CN112646006B - 一种用于covid-19轻重症分型诊断的标志物抗原表位多肽及其应用 - Google Patents

一种用于covid-19轻重症分型诊断的标志物抗原表位多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了本发明提供了一种用于COVID‑19轻重症分型诊断的抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。本发明同时还提供了基于上述抗原表位多肽制备的探针以及用于COVID‑19轻重症分型的诊断试剂。本发明提供的抗原表位多肽与轻重症患者血清中的IgG反应后显示出显著不同的丰度，可用于对COVID‑19轻重症患者的快速诊断分型。

Description

一种用于COVID-19轻重症分型诊断的标志物抗原表位多肽及 其应用
技术领域
本发明涉及医疗诊断技术领域，具体涉一种用于COVID-19轻重症分型诊断的标志物抗原表位多肽及其应用。
背景技术
COVID-19是2020年全球大流行的疾病，由新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起，主要通过飞沫和接触污染物表面进行传播，研究发现SARS-CoV-2可以在物体表面上生存3-4天，这种传播特性使得该病毒的传染率显著升高。人群感染后可能表现为无症状，也可能引起广泛的症状，最常见的三种症状是发烧、咳嗽和气短。其他症状包括虚弱、疲劳、恶心、呕吐、腹泻、味觉和嗅觉改变，但因其能合并多脏器的多种严重致病的并发症，使其恶性程度也显著增加。
COVID-19的诊断通常是通过鼻咽拭子的聚合酶链反应来检测，考虑到假阴性试验结果率，也可以结合临床、检验和影像学检查结果判定诊断结果，例如血清学检测和胸片结果。但是从死亡率统计，COVID-19本身的致死率并不高，大约为2.6％，而其院内总死亡率约为15％至20％，特别是在需要重症监护的患者中高达40％。这也就意味着，如果能及时区分患者的轻重症程度，迅速规划有效的治疗程序，能有效地降低院内死亡率，甚至大幅减少重症监护患者的数量。而针对其轻重症患者，目前还未见可用的检测方法。
SARS-CoV-2病毒的表面刺突糖蛋白(Spike，S)是非常重要的抗原成分，位于病毒表面，是病毒的融合蛋白，负责冠状病毒与宿主细胞受体结合，介导SARS-CoV-2感染的第一步，在某些情况下，S蛋白也能在感染后期诱导细胞与细胞间的融合。S蛋白包括S1和S2两个亚基，组成一个同源三聚体结构，其中S1-胞外结构域识别宿主细胞表面受体而S2-膜锚定蛋白参与病毒进入宿主细胞。S1亚区有三个受体结合区(receptor-binding domain,RBD)，其3个RBD中的1个会向上螺旋，突出的序列让S蛋白形成能够轻易与宿主受体ACE2结合的空间构象。目前进入临床试验的40多个疫苗研究大部分都是以S蛋白或者其编码DNA/RNA为主要靶标。
表位是存在于抗原表面的，决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团，又称为抗原决定簇。抗原是通过表位与相应淋巴细胞表面的受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答。单个抗原分子可具有一种或多种不同的表位，每种表位只有一种抗原特异性。因此，表位是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的基础，一般包含5～7个氨基酸和单糖残基的大小，至多不超过20个氨基酸残基。有研究表明，在住院和非住院的COVID-19病人之间，存在特异的抗体反应，这为筛选出轻重症病人特异性表位提供了理论基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助轻症重症COVID-19的鉴别诊断方法，以利于快速对确诊病人进行轻重症分型和筛查，提高就诊效率。具体的是通过检测病人血清中针对特异性表位区域：SRBD第343-360位表位多肽(SEQ ID NO:1NATRFASVYAWNRKRISN)和SRBD第445-462位表位多肽(SEQ ID NO:2VGGNYNYLYRLFRKSNLK)的应答强度，以此辅助COVID-19轻重症的的鉴别诊断。
本发明提供了一种用于COVID-19轻重症分型诊断的抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
本发明还提供了一种用于COVID-19轻重症分型诊断的探针，包含氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的抗原表位多肽中的一种，以及偶联在所述抗原表位多肽上的多肽标记。
在根据本发明的一个实施方案中，所述多肽标记为生物素或荧光标记。
本发明的另一方面还提供了上述抗原表位多肽在制备用于COVID-19轻重症分型的诊断试剂中的应用。
本发明还进一步提供了一种用于COVID-19轻重症分型的诊断试剂，包含上述的抗原表位多肽中的一种或两种。
在根据本发明的一个实施方案中，所述抗原表位多肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。
在根据本发明的一个实施方案中，所述抗原表位多肽偶联有荧光标记基团。
在根据本发明的一个实施方案中，还包含特异性识别人IgG抗体的第二抗体。
在根据本发明的一个实施方案中，所述第二抗体选自兔抗人单克隆抗体、兔抗人多克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体、鼠抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中，所述第二抗体偶联有荧光标记基团，或者，所述抗原表位多肽偶联有特异性荧光基团，所述第二抗体偶联有激活或猝灭所述特异性荧光基团的配合基团。
本发明的有益效果是：
本发明提供的用于COVID-19轻重症分型诊断的标志物抗原表位多肽可与患者体内的特异性IgG结合，并且在轻重症患者中的结合结果具有显著差异，因而，可以用于辅助COVID-19轻重症患者的快速分型诊断。
附图说明
图1为COVID-19轻症、重症和健康人抗SRBD-5lgG抗体的抗体水平示意图。
图2为COVID-19轻症、重症和健康人抗SRBD-22lgG抗体水平示意图。
图3为抗SRBD-5lgG抗体水平诊断COVID-19的ROC曲线分析图。
图4为抗SRBD-22lgG抗体水平诊断COVID-19的ROC曲线分析图。
图5为抗SRBD-5lgG抗体水平鉴别诊断COVID-19轻重症ROC曲线分析图。
图6为抗SRBD-22lgG抗体水平鉴别诊断COVID-19轻重症ROC曲线分析图。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1 COVID-19轻症、重症患者血清抗SRBD-5、SRBD-22特异性水平的检测
1.试验方法
血清准备：收集健康人血清24份，按照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》标准，临床确诊为轻症的患者血清50份，临床确诊为重症的患者血清30份，所有血清经56℃灭活30min后，-20℃冻存。
磁珠准备：将购买的luminex磁珠按照说明书要求进行偶联，PBST清洗干净后将链霉亲和素以30ug/250万个磁珠的比例加入，37℃，200rpm避光反应2h，PBST清洗3次后配置成母液，4℃保存。
实验步骤：
1)将偶联生物素的SRBD_5和SRBD_22分别按2ug/2500个磁珠的比例加入两种不同的磁珠中，37℃，200rpm避光反应1h，PBST清洗3次后合并两种磁珠，加入PBST，使其理论值为50个/ul。
2)将磁珠按50ul/孔分装至96孔板中，弃上清，将血清按1:320的比例稀释后，加入装有磁珠的96孔板中，每个反应设双复孔，设计不偶联多肽的磁珠为空白对照，37℃，200rpm避光反应1h，PBST清洗3次，弃上清。
3)Goat F(ab')2Anti-Human IgG-Fc(PE)以1:2500稀释后加入到96孔板中，50ul/孔，37℃，200rpm避光反应40min，PBST清洗3次，弃上清，加入PBST100ul/孔，振荡备用。
4)96孔板上机检测，每种磁珠最少检测50个，测定各孔中两种磁珠的荧光值。
2.试验结果
如图1所示，健康人血清针对SRBD_5的中位数荧光值为47.40±9.10,COVID-19患者血清针对SRBD_5的中位数荧光值为319.83±8.63,与健康人相比有显著统计学差异(P<0.05))。轻症COVID-19患者血清针对SRBD_5的中位数荧光值为288.76±8.00,重症患者血清针对SRBD_5的中位数荧光值为371.62±16.30，二者相比有显著统计学差异(P<0.05))。
如图2所示，健康人血清针对SRBD_22的中位数荧光值为53.20±13.23,COVID-19患者血清针对SRBD_22的中位数荧光值为318.47±8.61,与健康人相比有显著统计学差异((P<0.05))。轻症COVID-19患者血清针对SRBD_22的中位数荧光值为285.27±8.12,重症患者血清针对SRBD_22的中位数荧光值为373.81±15.16，二者相比有显著统计学差异(P<0.05)。
实施例2 COVID-19健康人、轻症、重症特异性应答ROC曲线分析
1.试验方法
ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AU>0.5的情况下，AU越接近于1，说明诊断准确度越好。ROC曲线将灵敏度与-特异性以图示方法结合在一起，可准确反映分析方法特异性和敏感性的关系，是试验准确性的综合代表。该发明采用GraphPad8.0.1for windows软件绘制SRBD_5、SRBD_22的20份健康血清、50名临床轻症患者血清和30份临床重症的患者血清的ROC曲线，计算曲线下面积(AU)，判定灵敏度和特异度。
2.试验结果
如图3所示，抗SRBD_5抗体水平作为诊断COVID_19的ROC曲线AUC面积为：(SE＝0.9984，95％CI为0.9946-1.000)；如图4所示的，抗SRBD_22抗体水平作为诊断COVID_19的ROC曲线AUC面积为：(SE＝0.9870，95％CI为0.9661-1.000)。表明抗SRBD_5抗体水平和SRBD_22抗体水平可作为COVID_19的诊断依据：
抗SRBD_5抗体水平作为鉴别诊断轻重症COVID_19的ROC曲线AUC面积为：(SE＝0.8317，95％CI为0.7331-0.9303)(图5)；抗SRBD_22抗体水平作为鉴别诊断轻重症COVID_19的ROC曲线AUC面积为：(SE＝0.8430，95％CI为0.7473-0.9387)(图6)。表明抗SRBD_5抗体水平和SRBD_22抗体水平可作为COVID_19轻重症的诊断依据。
上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种用于COVID-19轻重症分型诊断的标志物抗原表位多肽及其应用
<141> 2021-01-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 2019冠状病毒疾病(COVID-19)
<400> 1
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
1 5 10 15
Ser Asn
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 2019冠状病毒疾病(COVID-19)
<400> 2
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
1 5 10 15
Leu Lys

Claims (10)

1.一种用于COVID-19轻重症分型诊断的抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
2.一种用于COVID-19轻重症分型诊断的表位多肽，其特征在于，包含氨基酸序列为SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的的多肽，以及偶联在所述多肽上的多肽标记。
3.如权利要求2所述的表位多肽，其特征在于，所述多肽标记为生物素标记或荧光标记中的一种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗原表位多肽在制备用于COVID-19轻重症分型诊断试剂中的应用。
5.一种用于COVID-19轻重症分型的诊断试剂，其特征在于，包含如权利要求1所述的抗原表位多肽中的一种或两种。
6.如权利要求5所述的诊断试剂，其特征在于，所述抗原表位多肽包被于检测载体上，所述检测载体选自聚苯乙烯微量反应板、胶体金试剂条、磁珠和微流控芯片中的任一种。
7.如权利要求6所述的诊断试剂，其特征在于，所述抗原表位多肽偶联有生物素或荧光标记。
8.如权利要求5所述诊断试剂，其特征在于，还包含特异性识别人IgG抗体的第二抗体。
9.如权利要求8所述的诊断试剂，其特征在于，所述第二抗体选自兔抗人单克隆抗体、兔抗人多克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体、鼠抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体中的一种。
10.如权利要求9所述的诊断试剂，其特征在于，所述第二抗体偶联有荧光标记基团，或者，所述抗原表位多肽偶联有特异性荧光基团，所述第二抗体偶联有激活或猝灭所述特异性荧光基团的配合基团。
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