CN113106077A - 一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法及其在养殖业中的应用 - Google Patents
一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法及其在养殖业中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT‑Mfɑ‑rPoTRX‑His的构建；(2)pYES2/CT‑Mfɑ‑rPoTRX‑His工程菌的制备、转化；(3)含有pYES2/CT‑Mfɑ‑rPoTRX‑His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定。本发明制备工程菌中PoTRX基因具有酿酒酵母偏爱型特点，并含有酿酒酵母信号肽，可使PoTRX分泌表达，并且大大提高了表达产物的产量，相比大肠杆菌表达系统和其他有益菌分泌表达系统而言，获取工艺简单，成本更低。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法。
背景技术
硫氧还蛋白(Thioredoxin,TRX)是一类高度保守的低分子量蛋白质，在细胞内可溶性、对热稳定、具有氧化还原活性的酸性小分子蛋白质，分子量约为12kDa。TRX广泛分布于植物、细菌、酵母和动物中，它与硫氧还蛋白还原酶(TR)、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同组成硫氧还蛋白系统(TRX系统)，是一个有效的蛋白还原系统。TRX在其保守的活化区域内含有二硫巯基和二硫键，其氧化还原活性使硫氧还蛋白具有维持体内稳定的氧化还原状态、调节细胞生长、抑制凋亡、调节基因转录影响蛋白在动物体内的含量、免疫调节等功能。
根据相关文献报道，猪硫氧还蛋白的获取方式主要有动物体内诱导和原核诱导表达的方式。2011年，向卫军将猪硫氧还蛋白与IFNα利用原核诱导表达系统进行可溶性融合表达，并且融合蛋白具有抗猪圆环病毒活性，而融合伴侣TRX蛋白的辅助功能机制尚不清楚。利用基因工程技术表达外源基因可低成本获取生物活性良好的目的蛋白。根据表达载体和宿主菌的不同，可以通过原核表达和真核表达两种方法获取猪硫氧还蛋白。猪硫氧还蛋白原核表达系统虽成本低廉，但该系统存在容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低等缺陷；毕赤酵母中表达需用甲醇诱导，表达产物不能直接用作于饲料，需要提纯后才能利用，生产成本高，因此选择酿酒酵母真核表达系统对猪硫氧还蛋白进行外源表达。
断奶常诱发仔猪采食量降低生长性能下降以及腹泻率上升等应激综合症。小肠作为机体对营养物质消化、吸收和代谢最主要的器官,以及抵御病原体和致癌物等有害物质的屏障,其发育受阻被认为是导致断奶应激综合症最主要的原因之一。重组猪硫氧还蛋白的添加可以抑制小肠发育受阻进而改善断奶应激。在日粮添加本发明制备的重组猪硫氧还蛋白对断奶仔猪肠道蛋白质表达、氧化状态以及肠细胞增殖和凋亡产生影响,为重组猪硫氧还蛋白作为一种无抗饲料添加剂减缓仔猪断奶综合症机理的研究提供新思路。
发明内容
一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，包含以下步骤：
(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的构建，具体包括：
猪硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rPoTRX-His；
对质粒pYES2/CT-Mfɑ及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His；
(2)pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His工程菌的制备、转化，具体包括：
酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；
将步骤(1)获得的pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His以及pYES2/CT-Mfɑ质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)；
(3)含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定，具体包括：
将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，经SDS-PAGE电泳以及鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定，均可观察到特异性条带，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白。
进一步的，所述步骤(1)中，猪硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rPoTRX-His，具体步骤为：
根据猪硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型重组猪硫氧还蛋白基因，重组猪硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组猪硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示；
将重组猪硫氧还蛋白基因以PoTRX-His的顺序插入pMD19-T Simple Vector的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rPoTRX-His。
进一步的，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-Mfɑ及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His，具体步骤为：
根据rPoTRX-His基因的序列设计合成正向引物rPoTRX-His F：ATAAGAATGCGGCCGCAATGATGGTTAAGCAAATTGAATC(其中GCGGCCGC为酶切位点NotⅠ)，反向引物rPoTRX-His R：CTAGTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATAATCAATTCG(其中TCTAGA为酶切位点XbaⅠ)，通过PCR扩增pMD19-T-rPoTRX-His质粒中rPoTRX-His基因，按照凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；
用QuickCut Not I和QuickCut Xba I分别对购买的质粒pYES2/CT-Mfɑ及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切，并分别切胶回收rPoTRX-His基因片段和pYES2/CT-Mfɑ片段，然后用T4DNA连接酶进行连接得重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：rPoTRX-His F；反向引物：rPoTRX-His R)及双酶切(QuickCut Not I和QuickCut Xba I)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His。
进一步的，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，高压灭菌20min；
SC-U液体培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
SC-U平板培养基，6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，20g琼脂粉，加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用；
其中，所述酵母无氮浸出物为YPD培养基获得的酵母无氮浸出物。
进一步的，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)的具体步骤为：
将10μl pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，同时迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U平板培养基，30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落，单克隆菌落中含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的酿酒酵母转化子，取菌落制成菌液进行PCR扩增，筛选得INVSc1/pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His阳性克隆子。
进一步的，其特征在于，所述步骤(3)中，
通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，具体步骤为：
挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)于30ml液体SC-U液体培养基，30℃震荡培养过夜，并测定OD600nm吸光值，取适量的培养液接种于100ml的SC-U诱导培养基中，震荡培养过夜，同时测定OD600nm使其为0.4；
4℃1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃1500g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤；
使用Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用Binding Buffer(pH 8.0 PBS)平衡2～3个柱体积；在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5～6ml/min；再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定
设置梯度咪唑浓度的Elution Buffer(pH 8.0 PBS containing 100～300mMImidazole)洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白。
进一步的，其特征在于，所述SC-U液体培养基和SC-U诱导培养基中，分别添加有2％棉籽糖和2％半乳糖。
一种根据酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法制得的酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的应用，按基础日饲料1kg的重量，添加重组猪硫氧还蛋白50～100mg。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明制备工程菌中猪TRX基因具有酿酒酵母偏爱型特点，并含有酿酒酵母信号肽，可使猪硫氧还蛋白分泌表达，并且大大提高了表达产物的产量，相比大肠杆菌表达系统和其他有益菌分泌表达系统而言，获取工艺简单，成本更低。
2.目前尚未有通过酿酒酵母表达系统获得重组猪硫氧还蛋白的研究报道，因此该制备方法具有十分重要的应用价值。
3.在日粮添加本发明制备的重组猪硫氧还蛋白对断奶仔猪生长性能和肠细胞氧化状态产生影响，为重组猪硫氧还蛋白作为一种无抗饲料添加剂减缓仔猪断奶综合症机理的研究提供新思路。
附图说明：
图1质粒pYES2/CT-Mfɑ图谱；
图2 SDS-PAGE鉴定纯化后重组猪硫氧还蛋白
图3 Westernblot鉴定纯化后重组猪硫氧还蛋白
序列表说明：
序列表1本发明重组猪硫氧还蛋白的核苷酸序列
序列表2本发明重组猪硫氧还蛋白的氨基酸序列
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的构建
(1)猪表皮生长因子基因的人工优化
根据猪硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型猪硫氧还蛋白基因，重组猪硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，重组猪硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示
序列表中，CAT CAC CAT CAC CAT CAC为6×His标签序列。
将以上基因序列以PoTRX-His的顺序插入pMD19-T Simple Vector的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端接HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rPoTRX-His。
(2)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的构建
根据rPoTRX-His基因的序列设计合成正向引物rPoTRX-His F：ATAAGAATGCGGCCGCAATGATGGTTAAGCAAATTGAATC(其中GCGGCCGC为酶切位点NotⅠ)，反向引物rPoTRX-His R：CTAGTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATAATCAATTCG(其中TCTAGA为酶切位点XbaⅠ)，通过PCR扩增pMD19-T-rPoTRX-His质粒中rPoTRX-His基因。
反应体系为：
PCR反应程序：95℃预变性5rain；95℃30s，58℃25s，72℃30s，35个循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。
用QuickCut Not I和QuickCut Xba I分别对购买的质粒pYES2/CT-Mfɑ(质粒图谱见图1)及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切。
酶切反应体系为：
在37℃金属浴中酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收rPoTRX-His基因片段和pYES2/CT-Mfɑ片段，然后用T4DNA连接酶进行连接。
连接反应体系为：
反应条件为16℃、14h，按常规方法(氯化钙法)将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：rPoTRX-His F；反向引物：rPoTRX-His R)及双酶切(QuickCut Not I和QuickCut Xba I)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His。
实施例2：pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His工程菌的制备、转化
(1)酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，高压灭菌20min；
SC-U液体培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
SC-U平板培养基，6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，20g琼脂粉，加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。
(2)pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His转化酿酒酵母
采用电转化法将pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His以及pYES2/CT-Mfɑ质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞。将10μl pYES2/CT-MFα-rPoTRX-His质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His及pYES2/CT-Mfɑ质粒的酿酒酵母转化子，菌液PCR(正向引物：rPoTRX-His F；反向引物：rPoTRX-HisR)筛选INVSc1/pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His阳性克隆子。
实施例3：含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定
分别挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)以及INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ)于30ml液体SC-U选择培养基(含2％棉籽糖和氨苄)，30℃震荡培养过夜，测定OD600nm吸光值，取适量的培养液接种于100ml的SC-U诱导培养基中(含2％半乳糖和氨苄)，震荡培养过夜，使其OD600nm为0.4，4℃1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基(含2％半乳糖和氨苄)悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中(含2％半乳糖和氨苄)，置于30℃震荡培养96h，4℃1500g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤。
使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用B inding Buffer(pH 8.0 PBS)平衡2～3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5～6ml/min。再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定。设置梯度咪唑浓度的Elution Buffer(pH8.0 PBS含有100～300mM咪唑)洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，取纯化过程蛋白样做SDS-PAGE电泳，以便分析纯化效果。
诱导表达纯化得到的上清蛋白液经SDS-PAGE电泳可观察到12.2kDa左右有明显的特异性条带出现，而同样经诱导的含有pYES2/CT-Mfɑ质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液则没有该条带(见图2，其中，M，Markers(26632)；1，pYES2/CT-MFα载体对照；2，纯化后重组猪硫氧还蛋白)，使用鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液均可观察到12.2kDa左右特异性条带(见图3，其中，M，Markers(26616)；1，纯化后重组猪硫氧还蛋白)。
此可见本发明制备的含猪硫氧还蛋白的真核表达载pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的酿酒酵母工程菌经半乳糖诱导能产生12.2kDa左右的重组猪硫氧还蛋白。
实施例4：重组猪硫氧还蛋白氧化还原活性检测
利用纯化的融合蛋白对胰岛素二硫键具有还原酶活力进行检测其活性。DTT是硫氧还蛋白的还原剂,在DTT存在时硫氧还蛋白可以使胰岛素A,B链间的二硫键还原成游离的A,B两条链，而B链的溶解度差，可以使透明的反应液变混浊，并在690nm处有强烈的光吸收。反应体系如表1，加入二硫苏糖醇(DTT)启动反应，37℃下690nm处每隔1min测定1次光密度(OD)值，绘制反应曲线，并利用四参数拟合方法计算硫氧还蛋白的生物活性，结果显示纯化得到的rPoTRX氧化还原活性可达到500U/ml。
表1 TRX活性测定检测反应体系体系
实施例5：重组猪硫氧还蛋白对断奶仔猪生产性能和肠细胞氧化状态影响
1.材料和方法
1.1试验动物与样品采集
选用25日龄(大×长×白)三元杂交猪30头，随机分为3组，每组10头仔猪，分别饲喂低剂量重组硫氧还蛋白日粮(50mg/kg rPoTRX蛋白)、高剂量重组硫氧还蛋白日粮(100mg/kg rPoTRX蛋白)和基础日粮，试验采用玉米-豆粕型基础日粮，自由采食，饲喂期15d。试验结束时统计采食量、日增重及腹泻率，并根据仔猪断奶综合症(腹泻率)的改善情况，从对照和处理组中各选3头仔猪进行屠宰，收集空肠组织进行氧化还原指标分析。
1.2肠道氧化还原指标分析
利用南京建成公司的生化分析试剂盒，根据操作指南，分别对还原型与氧化型谷肤甘肤比值(GSH/GSSG)，谷胧甘肤硫转移酶(GST)和谷肤甘肤过氧化物酶(GSH-PX)的活性进行分析。
1.3统计学分析
生产性能、腹泻率、生化指标以及氧化还原指标分析通过IBM SPSS Statistics20的单因子方差分析进行统计。P值小于0.05为差异显著。
2.试验结果
2.1采食量、日增重、腹泻率变化
与对照组相比，低剂量和高剂量试验组仔猪试验期的日增重量、采食量分别增加10％、27％和3.7％、22.2％(表2)。在试验期间，对照组中75％的仔猪出现腹泻，而低剂量和高剂量试验组分别有30.5％和7.25％的腹泻发生率。
表1 重组猪硫氧还蛋白对断奶仔猪生产性能的影响
2.2 GSH、GSSG含量以及GST、GSH-PX活性变化
低剂量和高剂量重组猪硫氧还蛋白试验组断奶仔猪肠道细胞中还原型与氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)分别提高了22.9％和76.8％，使与氧化应激密切相关的两个酶：谷胱甘肽硫转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性分别降低39.8％和79.3％(表3)。
表3 仔猪空肠GSH、GSSG含量及GST、GSH-PX活性变化
#P＜0.01；*P＜0.05。
由以上结果可知，本发明制备的酿酒酵母表达的重组猪硫氧还蛋白高剂量使用可有效地促进断奶仔猪的采食量、日增重，同时降低腹泻率的发生；同时发现重组猪硫氧还蛋白处理组可使断奶仔猪肠道中GSH/GSSH比值显著提高以及GST和GSH-PX活性显著降低，说明本发明制备的重组猪硫氧还蛋白可在一定程度上减缓断奶所引起的仔猪肠道细胞的氧化应激，改善断奶仔猪肠道细胞的氧化还原状态，避免仔猪断奶后的肠道功能紊乱，减少了腹泻等一系列仔猪断奶综合症的发生，对养殖业具有实际应用价值。
综上，本发明采用基因工程技术表达重组猪硫氧还蛋白，最终获得了显著的效果。本发明所涉及的表达重组猪硫氧还蛋白的应用，仅在常规饲料中添加重组猪硫氧还蛋白，技术简单，成本低，提高动物的生产性能，对养殖业具有实际应用价值，为养殖业饲料添加剂的开发提供了新思路可行性强，极大地提高了工作效率。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司
<120> 一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法及其在养殖业中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatggtta agcaaattga atccaagtac gctttccaag aagccttgaa ctctgctggt 60
gaaaaattag tcgttgtcga cttttccgcc acctggtgtg gtccatgtaa gatgatcaag 120
ccattcttcc actctttgtc cgaaaaatac tcaaatgttg ttttcttgga agttgacgtc 180
gatgactgcc aagatgttgc ttctgaatgt gaagtcaagt gtatgccaac tttccaattt 240
ttcaagaagg gtcaaaaggt cggtgaattc tctggtgcta acaaggaaaa gttggaagcc 300
actatcaacg aattgattca tcaccatcac catcactaa 339
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Lys Gln Ile Glu Ser Lys Tyr Ala Phe Gln Glu Ala Leu Asn
1 5 10 15
Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val Val Val Asp Phe Ser Ala Thr Trp Cys
20 25 30
Gly Pro Cys Lys Met Ile Lys Pro Phe Phe His Ser Leu Ser Glu Lys
35 40 45
Tyr Ser Asn Val Val Phe Leu Glu Val Asp Val Asp Asp Cys Gln Asp
50 55 60
Val Ala Ser Glu Cys Glu Val Lys Cys Met Pro Thr Phe Gln Phe Phe
65 70 75 80
Lys Lys Gly Gln Lys Val Gly Glu Phe Ser Gly Ala Asn Lys Glu Lys
85 90 95
Leu Glu Ala Thr Ile Asn Glu Leu Ile His His His His His His
100 105 110
Claims (8)
1.一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的构建，具体包括：
猪硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rPoTRX-His；
对质粒pYES2/CT-Mfɑ及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His；
(2)pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His工程菌的制备、转化，具体包括：
酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；
将步骤(1)获得的pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His以及pYES2/CT-Mfɑ质粒分别转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)；
(3)含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的酿酒酵母工程菌的摇瓶培养、诱导表达纯化及检定，具体包括：
将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)，通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，经SDS-PAGE电泳以及鼠抗His单克隆抗体经Westernblot鉴定，均可观察到特异性条带，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，猪硫氧还蛋白基因的人工优化，以获得质粒pMD19-T-rPoTRX-His，具体步骤为：
根据猪硫氧还蛋白氨基酸序列以及酿酒酵母对密码子的偏爱性，人工设计了酿酒酵母偏爱型猪硫氧还蛋白基因，猪硫氧还蛋白核苷酸序列为序列表1所示，猪硫氧还蛋白氨基酸序列为序列表2所示；
将重组猪硫氧还蛋白基因以PoTRX-His的顺序插入pMD19-T Simple Vec tor的HindⅢ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其5’端HindⅢ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-rPoTRX-His。
3.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-Mfɑ及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切，获得阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His，具体步骤为：
根据rPoTRX-His基因的序列设计合成正向引物rPoTRX-His F：ATAAGAATGCGGCCGCAATGATGGTTAAGCAAATTGAATC(其中GCGGCCGC为酶切位点NotⅠ)，反向引物rPoTRX-His R：CTAGTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATAATCAATTCG(其中TCTAGA为酶切位点XbaⅠ)，通过PCR扩增pMD19-T-rPoTRX-His质粒中rPoTRX-His基因，按照凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收；
用QuickCut Not I和QuickCut Xba I分别对购买的质粒pYES2/CT-Mfɑ及以上胶回收的rPoTRX-His片段进行双酶切，并分别切胶回收rPoTRX-His基因片段和pYES2/CT-Mfɑ片段，然后用T4DNA连接酶进行连接得重组质粒，将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物：rPoTRX-His F；反向引物：rPoTRX-His R)及双酶切(QuickCut Not I和QuickCut Xba I)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His。
4.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：
YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，高压灭菌20min；
SC-U液体培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
SC-U平板培养基，6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，20g琼脂粉，加去离子水900ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；
SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用；
其中，所述酵母无氮浸出物为YPD培养基获得的酵母无氮浸出物。
5.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)的具体步骤为：
将10μl pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，同时迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U平板培养基，30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆菌落，单克隆菌落中含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的酿酒酵母转化子，取菌落制成菌液进行PCR扩增，筛选得INVSc1/pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His阳性克隆子。
6.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，
通过培养、离心、收集上清液经过柱层析，得纯化后的上清蛋白液，具体步骤为：
挑取阳性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)于30ml液体SC-U液体培养基，30℃震荡培养过夜，并测定OD600nm吸光值，取适量的培养液接种于100ml的SC-U诱导培养基中，震荡培养过夜，同时测定OD600nm使其为0.4；
4℃1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃1500g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤；
使用Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用Binding Buffer(pH 8.0PBS)平衡2～3个柱体积；在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5～6ml/min；再用Binding Buffer过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD 280nm稳定；
设置梯度咪唑浓度的Elution Buffer(pH 8.0PBS containing 100～300mMImidazole)洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的酿酒酵母表达重组猪表皮生长因子蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，所述SC-U液体培养基和SC-U诱导培养基中，分别添加有2％的棉籽糖和2％的半乳糖。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的制备方法制得的酿酒酵母表达重组猪硫氧还蛋白的应用，其特征在于，按基础日饲料1kg的重量，添加重组猪硫氧还蛋白50～100mg。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1350547A (zh) * | 1999-01-27 | 2002-05-22 | 加利福尼亚大学董事会 | 用硫氧还蛋白减轻空气传播性和接触性变应原的变应原性 |
| JP2004290003A (ja) * | 2003-03-25 | 2004-10-21 | National Research Inst Of Brewing | ポリガラクツロナーゼの大腸菌による生産システム |
| CN1606627A (zh) * | 2000-06-21 | 2005-04-13 | 辛根塔参与股份公司 | 谷物加工方法和其中有用的转基因植物 |
| WO2007103273A2 (en) * | 2006-03-03 | 2007-09-13 | Trustees Of Boston University | Thioredoxin and thioredoxin reductase inhibitors |
| CN102101889A (zh) * | 2009-12-16 | 2011-06-22 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种非洲猪瘟病毒vp73基因的原核表达蛋白及其制备方法 |
| CN106800602A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-06 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种可视化标记基因组位点的方法 |
-
2021
- 2021-04-01 CN CN202110354990.9A patent/CN113106077B/zh active Active
Patent Citations (6)
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Non-Patent Citations (2)
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| 余文兰等: "肉鸡硫氧还蛋白原核表达载体的构建、蛋白纯化及其活性鉴定", 《中国兽医学报》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113106077B (zh) | 2023-05-23 |
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