CN110818800A - 一种通过构建桥连复合物间接检测目的分析物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过构建桥连复合物间接检测目的分析物的检测方法，该目的分析物可以是抗原、抗体或小分子等。通过所述方法检测目的分析物，可以有效解决化学交联方式包被标记过程中，蛋白活性位点暴露不全所致反应活性降低；部分蛋白疏水性强，化学交联方式包被标记效率低下；多种蛋白混合包被不均一，CV值大的问题；亦可保护靶向分析物，防止降解。有效提高了待测分析物的灵敏度和特异性。

Description

一种通过构建桥连复合物间接检测目的分析物的检测方法

技术领域

本发明涉及医学体外诊断领域，具体地，本发明提供了一种通过构建桥连复合物间接检测目的分析物的检测方法。

背景技术

目前常用的抗原、抗体、小分子检测方法主要有：1.免疫荧光技术；2.放射免疫分析法；3.酶联免疫分析法。

免疫荧光技术(immunofluorescence technique)是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法，包括直接荧光法和间接荧光法。

放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，该方法可进行超微量分析，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物，但是由于需要采用放射性同位素，导致操作不安全，应用范围受限。

酶联免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是当前应用最广泛的免疫检测方法。将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。

无论采用那一种方法，为了获取相关的检测信号，无一例外的都需要使用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原的方式，需要将相应检测指标捕获抗体或抗原包被或物理吸附至相应载体，比如微球、或微孔板。

虽然现有的检测方法对于某些蛋白可以提供具有一定准确性和一定灵敏度的检测结果，但是对于某些待检测的分析物，目前仍缺乏令人满意的检测方法，其中包括不稳定或半衰期短的目的分析物(如不稳定的蛋白)，以及在包被过程中活性位点或靶位点被隐蔽或遮盖的蛋白(包括目标蛋白或用于检测分析物的检测用试剂，例如酶、或抗原、或抗体等)。

众所周知，细胞内蛋白质降解是生命的重要过程，绝大多数蛋白的降解是服从一级反应动力学，半衰期从几十秒到百余天不等，哺乳动物细胞内蛋白的平均周转率1-2天，代谢过程中的关键酶以及处于分支点的酶寿命仅几分钟，蛋白半率期并不恒定，与细胞的生理状态亦密切相关。部分检测靶标蛋白容易被降解为多肽片段，导致后续检测困难，准确性下降，以及灵敏度降低。

目前，蛋白包被工艺主要是通过蛋白的氨基与固相载体或微球表面的羧基反应。然而，蛋白包被方法受蛋白的氨基酸组成影响较大，暴露的氨基含量能极大地影响包被的效率；同时，与羧基发生反应的氨基位点是随机的，当蛋白活性位点处的氨基大量与包被载体的羧基连接时，容易造成蛋白特异性结合的位点被占用无法完全暴露，极大地降低反应活性，响应试剂性能，从而导致检测结果可靠性和精确性降低。

综上所述，为了检测某些易降解或难以包被的目标分析物，本领域迫切需要开发新的、高灵敏度和高准确性地检测这些目标分析物的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高灵敏度和高准确性地检测降解或难以包被的目标分析物的方法。

在本发明的第一方面，一种多元桥连复合物，所述复合物的结构如式Ia或Ib所示：

Z0-(A-B-C-D)n (Ia)

式中的各元件包括：

Z0为固相载体；

A为标签蛋白，交联至固相载体表面的蛋白或多肽片段或核苷酸适配体或小分子等；

B为第一结合蛋白，并且所述的B与A特异性结合；

C为第二结合蛋白，并且所述的C与B特异性结合；并且，B和C中有且只有一个为待测的目标分析物；

D为标记蛋白，所述的D带有可检测标记，其中，在式Ia中，D为与C特异性结合的蛋白；而在式Ib中，D为与B特异性结合的蛋白，并且

n为≥1；

“-”为键或连接基团。

在另一优选例中，所述的B为待测的目标分析物。

在另一优选例中，所述的C为待测的目标分析物。

在另一优选例中，所述的待测的目标分析物包括抗原、抗体、小分子或其组合。

在另一优选例中，n为≥2的正整数。

在另一优选例中，n为5-1×10⁸，较佳地1×10-1×10⁷；更佳地1×10²-1×10⁶。

在另一优选例中，所述固相载体材质选自下组：金属、玻璃、胶体、塑料或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体材质包括：均聚物、共聚物、或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、或其组合。

在另一优选例中，所述的固相载体材质选自下组：微球、微孔板、板条、试管、或其组合。

在另一优选例中，所述标签蛋白A选自下组：肽段(包括标签肽段、特异性多肽片段(如来自配体或抗体的肽段))、核酸适配体、激素类小分子或其组合。

在另一优选例中，所述的标签蛋白A选自下组：His标签、GST标签、HA标签、c-Myc标签、Flag标签、或其组合。

在另一优选例中，所述第一结合蛋白B选自下组：抗原、抗体、配体、受体或其组合。

在另一优选例中，所述的第一结合蛋白B包括难以包被的蛋白。

在另一优选例中，所述的“难以包被的蛋白”指当一蛋白被包被于固相载体时，活性位点或靶位点被遮蔽的蛋白。

在另一优选例中，所述第一结合蛋白B包括易降解的蛋白。

在另一优选例中，所述的“易降解”指在在2-8℃保存条件下，半衰期t_1/2≤24小时(较佳地≤12小时，更佳地≤6小时，最佳地≤3小时)的蛋白(通常，生化、免疫常规检测项目需要在1个工作日内给出结果)。

在另一优选例中，所述的保存条件指在所述蛋白处于血液或血浆或血清中，并在2-8℃保存。

在另一优选例中，所述易降解的蛋白包括：胃泌素释放肽(GRP)。

在另一优选例中，所述的第一结合蛋白B位于待测样本中。

在另一优选例中，所述的第二结合蛋白C选自下组：抗体、抗原、配体、受体、或其组合。

在另一优选例中，所述的第二结合蛋白C选自下组：IgG抗体、IgM抗体。

在另一优选例中，所述标记蛋白D选自下组：抗体、抗原、配体、受体、或其组合。

在另一优选例中，所述的标记蛋白D包括抗抗体。

在另一优选例中，所述的抗抗体包括抗人IgG抗体、抗人IgM抗体。

在另一优选例中，所述的可检测标记选自下组：荧光物质、放射性元素、酶、化学发光剂、胶体金、或其组合。

另一优选例中(如图1所示)，在所述复合物中，

B为结合蛋白，与A特异性结合的一个或多个抗原；

C为待测蛋白，与B特异性结合的待检测抗体；

D为标记蛋白，为与C特异性结合的抗抗体，并且带有可检测标记。

另一优选例中(如图2所示)，在所述复合物中，

B为结合蛋白，与A特异性结合的第一抗体；

C为待测蛋白，与B特异性结合的待检测抗原；

D为标记蛋白，为与C特异性结合的第二抗体，并且带有可检测标记。

在另一优选例中(如图3所示)，在所述复合物中，

B为结合蛋白，与A特异性结合的一个或多个第一抗原；

C为待测蛋白，与B特异性结合的待检测抗体；

D为标记蛋白，为与C特异性结合的第二抗原，并且带有可检测标记。

在另一优选例中(如图4所示)，在所述复合物中，

A为第一抗体；

B为待测蛋白，与A特异性结合的待测抗原；

C为与B特异性结合的待检测的第二抗体(该第二抗体用于保护抗原B)；

D为标记蛋白，为与C特异性结合的抗抗体，并且带有可检测标记。

在另一优选例中(如图5所示)，在所述复合物中，

A为第一抗体；

B为待测蛋白，与A特异性结合的待测抗原；

C为与B特异性结合的待检测的第二抗体(该第二抗体用于保护抗原B)；

D为标记蛋白，为与B特异性结合的抗抗体，并且带有可检测标记。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测目标分析物的检测体系，所述检测体系包含本发明第一方面所述的多元桥连复合物。

在另一优选例中，所述的Z0为微球(bead)、颗粒(particle)或磁珠。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述Z0的浓度，因为检测平台不同，偏差较大，为0.1×10⁵至1.0×10⁸个/mL，较佳地为1×10⁴至5×10⁷个/mL，更佳地为2×10⁴至5×10⁷个/mL。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述A的浓度为1-1000μg/mL，较佳地为5-500μg/mL，更佳地为10-100μg/mL。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述B和/或C的浓度区间为1pg/mL-1000μg/mL。

在另一优选例中，所述B和C中一个为检测靶标。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述D的浓度为0.1-1000μg/mL，较佳地为0.3-100μg/mL，更佳地为0.5-15μg/mL。

在本发明的第三方面，提供了一种用于检测目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：容器以及位于所述容器内的用于形成本发明第一方面所述的多元桥连复合物的原料试剂，其中，所述原料试剂中不包括待测的目标分析物。

在另一优选例中，所述试剂盒包括：

(a)第一容器以及位于第一容器中的所述的多元桥连复合物中的ZO；

(b)第二容器以及位于第二容器中的所述的多元桥连复合物中的A；

(c)第三容器以及位于第三容器中的所述的多元桥连复合物中的B或C；

(d)第四容器以及位于第四容器中的所述的多元桥连复合物中的D；

(e)任选地第五容器以及位于第五容器中的用于反应体系的缓冲液；

(f)任选地第六容器以及位于第六容器中的样本稀释液；

(g)任选地第七容器以及位于第七容器中的洗涤液。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器可以是相同或不同容器。

在另一优选例中，所述蛋白或小分子D带有检测标记。

在另一优选例中，所述蛋白或小分子D不带有检测标记。

在另一优选例中，所述第四容器中的D在长期保存过程中可以是未带检测标记的，其根据使用需要在使用前一定时间内进行标记反应。

在本发明的第四方面，提供了一种用于对待测的目标分析物进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供一检测体系，所述检测体系含有用于形成本发明第一方面所述的多元桥连复合物的原料试剂，其中，当所述检测体系含有待测的目标分析物,所述原料试剂与所述待测的目标分析物形成本发明第一方面所述的多元桥连复合物；和

(ii)检测在所述检测体系中所述多元桥连复合物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测的目标分析物的检测结果。

在另一优选例中，所述的检测结果包括定性和/或定量结果。

在另一优选例中，所述的待测的目标分析物包括：抗原、抗体或小分子。

在另一优选例中，所述的待测的目标分析物包括：蛋白、核酸或小分子化合物。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述的原料试剂包括：由Z0、A和B构成的预复合物X1。

在另一优选例中，所述的检测体系中，当待测的目标分析物为C时，所述的原料试剂包括：(1)由Z0、A和B构成的预复合物X1；和(2)D元件。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述的原料试剂包括：由Z0和A构成的预复合物X2。

在另一优选例中，所述的检测体系中，当待测的目标分析物为B时，所述的原料试剂包括：(1)由Z0和A构成的预复合物X2；(2)C元件和(3)D元件。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了第一种间接包被或标记的桥连多元桥连复合物的示意图。

图2显示了第二种间接包被或标记的桥连多元桥连复合物的示意图。

图3显示了第三种间接包被或标记的桥连多元桥连复合物的示意图。

图4显示了第一种蛋白保护桥连多元桥连复合物的示意图。

图5显示了第二种蛋白保护桥连多元桥连复合物的示意图。

图6显示了本发明弓形虫IgM的检测中，检测原理的示意图。

图7显示了本发明弓形虫IgM检测的对比例中，检测原理的示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次开发了一种高灵敏度和高准确性地检测降解或难以包被的目标分析物的方法。

首先，本发明方法构建的多元桥连复合物体系，使得在检测过程中，靶标蛋白能够高效地且特异性地间接结合到固相载体上，从而能够被更加灵敏地检测出。本发明方法中的检测体系能够显著提高检测的灵敏度，特别在检测弱阳性标本时，表现尤为突出，与此同时，有效降低了反应体系的本底，最终明显增加了阴阳性的区分度，能有效降低假阳性假阴性的概率，与对照试剂盒具有更好的一致性。

其次，本发明方法构建的多元桥连复合物体系，使得在检测过程中，待检测蛋白被其保护抗体结合从而增加其稳定性，从而能够更加准确地被检测出。本发明方法中的检测体系能够显著地提高检测的灵敏度和准确度，特别在样本保存时间较长时，表现尤为突出。

在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明复合物”、“本发明的多元桥连复合物”“多元桥连复合物”、“多参数复合物”或“本发明的桥连复合物”等可互换使用，指本发明第一方面中结构如式Ia或Ib所示的复合物。本发明的多元桥连复合物尤其适用于在检测过程中存在难以包被的蛋白或检测试剂，以及待测的目标分析物是易降解的情况。

多元桥连复合物

为了便于理解，申请人提供以下原理供参考。然而，应理解，本发明的保护并不受所述原理的限制。

以His抗体为例，本发明方法的基本原理是通过微球上包被的His抗体与重组表达抗原C端(或者N端)连接的His标签特异性结合得到微球-His抗体-抗原复合体，加入待测血清后，抗原特异性的捕获靶抗体，最后加入标记抗体，形成“微球-His抗体-抗原-分析物-标记抗体”复合物(即多元桥连复合物)，然后对复合物进行检测和分析。

检测体系

本发明还提供了一种检测目标分析物的检测体系，所述检测体系包含本发明所述的多元桥连复合物。

在另一优选例中，所述的Z0为微球(bead)、颗粒(particle)或磁珠。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述Z0的浓度，因为检测平台不同，偏差较大，为0.1×10⁵至1.0×10⁸个/mL，较佳地为1×10⁴至5×10⁷个/mL，更佳地为2×10⁴至5×10⁷个/mL。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述A的浓度为1-1000μg/mL，较佳地为5-500μg/mL，更佳地为10-100μg/mL。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述B和/或C的浓度区间为1pg/mL-1000μg/mL。

在另一优选例中，所述检测体系中，所述D的浓度为0.1-1000μg/mL，较佳地为0.3-100μg/mL，更佳地为0.5-15μg/mL。

检测试剂盒

本发明还提供了一种检测目标分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：容器以及位于所述容器内的用于形成本发明所述的多元桥连复合物的原料试剂，其中，所述原料试剂中不包括待测的目标分析物。

在另一优选例中，所述试剂盒包括：

(a)第一容器以及位于第一容器中的所述的多元桥连复合物中的ZO；

(b)第二容器以及位于第二容器中的所述的多元桥连复合物中的A；

(c)第三容器以及位于第三容器中的所述的多元桥连复合物中的B或C；

(d)第四容器以及位于第四容器中的所述的多元桥连复合物中的D；

(e)任选地第五容器以及位于第五容器中的用于反应体系的缓冲液；

(f)任选地第六容器以及位于第六容器中的样本稀释液；

(g)任选地第七容器以及位于第七容器中的洗涤液。

在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器可以是相同或不同容器。

在本发明中，所述蛋白或小分子D可带有检测标记，也可以是在长期保存过程中未带检测标记的，其根据使用需要在使用前一定时间内进行标记反应。

检测方法

本发明还提供了基于多元桥连复合物，对待测的目标物(即待测物)的检测方法。

优选地，所述的待测物包括：抗原、抗体或小分子等。

在本发明中，所述的检测包括定性检测和/定量检测。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述的原料试剂包括：由Z0、A和B构成的预复合物X1。

在另一优选例中，所述的检测体系中，当待测的目标分析物为C时，所述的原料试剂包括：(1)由Z0、A和B构成的预复合物X1；和(2)D元件。

在另一优选例中，所述的检测体系中，所述的原料试剂包括：由Z0和A构成的预复合物X2。

在另一优选例中，所述的检测体系中，当待测的目标分析物为B时，所述的原料试剂包括：(1)由Z0和A构成的预复合物X2；(2)C元件和(3)D元件。

本发明的检测方法，可用于科研、药品研发、药品质量控制、药品临床治疗监测、临床病人伴随诊断等方面。

刚地弓形虫检测

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle和Manceaux在刚地梳趾鼠(Ctenodactylus gondii)单核细胞内发现，虫体呈弓形，命名为刚地弓形虫。该虫呈世界性分布，人和许多动物都能感染，引起人畜共患的弓形虫病，尤其在宿主免疫功能低下时，可造成严重后果，属机会致病原虫(opportunistic protozoan)。弓形虫病有先天性和获得性弓形虫病两类。先天性弓形虫病只发生于初孕妇女，通过胎盘血流传播引起宫内感染。受染胎儿或婴儿多数表现为隐性感染，有的出生后数月甚至数年才出现症状；也可造成孕妇流产、早产、畸胎或死产，尤以早孕期感染，畸胎发生率高。据研究表明，婴儿出生时出现症状或发生畸形者病死率为12％，而存活中80％有精神发育障碍，50％有视力障碍。以脑积水、大脑钙化灶、视网膜脉络膜炎和精神、运动的障碍为先天性弓形虫病典型症侯。此外，可伴有全身性表现，在新生儿期即有发热、皮疹、呕吐、腹泻、黄疸、肝脾肿大、贫血、心肌炎、癫痫等。因此，弓形虫筛查是孕前感染性疾病检查的重要内容。目前，诊断临床普遍采用酶联免疫以及化学发光等方法检测孕龄妇女血清中的特异性IgG、IgM抗体，以判断受感染的情况。弓形虫纯化抗原是较早应用的一类诊断性抗原，通过对速殖子分离、纯化，提取其细胞质、细胞膜及代谢物的蛋白成分而获得。但是包被抗原的纯度或活性不够，导致检出的准确率不高。随着分子生物学技术不断进展，越来越多的弓形虫主要抗原编码基因被相继克隆。这些基因表达的重组蛋白作为诊断抗原较之纯化抗原有活性高、特异性好等优点。

呼吸道合胞病毒检测

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)为单股负链RNA病毒，属副粘液病毒科，直径约150-300nm。通过眼、鼻、口分泌物传播，潜伏期一般为2-8天。感染初期一般伴随鼻塞、鼻涕、咳嗽、喘息，病程可包括温和的鼻炎、严重的呼吸衰减直至死亡。呼吸道合胞病毒是婴幼儿呼吸道感染的重要病原体，约80％的儿童细支气管炎和50％的婴儿肺炎来自于RSV感染，同时可导致儿童慢性肺部疾病(CLD)和气喘。1970年后的研究指出，在老年人及高风险(免疫缺陷、肺受损、心脏缺陷)的成年人群中，RSV同样是呼吸系统疾病的显著诱因。健康的老年个体对于RSV表现出较好的耐受力，而高风险人群中，16％需要入院治疗，且可能达到4％的死亡率。

呼吸道合胞病毒主要包含9种结构蛋白(N、P、M、SH、G、F、M2-1、M2-2、L)，其中粘附糖蛋白G和融合糖蛋白F作为两种包膜蛋白，介导了RSV对宿主细胞的融合感染。而F蛋白在不同血清学中又高度保守，因此常被用作检测抗体的目标表位。

但是由于F蛋白含有大量的疏水基团，疏水性较强，不利于羧基微球包被，因而常规的化学交联方式的包被标记，三参数(微球-抗原-分析物-标记抗体)检测体系通常检测信号低，检测灵敏度差。

丙型肝炎病毒检测

丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.7亿人感染HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。据统计，目前我国约有1,000万例丙型肝炎(丙肝)感染者。丙肝是一种“沉默”的疾病，有50％～90％的丙肝病毒(HCV)感染者无症状，超过30％的感染者肝功能指标正常。由于HCV感染初期不易被察觉，导致超过90％的感染者尚未被发现。同时HCV感染具有高隐匿、高漏诊、高慢性化的特点，70％～90％的患者会发展为慢性感染。相比乙型肝炎病毒感染，慢性HCV感染更易转化为肝硬化甚至肝癌。因此，早期发现HCV感染，对丙肝早期诊断和临床治疗意义重大。

HCV属于黄病毒科(flaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，目前可分为6个基因型及50多种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1a、2b、3c等)。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。HCV 1b和2a基因型在我国较为常见，其中以1b型为主；某些地区有1a、2b和3b型报道；6型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型。

胃泌素释放肽(GRP)检测

胃泌素释放肽(GRP)是一种重要的影响人体大量病理、生理过程的调控因子。它是一种胃肠激素，是哺乳动物同源的两栖动物蛙皮素，1987年，从猪胃粘膜中分离，广泛分布于哺乳动物的神经系统、胃肠道和呼吸道。随着信号肽解离，它的148个氨基酸的前蛋白原进一步分解生成27个氨基酸的胃泌素释放肽和68个氨基酸的胃泌素释放肽前体(ProGRP)。由于GRP半衰期很短，约2min，其活性部分在血清中极其不稳定，因而不能用于临床检测。ProGRP是GRP的前体结构，普遍存在于非胃窦组织、神经纤维、脑和肺组织的神经内分泌细胞内，是胃泌素释放肽(GRP)相对稳定的前体，是近年来发现的一种新的SCLC肿瘤标志物，它不仅可用于SCLC的早期发现，还有助于判断疗效及肿瘤复发。但是，ProGRP的稳定性与其他临床常用的肿瘤标志物如CEA、CA125等相比，稳定性较差。有研究表明，血清ProGRP稳定性较差，经4℃保存，24h后降解率％为30.33±8.54,72h后降解率％为33.18±8.46。经室温保存，24h后降解率为48.59±4.28,72h后降解率％为58.41±10.48。血清中的胃泌素释放肽前体亦有可被在凝集进程中形成的内源性蛋白酶降解，导致灵敏度降低。

本发明的主要优点包括：

1)对于某些难以包被的目标分析物，可以克服其难以包被而难以准确检测的缺陷，提高检测的灵敏度和准确度。

2)对于某些易降解的目标分析物，可以克服其因为易降解而难以准确检测的缺陷，提高检测的灵敏度和准确度。

3)采用共用特异性标签包被相应载体，方便产业化，大规模操作，方便试剂原材料筛选，有利于控制试剂批间差异。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1：间接包被或标记桥连复合物反应检测弓形虫抗体

本实施例和相关对比例的的检测原理如图6和图7所示。图6中，Z0为固相载体或微球，A为His标签抗体，B为弓形虫融合表达His标签抗原，C为弓形虫IgM抗体，D为鼠抗人IgM抗体。图7中，Z0为固相载体或微球，A为弓形虫重组表达抗原，B为弓形虫IgM抗体，C为鼠抗人IgM抗体。

以流式荧光检测平台为例，具体实施步骤如下所示：

1)直接包被检测

微球-抗原制备：用磷酸缓冲液(PBS)重悬微球后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(SuLfo-NHS)交联剂37℃反应后沉淀微球弃上清，加入交联Buffer后加入抗原40ug/mL(20-80ug/mL)37℃反应，封闭，洗涤液洗涤，PBS-TBN重悬；

抗体-藻红蛋白标记：抗体用PBS透析后加入3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)活化，藻红蛋白纯化后加入4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(SuLfo-SMCC)活化，活化后的抗体与适量的藻红蛋白混合，2-8℃孵育纯化；

试剂盒检测：

将待测标本使用样本稀释液按照1：20稀释，在反应板中依次加入50uL微球(1～4×10⁴个/ml)、50uL稀释后标本，37℃条件下，孵育15min，然后用洗涤液洗涤3次；

每孔加入100uL藻红蛋白标记的抗体溶液(1-8ug/mL)，37℃孵育15min后用洗涤液洗涤3次，最后加入100uL PBST重悬读数；

具体的结果判定标准：荧光信号强度/临界信号(S/CO)<1为阴性，反之为阳性。

2)通过桥连复合物间接检测

微球-His抗体-抗原制备：用PBS溶液重悬微球后加入适量的EDC、SuLfo-NHS交联剂37℃反应，沉淀微球弃上清，加入交联Buffer后加入His标签抗体(10-40ug/mL)37℃反应，封闭，洗涤液洗涤，PBS-TBN重悬；之后在微球中加入弓形虫抗原40ug/mL(20-80ug/mL)37℃条件下孵育，洗涤3-5次，PBS-TBN重悬；

抗体-藻红蛋白标记：抗体PBS透析后加入SPDP活化，藻红蛋白纯化后加入SuLfo-SMCC活化，活化后的抗体与适量藻红蛋白混合，2-8℃孵育后纯化；

试剂盒检测步骤：

将待测标本使用样本稀释液按照1：20稀释，在反应板中依次加入50uL浓度为0.1～5.0×10⁵个/mL的微球复合体AB复合物(复合物中His标签抗体浓度为10～100μg/mL，弓形虫抗原浓度为10～100μg/mL)、50uL稀释后标本C，37℃条件下，孵育15min，然后用洗涤液洗涤3次；

每孔加入100uL藻红蛋白标记的抗体溶液D(0.5～15μg/mL)，37℃孵育15min后用洗涤液洗涤3次，最后加入100uL PBST重悬读数；

具体的结果判定标准：荧光信号强度/临界信号(S/CO)<1为阴性，反之为阳性。

用两种体系试剂盒测试经对照实际盒测试的40例样本，其中包括20例阴性标本和20例阳性标本，结果如表所示：

表1

从表1可以看出，以对照检测试剂盒的检测结果作为参考标准，20例阴性样本，His抗体连接抗原和微球的方法与对照检测方法结果完全一致，原方法学检测结果出现2例假阳性，20例阳性标本原方法学检测结果出现4例假阴性，而His抗体连接抗原和微球的方法仅1例假阴性，由此可见，本实验采用His抗体连接抗原和微球后，检测灵敏度明显加强，特别在检测弱阳性标本时，表现尤为突出，与此同时，有效降低了反应体系的本底，最终明显增加了阴阳性的区分度，能有效降低假阳性假阴性的概率，与对照试剂盒具有更好的一致性。

讨论

常用的抗原包被工艺主要是通过蛋白的氨基与微球表面的羧基反应，该方法与酶免的物理吸附相比具有灵敏度高、重复性高等优点。但是，该方法受抗原的氨基酸组成影响较大，暴露的氨基含量能极大地影响包被的效率；同时，与羧基发生反应的氨基位点是随机的，当抗原活性位点处的氨基大量与包被载体的羧基连接时，容易造成抗原捕获抗体的位点被占用无法完全暴露，极大地降低反应活性，响应试剂性能。在此以流式荧光平台弓形虫检测为例，普通的间接法检测弓形虫抗体是直接将抗原通过氨基羧基反应直接固定到荧光编码微球上，捕获血清中的目标抗体，再与加入的标记抗体结合行成“抗原-分析物-标记抗体”复合物，该体系的检测效率低，同时带有较为明显的非特异性。因此，在本实施例中，本发明人通过构建桥连复合物间接检测目标抗体，从而显著提高信号及特异性。

在原核表达体系中，谷胱甘肽S转移酶(GST)标签体系因其具有的蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及抗体易制备等特点而被广泛使用。文中和实施例中所阐述的基于多元桥连复合物的检测方法同样适用于带有GST标签的抗原。不同点仅在于作以下改动：首先在微球上包被GST抗体，与抗原上的GST标签结合，形成“微球-GST抗体-抗原”复合物，捕获目标抗体后与加入的标记抗体结合形成“微球-GST抗体-抗原-分析物-标记抗体”四元桥连复合物。

同样的，该四元复合物检测体系也可用于其它检测平台，比如：化学发光平台，构建方式为：在化学发光微球上包被His抗体，通过与弓形虫重组表达抗原末端的His标签结合获得“微球-His抗体-抗原”复合物作为捕获部分，与待测血清中的目标抗体结合，最后加入吖啶酯标记的抗抗体，形成“微球-His抗体-抗原-分析物-标记抗体”四元桥连复合物复合物，通过吖啶酯发光获得相应检测信号。

实施例2：间接包被或标记桥连复合物反应检测呼吸道合胞病毒(RSV)抗体

在本实施例中，利用桥连方式建立基于多元桥连复合物的检测方法，即先将抗原通过GST标签抗体间接固定到微球上，再去捕获血清中的目标物，最后加入标记抗体形成“微球-GST抗体-抗原-分析物-标记抗体”复合物，从而大幅度的提高检测信号。

具体实验步骤参见实施例1，结果如表2所示。

以对照检测试剂盒的检测结果作为参考标准，10例阴性样本，原方法学及His抗体连接抗原和微球的方法均与对照检测方法结果一致，10例阳性标本原方法学检测结果出现3例假阴性，还有3例呈现弱阳性(测值<1.2)而GST抗体连接抗原和微球的方法完全与对照一致，且测值均高于传统微球-抗原-分析物-标记抗体的方法，由此可见，本实验采用GST抗体连接抗原和微球后，检测灵敏度明显加强，特别在检测弱阳性标本时，表现尤为突出，与对照试剂盒具有更好的一致性。

表2

实施例3：间接包被或标记桥连复合物反应检测HCV病毒

在本实施例中，检测时，将三个HCV重组抗原以1：1：1比例(C33C、NS3、NS5)同时包被标记在微球上，在此以流式荧光平台HCV检测为例，普通的双抗原夹心法，直接将三种抗原通过氨基羧基反应直接固定到微球上，捕获血清中的目标抗体，再与加入的标记抗原结合行成“抗原-分析物-标记抗原”复合物，该体系因为每次三种不同的抗原结合微球的比例存在偏差，相对测试批内CV较大，采用四元桥连复合物检测的方法，可以降低反应CV。

相关操作过程参见实施例1，相关数据如表3所示：

表3

分别采用低、中、高三个样本，微球-抗原体系分别在14.04％、6.13％、5.37％；微球-His抗体-抗原体系中分别为7.59％、3.92％、4.23％，普通的微球-His抗体-抗原体系明显优于微球-抗原体系。

实施例4：蛋白保护桥连复合物反应检测胃泌素释放肽(GRP)

利用纯化的ProGRP融合蛋白作为抗原，采用常规的细胞融合技术制备单克隆抗体，酶联免疫吸附法(ELISA)——间接法，筛选细胞株。所述的单克隆制备的具体方法为：将纯化的ProGRP蛋白作为抗原免疫动物，取其脾细胞与兔骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，经筛选获得可稳定分泌ProGRP抗体的杂交瘤细胞，并获得相应的单克隆抗体。

本实施例所用检测原理如图4和图5所示。图4中，Z0为固相载体或微球，A为ProGRP捕获抗体(鼠源)，B为ProGRP抗原，C为ProGRP保护抗体(兔源)，D为羊抗兔标记抗体。图5中，Z0为固相载体或微球，A为ProGRP捕获抗体(鼠源)，B为ProGRP抗原，C为ProGRP保护抗体(兔源)，D为ProGRP标记抗体(鼠源)。

1)建立兔抗人ProGRP蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株

3种单克隆抗体在化学发光平台上的竞争效果，具体实施方法如下：

(i)取多份A公司ProGRP试剂盒测值的血清样本(测值在200pg/mL左右)，混匀形成样本池，再次用A公司试剂盒对ProGRP的样本池进行赋值。

(ii)将ProGRP样本池平均分为4份(每份体积不小于2mL)，其中一份作为阴性对照，标示为CK组，另外三份分别标示为T1组、T2组和T3组。

(iii)分别将3种制备的单克隆抗体ProGRP-3B2、ProGRP-3G9和ProGRP-4H5用PBS稀释到合适的浓度，以5ug/mL的浓度比添加到T1组、T2组和T3组中。

(iv)再次用A公司ProGRP试剂盒对血清样本的CK组、T1组、T2组和T3组进行第一次测值。

4度保存7天后，再次用ProGRP试剂盒对ProGRP血清样本的CK组、T1组、T2组和T3组进行第二次测值，检测结果如表4所示。

表4 3种单克隆抗体在化学发平台上的竞争效果

浓度单位：pg/mL	第一次测值(0天)	第二次测值(7天)	偏差
				CK组	242.4	170.8	-29.5％
T1组	147.5	125.3	-15.1％
				T2组	65.4	58.8	-10.1％
T3组	247.7	240.6	-2.9％

由表4数据所示，7天后，CK组血清样本中ProGRP的浓度由242.4pg/mL降到了170.8pg/mL，降低了29.5％。说明正常4度保存情况下，7天内血清ProGRP极其不稳定，已经开始大幅度的降解。T1组、T2组和T3组在测试第一天和测试第7天ProGRP的降解率分别为15.1％、10.1％和2.9％。其中ProGRP血清样本中在添加了5ug/mL浓度的ProGRP-3B2、ProGRP-3G9后(T2\T3组)，血清中ProGRP的测值与CK组比较呈现下降，推测单克隆抗体ProGRP-3B2、ProGRP-3G9与试剂盒选用抗体具有竞争作用，表明单克隆抗体ProGRP-3B2、ProGRP-3G9所对应的ProGRP蛋白表位可能接近ProGRP检测试剂盒中所用抗体对应的ProGRP蛋白表位。另外，此数据研究发现，添加有5ug/mL浓度ProGRP-4H5抗体的T3组中，A公司ProGRP定量检测试剂盒化学发光平台(4度保存、7天前后)呈现非常缓慢降解程度，仅为2.9％。这对后续开发ProGRP保护剂非常有意义。

在该实施例中成功建立了3株兔抗人ProGRP蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株(3B2、3G9、4H5)。并将3株抗体(ProGRP-3B2、ProGRP-3G9和ProGRP-4H5)中ProGRP-4H5作为添加物添加入样本(抗原)缓冲液中，形成了一种稳定ProGRP-Ag-Ab复合物结构。通过化学发光平台检测ProGRP蛋白的浓度，发现在添加有ProGRP-4H5抗人ProGRP抗体的缓冲液中ProGRP的蛋白浓度在7天内呈现未下降趋势。

在上一步骤中，所述的样本(抗原)缓冲液中含有小牛血清(10％～60％)、MgSO4(2～20mM)、Bestatin(1～10μg)、Chymostatin(1～10μg/mL)、Pefabloc(1～10μg/mL)、PMSF(10～100μg/mL)、Trypsin Inhibitoe(1～10μg/mL)、NaN3(0.2～1.0g/L)；

其中，所述的样本(抗原)缓冲液中含有Bestatin、Chymostatin、Pefabloc、PMSF、Trypsin Inhibitoe一种或多种蛋白酶抑制剂。另外添加(1～10μg/mL)ProGRP-4H5抗人ProGRP抗体，构成ProGRP蛋白的稳定剂配方。

2)ProGRP-4H5对ProGRP蛋白稳定的作用效果

本实施例中开发出一种缓冲液配方，来作为ProGRP稳定剂或稀释液显得非常有必要。具体实施设计如下：

(i)配制样本(抗原)缓冲液，包含的组份有小牛血清(50％)、MgSO₄(10mM)、Bestatin(5μg)、Pefabloc(3μg)、PMSF(50μg/mL)、Trypsin Inhibitoe(2μg/mL)、NaN₃0.5g/L等。

(ii)添加一定浓度的ProGRP-4H5抗体(8μg/mL)，配制成ProGRP的抗原稀释液。

(iii)添加一定浓度的BSA蛋白(8μg/mL)，配制成ProGRP抗原稀释液，作为一般保护剂对照组。

(iv)利用配制的ProGRP抗原稀释液对ProGRP蛋白进行比例稀释，研究ProGRP蛋白在配制的抗原稀释液中4度保存条件下的稳定时间。

在新鲜收集的ProGRP血清样本中添加5μg/mL的ProGRP-4H5抗体，研究样本中天然ProGRP蛋白在4度保存条件下的稳定时间，实验结果如表5所示。

表5添加ProGRP-4H5抗体和BSA后不同类型样本4度保存条件下的稳定结果

样本类型	0天	4天	7天	9天	11天	14天	偏差
								血清样本	259.1	204.9	178.6	151.7	142.2	130.9	-49.48％
血清样本+4H5	268.8	256.4	249.5	245.7	241.3	238.3	-11.35％
								血清样本+BSA	256.3	198.5	171.6	148.1	140.0	129.6	-49.40％
缓冲液+Ag	263.7	241.6	226.6	214.9	201.9	190	-27.95％
								缓冲液+4H5+Ag	258.8	259.7	256.6	260.8	255.1	261.5	1.04％
缓冲液+BSA+Ag	260.5	238.3	221.8	210.3	200.4	188.2	-27.75％

由表5数据显示，“血清样本”对照组和“缓冲液+Ag”组在4度保存条件下，ProGRP蛋白分别的降解率为49.48％和27.95％。而在添加有ProGRP-4H5抗体的“血清样本+4H5”实验组和“缓冲液+4H5+Ag”实验组中，发现未添加相关蛋白酶保护剂的“血清样本+4H5”实验组在4度保存14天后，ProGRP已经降解了11.35％，而在“缓冲液+4H5+Ag”实验组，4度保存14天后，ProGRP蛋白几乎未发生任何降解。而添加一般保护剂BSA的“血清样本+BSA”实验组和“缓冲液+BSA+Ag”实验组中，ProGRP蛋白同样也发生了49.40％和27.75％的降解。

推测本实施例中出现的结果原因，可能为单克隆抗体ProGRP-4H5所对应的ProGRP蛋白表位(51～60aa、61～70aa)存在蛋白酶裂解位点，刚好在添加有ProGRP-4H5抗体的血清样本中，单克隆抗体ProGRP-4H5能够靶向结合该蛋白酶裂解位点，缓解了ProGRP蛋白片段的断裂和降解，而一般保护剂BSA却没有缓解ProGRP蛋白片段断裂和降解的效果。

3)两种形式四元复合物检测方法的建立

(I)羊抗兔抗体筛选

筛选、高特异性的羊抗兔抗体，为后续ProGRP蛋白功能的研究及临床应用奠定了基础。

(II)流式荧光双抗体夹心方法的建立

(i)包被和标记不同抗体检测ProGRP蛋白方法的建立，以单克隆抗体鼠抗Ab1(商业化原料)作为包被抗体，实现编码微球与捕获抗体的交联，分别以4H5单克隆抗体Ab2(兔源的ProGRP保护抗体)和羊抗兔单克隆抗体Ab3(商业化原料)作为标记抗体，实现以藻红蛋白(PE)对检测抗体的标记。配制成反应工作液，在流式荧光平台上检测化学发光平台定值的ProGRP抗原，比较不同标记抗体之间的检测灵敏度和准确性。具体检测方法见下表。

微球-抗体制备：用PBS溶液重悬微球后加入EDC、SuLfo-NHS交联剂反应，沉淀微球弃上清，加入交联Buffer后加入抗体反应，封闭，洗涤液洗涤，基础buffer重悬。然后用基础工作液将制备的微球抗体稀释到反应工作液浓度；然后用基础buffer将制备的微球抗体稀释到反应工作液浓度，待用。

抗体-藻红蛋白标记：抗体PBS透析后加入SPDP活化，藻红蛋白纯化后加入SMCC活化，活化后的抗体与藻红蛋白按照一定质量比混合，孵育后纯化；然后用基础工作液将制备的抗体-藻红蛋白稀释到反应工作液浓度，待用。

试剂盒检测(检测方法2为例)：

在反应板中依次加入50μL微球(A)、20μL待测样本(或校准品)(B)和50μL保护抗体(C)，37℃条件下，孵育15min，然后用洗涤液洗涤3次；

每孔加入100μL藻红蛋白标记的抗体溶液(D)，37℃孵育15min后用洗涤液洗涤3次，最后加入100μL 1×清洗液重悬读数；

其中，制备的微球抗体(A)稀释到反应工作液浓度为0.1～5.0×10⁵个/mL，优选的浓度为0.1～3.0×10⁵个/mL，其中抗体包被加入量10～100μg/mL；

其中，反应体系中，样本(或校准品)(B)反应的工作体积为10～100μL，优选的体积为10～50μL；

其中，保护抗体(C)稀释到的反应工作液浓度为0.5～15μg/mL，优选的浓度为0.5～8μg/mL；

其中，制备的抗体-藻红蛋白(D)稀释到反应工作液浓度为0.5～15μg/mL，优选的浓度为1～8μg/mL

表6检测方法1

表7检测方法2

表8检测方法3

(ii)不同检测方法之间的检测灵敏度比较

表9

ProGRP蛋白	检测方法1	检测方法2	检测方法3
				STD1(0pg/mL)	12.5	10.5	9
STD2(50pg/mL)	54.5	85.5	82.5
				STD3(250pg/mL)	295.5	382	379
STD4(1250pg/mL)	1622	1921.5	1936.5
				STD5(2500pg/mL)	3015	3855.5	4011.5
STD6(5000pg/mL)	5280.5	6167	6230

表10

不同检测方法	检测方法1	检测方法2	检测方法3
				检测灵敏度	≈6pg/mL	≈5pg/mL	≈5pg/mL

(iii)用检测方法2和检测方法3：以单克隆抗体鼠抗Ab1(商业化原料)作为包被抗体，以羊抗兔单克隆抗体Ab3或鼠单克隆抗体(商业化原料)作为标记抗体，配制成反应工作液，反应过程添加Ab3标记抗体的同时在流式荧光平台上检测检测预先添加有5ug/mL的Ab2抗体(兔源的ProGRP保护抗体)的血清样本中，以不添加Ab2抗体的同一份血清作为对照，观察该种方法对不同保存时间的血清样本中ProGRP蛋白检测的结果差异。

表11

表12

以上结果显示，不同的检测方法在检测ProGRP蛋白中反应灵敏度相差不大，检测方法1：以Ab1(商业化原料鼠抗)作为包被抗体，Ab2(自制兔抗)作为检测抗体，对ProGRP蛋白检测灵敏度约6pg/mL，而检测方法2：以Ab1作为包被抗体，Ab3(商业化原料羊抗兔抗体)作为检测抗体，检测添加有Ab2的ProGRP蛋白的检测灵敏度约5pg/mL。检测方法3：以Ab1(商业化原料鼠抗)作为包被抗体，Ab3(商业化原料鼠抗)作为检测抗体，检测添加有Ab2的ProGRP蛋白的检测灵敏度约5pg/mL。由此可见，检测方法2和检测方法3较检测方法1的灵敏度略有提高。

当用检测方法2和检测方法3对添加和不添加有5ug/mLAb2抗体的血清样本检测发现，添加有Ab2抗体的血清样本分别4℃放置0天、1天、3天、7天后，7天后测值较当天测值偏差分别为-5.09％和-3.72％。无论是低值或中值样本降解率均在10％以内。而检测方法3检测的对照组血清，测值均呈现不同程度的下降，说明，通过添加保护抗体Ab2到血清样本中，采用检测方法2和检测方法3进行检测，可有效规避ProGRP易降解的难题。

讨论

细胞内蛋白质降解是生命的重要过程，绝大多数蛋白的降解是服从一级反应动力学，半衰期从几十秒到百余天不等，哺乳动物细胞内蛋白的平均周转率1-2天，代谢过程中的关键酶以及处于分支点的酶寿命仅几分钟，蛋白半率期并不恒定，与细胞的生理状态亦密切相关。部分检测靶标蛋白容易被降解为多肽片段，导致后续检测困难,本实施例以ProGRP抗原检测为例，制备相应靶向保护抗体，检测时，形成两种形式的多元桥连复合物可以有效防止ProGRP降解，提高检测灵敏度。

目前临床上用于检测ProGRP蛋白的某进口主流厂家试剂，推荐该指标使用血浆样品进行检测，但这却加大了采集样本的复杂性及临床应用的繁琐性。而本发明中提到两种四元复合物的构建方法学及相关的检测应用，不仅获得了稳定该类易降解蛋白的稳定剂配方，也为检测该类易降解蛋白提供了更精确、更灵敏的检测方法。

通过本发明方法，构建ProGRP抗原/抗体复合物间接检测ProGRP抗原的方法，血清中ProGRP抗原与相应靶向保护抗体结合，形成复合物的形式较常规保存的血清中单一ProGRP抗原形态更稳定，从而提高灵敏度，该方法不仅具有更高的检测灵敏度，而且，检测临床样本与临床诊断结果符合率为70％，符合临床诊断要求，有着良好的临床应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种多元桥连复合物，其特征在于，所述复合物的结构如式Ia或Ib所示：

Z0-(A-B-C-D)n (Ia)

式中的各元件包括：

Z0为固相载体；

A为标签蛋白，交联至固相载体表面的蛋白或多肽片段或核苷酸适配体或小分子等；

B为第一结合蛋白，并且所述的B与A特异性结合；

C为第二结合蛋白，并且所述的C与B特异性结合；并且，B和C中有且只有一个为待测的目标分析物；

D为标记蛋白，所述的D带有可检测标记，其中，在式Ia中，D为与C特异性结合的蛋白；而在式Ib中，D为与B特异性结合的蛋白，并且

n为≥1；

“-”为键或连接基团。

2.如权利要求1所述的多元桥连复合物，其特征在于，所述的第一结合蛋白B包括难以包被的蛋白。

3.如权利要求1所述的多元桥连复合物，其特征在于，所述第一结合蛋白B包括易降解的蛋白。

4.一种用于检测目标分析物的检测体系，其特征在于，所述检测体系包含权利要求1所述的多元桥连复合物。

5.如权利要求4所述的检测体系，其特征在于，所述B和C中一个为检测靶标。

6.一种用于检测目标分析物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：容器以及位于所述容器内的用于形成权利要求1所述的多元桥连复合物的原料试剂，其中，所述原料试剂中不包括待测的目标分析物。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器以及位于第一容器中的所述的多元桥连复合物中的ZO；

(b)第二容器以及位于第二容器中的所述的多元桥连复合物中的A；

(c)第三容器以及位于第三容器中的所述的多元桥连复合物中的B或C；

(d)第四容器以及位于第四容器中的所述的多元桥连复合物中的D；

(e)任选地第五容器以及位于第五容器中的用于反应体系的缓冲液；

(f)任选地第六容器以及位于第六容器中的样本稀释液；

(g)任选地第七容器以及位于第七容器中的洗涤液。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器可以是相同或不同容器。

9.一种用于对待测的目标分析物进行检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(i)提供一检测体系，所述检测体系含有用于形成权利要求1所述的多元桥连复合物的原料试剂，其中，当所述检测体系含有待测的目标分析物,所述原料试剂与所述待测的目标分析物形成权利要求1所述的多元桥连复合物；和

(ii)检测在所述检测体系中所述多元桥连复合物的存在与否和/或数量，从而获得所述待测的目标分析物的检测结果。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的检测结果包括定性和/或定量结果。

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