结果显示针对LH-21的抗体能特异性的识别3a蛋白，并且效价很高。因此，LH21在三条多肽中的抗原性最强，免疫后效果最好。

采用相同的抗原免疫小鼠，对小鼠皮下，皮内，足掌三点注射，3周后，取同样剂量的抗原和不完全弗氏佐剂乳化，对动物进行加强免疫，第二次加强免疫后第七天，处死动物，分离小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞株融合；加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株；克隆化筛选，即可获得单克隆抗体细胞株；将单克隆抗体细胞株植入小鼠体内，分泌所需要的单克隆抗体。(图3)

实施例2

使用anti-LH21抗体检测病毒感染的细胞中3a蛋白的表达

取上述SARS-CoV感染的FRhK-4细胞，先用PBS缓冲液洗细胞几遍。直接使用1×SDS细胞裂解缓冲液，冰上裂解细胞15分钟。对细胞裂解液进行超声粉碎，沸水煮5分钟后用于SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳，并分别与anti-LH21多克隆抗体和单克隆抗体37摄氏度温育2小时，染色观察免疫印迹结果。(图1)

实施例3

表位多肽LH-21的应用，即ELISA法检测样品中抗SARS冠状病毒抗体

表位多肽以5ng/mL的浓度包被；与一系列浓度梯度的SARS冠状病毒抗体对照、及待测样品，37摄氏度共温育一个小时；在包被板上加入待测的共温育过的样品，37摄氏度孵育两个小时；加入HRP标记的抗人抗体作为二抗，37摄氏度孵育一个小时；洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD；与标准曲线对照后即可获得抗原浓度。(图2)

实施例4

anti-LH21多克隆抗体应用，即免疫印记法检测SARS冠状病毒抗原

将待测样品与SARS病毒3a蛋白标准品阳性对照和阴性对照在SDS/PAGE上做蛋白凝胶电泳，并将蛋白电转移到硝酸素纤维膜上，经过5％BSA的封闭后，将anti-LH21多克隆抗体稀释成150ng/mL的浓度室温孵育2个小时，PBS洗3边，每次5分钟后。再用HRP标记的抗兔的第二抗温育一个小时；PBS洗涤；最后加入HRP底物；采用ECL化学发光显色。这样就可以检测样品中是否含有SARS病毒3a蛋白。将病毒抗原对照的条带亮度相对于其抗原浓度作标准曲线，对照待测样品还可获得抗原浓度。

实施例5

anti-LH21单克隆抗体应用，即免疫印记法检测SARS冠状病毒抗原

以anti-LH21单克隆抗体替代实施例4中的多克隆抗体，按照实施例4的方法检测样品中有无抗原以及抗原浓度。

核苷酸/氨基酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种SARS冠状病毒多肽抗原及其应用

<130>2006052901

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>PRT

<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus

<220>

<221>抗原多肽

<222>(1)..(21)

<400>1

Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln Pro Val Lys

1               5                   10                  15

Ile Asp Asn Ala Ser

            20

<210>2

<211>21

<212>PRT

<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus

<220>

<221>抗原多肽

<222>(1)..(21)

<400>2

Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly Ile Glu

1               5                    10                 15

Asn Ala Thr Phe Phe

             20

<210>3

<211>21

<212>PRT

<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus

<220>

<221>抗原多肽

<222>(1)..(21)

<400>3

Ser Ser Gly Val Ala Asn Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro

1               5                   10                  15

Thr Thr Thr Thr Ser

             20

<210>4

<211>825

<212>DNA

<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus

<220>

<221>结构蛋白基因

<222>(1)..(825)

<400>4

atggatttgt ttatgagatt ttttactctt ggatcaatta ctgcacagcc agtaaaaatt  60

gacaatgctt ctcctgcaag tactgctcat gctacagcaa cgataccgct acaagcctca  120

ctccctttcg gatggcttgt tattggcgtt gcatttcttg ctgtttttca gagcgctacc  180

aaaataattg cgctcaataa aagatggcag ctagcccttt ataagggctt ccagttcatt  240

tgcaatttac tgctgctatt tgttaccatc tattcacatc ttttgcttgt cgctgcaggt  300

atggaggcgc aatttttgta cctctatgcc ttgatatatt ttctacaatg catcaacgca  360

tgtagaatta ttatgagatg ttggctttgt tggaagtgca aatccaagaa cccattactt  420

tatgatgcca actactttgt ttgctggcac acacataact atgactactg tataccatat  480

aacagtgtca cagatacaat tgtcgttact gaaggtgacg gcatttcaac accaaaactc  540

aaagaagact accaaattgg tggttattct gaggataggc actcaggtgt taaagactat  600

gtcgttgtac atggctattt caccgaagtt tactaccagc ttgagtctac acaaattact  660

acaaacactg gtattgaaaa tgctacattc ttcatcttta acaagcttgt taaagaccca  720

ccgaatgtgc aaatacacac aatcgacggc tcttcaggag ttgctaatcc agcaatggat  780

ccaatttatg atgagccgac gacgactact agcgtgcctt tgtaa                  825

<210>5

<211>274

<212>PRT

<213>severe acute respiratory syndrome associated coronavirus

<220>

<221>病毒结构蛋白

<222>(1)..(274)

<400>5

Met Asp Leu Phe Met Arg Phe Phe Thr Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gln

1                5                   10                  15

Pro Val Lys Ile Asp Asn Ala Ser Pro Ala Ser Thr Val His Ala Thr

              20               25                   30

Ala Thr Ile Pro Leu Gln Ala Ser Leu Pro Phe Gly Trp Leu Val Ile

       35                   40                    45

Gly Val Ala Phe Leu Ala Val Phe Gln Ser Ala Thr Lys Ile Ile Ala

    50                 55                   60

Leu Asn Lys Arg Trp Gln Leu Ala Leu Tyr Lys Gly Phe Gln Phe Ile

65                 70                  75                  80

Cys Asn Leu Leu Leu Leu Phe Val Thr Ile Tyr Ser His Leu Leu Leu

                85                90                    95

Val Ala Ala Gly Met Glu Ala Gln Phe Leu Tyr Leu Tyr Ala Leu Ile

           100                 105                110

Tyr Phe Leu Gln Cys Ile Asn Ala Cys Arg Ile Ile Met Arg Cys Trp

         115              120               125

Leu Cys Trp Lys Cys Lys Ser Lys Asn Pro Leu Leu Tyr Asp Ala Asn

    130                 135                 140

Tyr Phe Val Cys Trp His Thr His Asn Tyr Asp Tyr Cys Ile Pro Tyr

145             150                 155                  160

Asn Ser Val Thr Asp Thr Ile Val Val Thr Glu Gly Asp Gly Ile Ser

             165              170                 175

Thr Pro Lys Leu Lys Glu Asp Tyr Gln Ile Gly Gly Tyr Ser Glu Asp

       180                   185              190

Arg His Ser Gly Val Lys Asp Tyr Val Val Val His Gly Tyr Phe Thr

    195                 200                 205

Glu Val Tyr Tyr Gln Leu Glu Ser Thr Gln Ile Thr Thr Asp Thr Gly

  210                   215                 220

Ile Glu Asn Ala Thr Phe Phe Ile Phe Asn Lys Leu Val Lys Asp Pro

225                  230                235                 240

Pro Asn Val Gln Ile His Thr Ile Asp Gly Ser Ser Gly Val Ala Asn

                245               250                 255

Pro Ala Met Asp Pro Ile Tyr Asp Glu Pro Thr Thr Thr Thr Ser Val

             260              265                 270

Pro Leu

Claims (3)

1.一种SARS冠状病毒多肽抗原，其特征在于，该多肽抗原具有适合于制备抗体的免疫原性，并且其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的SARS冠状病毒多肽抗原，其特征在于，所述的抗体为具有病毒抗原特异性的多克隆抗体或单克隆抗体。

3.一种SARS冠状病毒抗体，其特征在于，所述的抗体特异性地与权利要求1所述的SARS冠状病毒多肽抗原结合。

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