CN107677820A - 一种检测肿瘤抗原的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤抗原水平检测领域，具体而言，涉及一种检测肿瘤抗原的试剂盒及其检测方法。一种检测肿瘤抗原的试剂盒，包括抗体一以及显示所述抗体一的物质，和/或抗体二以及显示所述抗体二的物质；抗体一的抗原为TKTL1，抗体二的抗原为DNASE1L1。本发明还提供了一种肿瘤抗原的检测方法，检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1来获知肿瘤抗原的信息。该方法通过对血液中的TKTL1(转酮酶‑样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1‑样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平，检测结果稳定，特异性强，检测便利。

Description

一种检测肿瘤抗原的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及肿瘤抗原水平检测领域，具体而言，涉及一种检测肿瘤抗原的试剂盒及其检测方法。
背景技术
单核/巨噬细胞是人类免疫系统细胞的重要组成部分。人类外周血细胞可以主要分为无核细胞(主要为血红细胞)和有核细胞(白细胞等)。单核细胞约占有核细胞总数的5％左右，由髓系造血祖细胞分化而来，是免疫系统中抗原递呈细胞(APC细胞)的重要组分。其在人体循环系统内成熟分化并实现免疫学功能可以大致分为以下步骤：毛细血管中的单核细胞→透过血管壁进入血管外组织→发现异源性物质(细菌、病原体、肿瘤细胞等)，分化为成熟的巨噬细胞→吞噬并消化，将抗原递呈到特定的细胞表面分子上→经由淋巴管回流到外周血→完成抗原递呈激活杀伤性免疫细胞。作为机体抗击外来病原侵袭和清楚自身非正常细胞机制的哨兵，巨噬细胞是免疫系统形成免疫应答的重要环节，作用重大。在正常人体内每时每刻都有向着肿瘤化(永生化、非正常凋亡)发展的细胞产生，正常的机体免疫机制可以通过上述过程，将其及时清除。但随着肿瘤细胞的演化，生成了躲避免疫杀伤的机制，或者机体总体免疫力的下降，形成免疫逃逸，最终在患者体内形成肿瘤包块。由此可见无论健康人群还是癌症患者体内巨噬细胞对于肿瘤化细胞的吞噬作用，都是无时无刻不在进行的。针对单核/巨噬细胞内肿瘤来源物质(包括蛋白质、核算、脂类等)的观测，可以为我们提供一个监控体内肿瘤发生、发展的崭新视角，其应用前景必然非常广泛。
单核/巨噬细胞作为有核细胞的重要组分，现有技术一般是通过其表面抗原分子CD14和CD16进行检测的，目前可以买到成熟的抗体。主要的临床应用集中在血细胞组成检测和造血系统肿瘤(如：粒/单核细胞性白血病)方面的检测中，为临床诊断提供重要参考。就目前专利和文献检索来看，将肿瘤抗原与实体肿瘤的监控联系还有待进一步研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测肿瘤抗原的试剂盒，该试剂盒针对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平。
本发明的第二目的在于提供一种肿瘤抗原的检测方法，该方法通过对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平，检测结果稳定，特异性强，检测便利。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种检测肿瘤抗原的试剂盒，包括抗体一以及显示所述抗体一的物质，
和/或
抗体二以及显示所述抗体二的物质；
所述抗体一的抗原为TKTL1，所述抗体二的抗原为DNASE1L1。
肿瘤细胞与正常体细胞的差异，最主要在两个方面：
1.物质代谢：肿瘤细胞由于其增殖快并且不受正常细胞周期调控，往往表现出对能量物质(葡萄糖等)的饥渴式的需求，但由于其代谢机制的变异，物质代谢特别是能量代谢效率往往远低于正常体细胞，例如，不能对葡萄糖进行完全有效的代谢利用，而是一种浪费式的消耗。而肿瘤细胞在此代谢过程中所需要的酶类物质，其表达量与正常体细胞也存在巨大的差异，可以将其作为肿瘤细胞检测的突破点。
2.细胞凋亡：肿瘤细胞区别于正常体细胞的另一个特点就是永生化，肿瘤细胞是不受正常细胞周期调控的。细胞凋亡机制已经有了较为清晰的研究，肿瘤细胞不凋亡，那必然导致调控细胞凋亡或者在细胞凋亡过程中起到关键作用的因子、信号物质或者酶的表达量出现明显异常，这同样可以作为肿瘤细胞检测的突破点。
TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)分别对应于以上两点，其在巨噬细胞内的降解产物是本发明检测技术的两个目标被检物，简要介绍如下：
TKTL1：主要调节糖代谢途径中的非氧化途径，在多种肿瘤中高表达，其表达量与肿瘤的发展阶段、侵袭和转移以及预后有密切关系。对肿瘤患者的营养搭配及后续的治疗等方面有着重要的提示作用。
DNASE1L1：在细胞凋亡过程中起重要作用，但在肿瘤细胞中，正常的凋亡机制失效，DNASE1L1活性受到抑制，但其大量表达并在肿瘤细胞中积累。其表达量可作为鉴别肿瘤细胞或凋亡机制异常细胞的指标。
本发明针对TKTL1和DNASE1L1进行检测，来判断血液中肿瘤抗原的水平。
进一步地，所述显示所述抗体一的物质为标记在所述抗体一上的荧光标记，所述显示所述抗体二的物质为标记在所述抗体二上的荧光标记；
或者
所述抗体一为两种不同种属来源的抗体一，所述显示所述抗体一的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体一配对的二抗；所述抗体二为两种不同种属来源的抗体二，所述显示所述抗体二的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体二配对的二抗。
其中，抗体一的二抗和抗体二的二抗可以为相同也可以为不同。
进一步地，抗体一为anti-TKTL1，所述抗体二为anti-DNASE1L1。
anti-TKTL1与anti-DNASE1L1为市售产品，这两种抗体可以产自各种动物，如常用的小鼠、大鼠、兔子、猴子等等。如anti-TKTL1可以购买自sigma，货号HPA000505，rabbitpolyclonal；anti-DNASE1L1可以购买自sigma，货号HPA072635，rabbit polyclonal；相应地，二抗可以为购买自abcam驴抗兔的PE多克隆抗体，其货号为ab7007。
如上述的一样，本发明中也可以省略掉二抗，这通过将anti-TKTL1和anti-DNASE1L1进行荧光标记实现。
进一步地，所述试剂盒为ELISA试剂盒，所述试剂盒还包括裂解液A、裂解液B、包被缓冲液、封闭液、细胞洗涤缓冲液、酶标板中的任意一种或几种；
所述裂解液A含有以下浓度的各成分：
10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.4-7.6)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
所述裂解液B含有以下浓度的各成分：
150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mMHEPES以及10％±0.5％甘油；
所述包被缓冲液为碳酸盐包被缓冲液，所述碳酸盐包被缓冲液为Na2CO3和NaHCO3的水溶液，其中，以水的体积计，Na2CO3的浓度为0.154-0.165g/L，NaHCO3的浓度为0.29-0.30g/L；
所述封闭液为含有体积百分数为0.8％-1.2％BSA的PBS。
所用的酶标板一般为96孔板，孔径4.5mm，容积0.36ml。
进一步地，所述荧光标记为PE、CY5、CY7、per-CP以及TRITC中的任一种。
荧光标记是为了定量相应的抗体的含量。
本发明还提供了一种肿瘤抗原的检测方法，检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1来获知肿瘤抗原的信息。
该方法通过对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平，检测结果稳定，特异性强，检测便利。
进一步地，所述白细胞裂解物通过以下方法制备：
取血液样品，裂解红细胞，去除除白细胞外的所有成分；
得到的白细胞进行裂解，得到白细胞裂解物。
本发明通过将血液样品的红细胞裂解，进而去除除白细胞外的所有成分，得到白细胞，此处所述的去除除白细胞外的所有成分也只是尽量去除。得到的白细胞裂解得到待测物。白细胞可以吞噬肿瘤细胞，通过对血液中的白细胞裂解物进行特异性检测，增加检测的准确性和特异性。
优选地，所述裂解红细胞采用上述的裂解液A进行，所述裂解液A与所述血液样品的体积比为15-20:1，裂解的时间为10-20min。
经验证，裂解液A能特异性将红细胞裂解，为红细胞的去除提供良好的基础。通过在血液中添加特定比例的裂解液A，并限定特定的裂解时间，以充分的将红细胞进行裂解。
进一步地，采用离心的方式去除除白细胞外的所有成分，所述离心的条件为：750-850g，4-6min，离心后去除上清即可。
该步骤根据裂解后的成分与未裂解的白细胞的沉降度不同而进行分离。经试验，上述离心的条件能达到更好的分离效果。
为了使得到的白细胞的纯度更好，去除血液中其他残留的成分，优选地，离心后得到的沉淀采用PBS洗涤2-3次。
进一步地，裂解白细胞采用上述的裂解液B进行；
所述裂解液B与所述血液样品的体积比为4-6:1，裂解的时间为8-15min。
经验证，裂解液B能将白细胞裂解，为获得白细胞的裂解物提供良好的基础。通过添加特定比例的裂解液B，并限定特定的裂解时间，以充分的将白细胞裂解。
本发明中，检测白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1可采用现有的ELISA方法、液相芯片技术以及蛋白芯片技术等。
进一步地，采用ELISA方法检测检所述白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1；
所述ELISA方法具体为：
(a)、将anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体分别包被在酶标板的反应孔中，采用上述的封闭液进行封闭处理；
(b)、然后分别加入制得的白细胞裂解物，孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(c)、在对应的反应孔中加入带有荧光标记的anti-TKTL1抗体或带有荧光标记的anti-DNASE1L1抗体，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
或者
在对应的反应孔中加入与步骤(a)不同种属来源的anti-TKTL1抗体或与步骤(a)不同种属来源的anti-DNASE1L1抗体，孵育后，用PBS缓冲液洗涤，在相应的反应孔中再加入带有荧光标记的相应的TKTL1二抗或带有荧光标记的相应的DNASE1L1二抗，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(d)、采用酶标仪进行检测即可。
当检测涉及到二抗的时候，为了防止二抗与步骤(a)中的抗体结合，首先进行了封闭处理，然后将两次使用的抗体一和抗体二选用不同种属来源的抗体，很好了保证了检测的准确性和稳定性。
其中，在步骤(c)中添加的带有荧光或者不带有荧光的anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体依赖于步骤(b)中添加的抗原，为了充分的抗原与抗体结合，步骤(c)中添加的anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体稍微过量，过量的抗体经过洗涤去除。
进一步地，将anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体分别与包被缓冲液混合，制成的浓度均为1～10μg/mL，然后取80-150μL加入酶标板的反应孔中，4-10℃放置8-12h，弃掉反应孔中的液体，洗涤2-3次，anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体分别包被在不同的酶标板的反应孔中。
酶标板采用的一般为96孔板，在不同的反应孔中添加一定浓度的anti-TKTL1多克隆抗体和anti-DNASE1L1多克隆抗体以使这两个抗体分别充分的固定在反应孔，为下一步与添加的抗原充分反应提供基础。相对于下一步添加的抗原，添加的固定在酶标板的反应孔中的抗体是稍微过量地。
优选地，在步骤(b)中，每个酶标板的反应孔中添加8-15倍稀释的白细胞裂解物0.1mL。
进一步地，在步骤(c)中，带有荧光标记的或者不带有荧光标记的anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体的终浓度均为0.08-0.15μg/mL。
二抗的添加量则根据步骤(c)中的一抗的添加量。优选地，在步骤(c)中，带有荧光标记的TKTL1二抗和带有荧光标记的DNASE1L1二抗的终浓度0.08-0.15μg/mL。
本发明在检测白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1的同时还以细胞内参GAPDH做对照，目的蛋白检测值与内参的比值即为GCI指数，通过引入细胞内参，来控制检测过程中的误差，从而增加检测的准确度。
需要说明的是，本发明白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1在整个检测过程中分别进行检测。另外，酶标仪检测所用的波长根据一抗或二抗标记的荧光种类选择。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了检测肿瘤抗原的试剂盒，该试剂盒针对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平，可应用于体检，为肿瘤患者提供预警。
(2)本发明还限定了所用的试剂盒为ELISA试剂盒，相对于肿瘤组织的切片方法和PCR检测手段，该试剂盒检测便捷，使用方便，对设备要求低。
(3)本发明还提供了肿瘤抗原的检测方法，该方法通过对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平，检测结果稳定，特异性强，检测便利。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
碳酸盐包被缓冲液：为Na2CO3和NaHCO3的水溶液，其中，以水的体积计，Na2CO3的浓度为0.159g/L，NaHCO3的浓度为0.293g/L；
封闭液为含有体积百分数为0.8％BSA的PBS；
1.取血液样本100μL，加2mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育15min，裂解红细胞；
2.800g离心5min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入2ml PBS洗涤，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗3次，洗完后重悬细胞；
4.加入500μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为10min，作为待检样品；
5.包被：用碳酸盐包被缓冲液分别将抗体anti-TKTL1(mouse polyclonal)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal)稀释至蛋白质含量均为5μg/mL，并分别在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；
6.封闭：每孔加入100μl封闭液，25℃封闭1h；
7.加样：加10倍稀释的待检样品0.1mL分别于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
8.在相应的反应孔中加入anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1抗体(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)，加入后两者的终浓度均为0.1μg/mL，37℃，孵育20min；加入2mL PBS洗涤2次；
9.加入1：5000稀释的anti-rabbit-PE抗体(donkey polyclonal，abcam，货号ab7007)，加入后的anti-rabbit-PE抗体的终浓度为0.1μg/mL，避光孵育10min；
10.加入2mL PBS洗2次，酶标仪检测；
仪器名称：Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪；
主要参数设定：488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm；
11.结果判读方法：用细胞内参GAPDH做对照，目的蛋白检测值比上内参值即为GCI指数。
实施例2
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.4)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
碳酸盐包被缓冲液：为Na2CO3和NaHCO3的水溶液，其中，以水的体积计，Na2CO3的浓度为0.154g/L，NaHCO3的浓度为0.29g/L；
封闭液为含有体积百分数为1％BSA的PBS；
1.取血液样本200μL，加3mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育10min，裂解红细胞；
2.750g离心6min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入3ml PBS洗涤，涡旋混匀，750g离心5min，去上清，洗2次，洗完后重悬细胞；
4.加入800μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为8min，作为待检样品；
5.包被：用碳酸盐包被缓冲液分别将抗体anti-TKTL1(mouse polyclonal，sigma)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal，sigma)稀释至蛋白质含量均为1μg/mL，并分别在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.15mL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；
6.封闭：每孔加入100μl封闭液，25℃封闭1h；
7.加样：加15倍稀释的待检样品0.1mL分别于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
8.在相应的反应孔中加入anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1抗体(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)，加入后两者的终浓度均为0.08μg/mL，37℃，孵育15min；加入2mL PBS洗涤2次；
9.在不同的反应孔中加入1：5000稀释的anti-rabbit-PE抗体(donkeypolyclonal，abcam，货号ab7007)，加入后的anti-rabbit-PE抗体的终浓度为0.08μg/mL，避光孵育15min；
10.加入2mL PBS洗2次，酶标仪检测；
仪器名称：Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪；
主要参数设定：488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm；
11.结果判读方法：用细胞内参GAPDH做对照，目的蛋白检测值比上内参值即为GCI指数。
实施例3
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.6)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
碳酸盐包被缓冲液：为Na2CO3和NaHCO3的水溶液，其中，以水的体积计，Na2CO3的浓度为0.165g/L，NaHCO3的浓度为0.30g/L；
封闭液为含有体积百分数为1.2％BSA的PBS；
1.取血液样本100μL，加2mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育20min，裂解红细胞；
2.850g离心4min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入2ml PBS洗涤，涡旋混匀，850g离心5min，去上清，洗3次，洗完后重悬细胞；
4.加入400μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为15min，作为待检样品；
5.包被：用碳酸盐包被缓冲液分别将抗体anti-TKTL1(mouse polyclonal)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal)稀释至蛋白质含量均为10μg/mL，并分别在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.08mL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；
6.封闭：每孔加入100μl封闭液，25℃封闭1h；
7.加样：加8倍稀释的待检样品0.1mL分别于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
8.在相应的反应孔中加入anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1抗体(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)，加入后两者的终浓度均为0.15μg/mL，37℃，孵育30min；加入2mL PBS洗涤3次；
9.加入1：5000稀释的anti-rabbit-PE抗体(donkey polyclonal，abcam，货号ab7007)，加入后的anti-rabbit-PE抗体的终浓度为0.15μg/mL，避光孵育10min；
10.加入2mL PBS洗3次，酶标仪检测；
仪器名称：Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪；
主要参数设定：488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm；
11.结果判读方法：用细胞内参GAPDH做对照，目的蛋白检测值比上内参值即为GCI指数。
实施例4
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
碳酸盐包被缓冲液：为Na2CO3和NaHCO3的水溶液，其中，以水的体积计，Na2CO3的浓度为0.159g/L，NaHCO3的浓度为0.293g/L；
封闭液为含有体积百分数为1％BSA的PBS；
1.取血液样本100μL，加2mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育15min，裂解红细胞；
2.800g离心5min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入2ml PBS洗涤，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗3次，洗完后重悬细胞；
4.加入500μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为10min，作为待检样品；
5.包被：用碳酸盐包被缓冲液分别将抗体anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)稀释至蛋白质含量均为5μg/mL，并分别在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；
6.封闭：每孔加入100μl封闭液，25℃封闭1h；
7.加样：加10倍稀释的待检样品0.1mL分别于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
8.在相应的反应孔中加入带有PE荧光标记的anti-TKTL1或带有PE荧光标记的anti-DNASE1L1抗体，加入后两者的终浓度均为0.1μg/mL，37℃，避光孵育20min；
9.加入2mL PBS洗2次，酶标仪检测；
仪器名称：Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪；
主要参数设定：488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm；
10.结果判读方法：用细胞内参GAPDH做对照，目的蛋白检测值比上内参值即为GCI指数。
试验例1
取确诊的癌症一期患者的血样采用实施例1-4的方法分别进行检测，该血样均分为21份，每个实施例进行平行试验3个；同时设置对照组1-3，每个对照组进行平行试验3个；对照组1：血液去血清，得到的血细胞100μL加2mL含有1％SDS的PBS溶液,混匀，于4℃裂解10min，得到的裂解液作为待检样品；对照组2：血液去血清，得到的血细胞100μL加2mL含有1％Triton X-100的PBS溶液,混匀，于4℃裂解10min，得到的裂解液作为待检样品；对照组3：取血液的血清作为待检样品；对照组1-3后续的检测步骤同实施例2。然后将得到的ELASA结果进行计算统计，TKTL1检测值与内参值的比值计算得到的GCI指数如表1所示，DNASE1L1检测值与内参值的比值计算得到的GCI指数如表2所示。
表1 TKTL1检测结果
表2 DNASE1L1检测结果
从表1和表2可以看出，采用本发明提供的试剂盒进行检测，每个实施例检测同一样本两组数据的标准偏差均在0.02以内；另外，本发明还对其他的样本进行这种检测，相同样本的标准偏差均在0.02以内。而对照组1-2中采用血细胞的裂解物作为待测样本，由于杂质多，得到的数据不稳定，偏差大；而对照组3中采用血清作为待测样本，血清中目标蛋白很少，基本检测不到。可见，本发明提供的试剂盒检测稳定性好，灵敏性高。
试验例2
分别取确诊的早期良性肿瘤患者的血样(样1)、癌症一期患者的血样(样2)、癌症二期患者的血样(样3)、癌症三期患者的血样(样4)以及正常人的血样(样5)分别采用实施例2的方法进行检测，同时将每个样本稀释不同的倍数进行检测，TKTL1检测得到的GCI指数结果如表3所示，DNASE1L1检测得到的GCI指数结果如表4所示。
表3 TKTL1检测结果
表4 DNASE1L1检测结果
从表3和表4可以看出，采用本发明提供的试剂盒进行检测，样本经稀释后，仍然具有很好的灵敏度和准确度；并且，不同确诊的样本之间的数值具有显著的差异。从表3和表4可以看出可选择样本原液或者稀释4倍以内均可很好的检测到差别。另外，大批试验也证实了不同确诊的样本之间的数值具有显著的差异。
此外，不同确诊的患者血样采用实施例1、3-4中的方法进行检测，得到的结果与实施例2结果一致。
经大量试验发现，待检测样品根据其中TKTL1和DNASE1L1的变化而检测相应强度变化的特异性荧光，检测结果稳定可靠，为肿瘤的辅助检测提供技术支持。具体地，本发明可以有以下方面的应用：
对不同个体的血液检测肿瘤抗原的水平，不同的个体可以为：健康与不同时期的肿瘤患者；通过大规模试验，分别通过得到的TKTL1和DNASE1L1换算的GCI指数获得大量不同个体的肿瘤抗原水平，进而可以设置一个特定值，以区分不同的患者。由于测定的样本中的TKTL1和DNASE1L1的数值由多种因素造成，因此，在后续检测过程中，根据对人体的血液中肿瘤抗原的水平，若是超出一定数值，则需要做进一步的检测，进而才能判断是否患有肿瘤。本发明通过测定GCI指数来辅助预测个体患肿瘤风险，为肿瘤预警提供技术支持。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种检测肿瘤抗原的试剂盒，其特征在于，包括抗体一以及显示所述抗体一的物质，
和/或
抗体二以及显示所述抗体二的物质；
所述抗体一的抗原为TKTL1，所述抗体二的抗原为DNASE1L1。
2.根据权利要求1所述的检测肿瘤抗原的试剂盒，其特征在于，所述显示所述抗体一的物质为标记在所述抗体一上的荧光标记，所述显示所述抗体二的物质为标记在所述抗体二上的荧光标记；
或者
所述抗体一为两种不同种属来源的抗体一，所述显示所述抗体一的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体一配对的二抗；所述抗体二为两种不同种属来源的抗体二，所述显示所述抗体二的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体二配对的二抗；
优选地，抗体一为anti-TKTL1，所述抗体二为anti-DNASE1L1。
3.根据权利要求1所述的检测肿瘤抗原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒，所述试剂盒还包括裂解液A、裂解液B、包被缓冲液、封闭液、细胞洗涤缓冲液、酶标板中的任意一种或几种；
所述裂解液A含有以下浓度的各成分：
10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.4-7.6)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
所述裂解液B含有以下浓度的各成分：
150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
所述包被缓冲液为碳酸盐包被缓冲液，所述碳酸盐包被缓冲液为Na2CO3和NaHCO3的水溶液，其中，以水的体积计，Na2CO3的浓度为0.154-0.165g/L，NaHCO3的浓度为0.29-0.30g/L；
所述封闭液为含有体积百分数为0.8％-1.2％BSA的PBS。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测肿瘤抗原的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为PE、CY5、CY7、per-CP以及TRITC中的任一种。
5.一种肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1来获知肿瘤抗原的信息。
6.根据权利要求5所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，所述白细胞裂解物通过以下方法制备：
取血液样品，裂解红细胞，去除除白细胞外的所有成分；
得到的白细胞进行裂解，得到白细胞裂解物；
优选地，所述裂解红细胞采用权利要求3中的裂解液A进行，所述裂解液A与所述血液样品的体积比为15-20:1，裂解的时间为10-20min。
7.根据权利要求6所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，采用离心的方式去除除白细胞外的所有成分，所述离心的条件为：750-850g，4-6min，离心后去除上清即可；
优选地，离心后得到的沉淀采用PBS洗涤2-3次。
8.根据权利要求6所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，裂解白细胞采用权利要求3中所述的裂解液B进行；
所述裂解液B与所述血液样品的体积比为4-6:1，裂解的时间为8-15min。
9.根据权利要求5-8任一项所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，采用ELISA方法检测检所述白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1；
所述ELISA方法具体为：
(a)、将anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体分别包被在酶标板的反应孔中，采用权利要求3中的封闭液进行封闭处理；
(b)、然后分别加入制得的白细胞裂解物，孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(c)、在对应的反应孔中加入带有荧光标记的anti-TKTL1抗体或带有荧光标记的anti-DNASE1L1抗体，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
或者
在对应的反应孔中加入与步骤(a)不同种属来源的anti-TKTL1抗体或与步骤(a)不同种属来源的anti-DNASE1L1抗体，孵育后，用PBS缓冲液洗涤，在相应的反应孔中再加入带有荧光标记的相应的TKTL1二抗或带有荧光标记的相应的DNASE1L1二抗，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(d)、采用酶标仪进行检测即可。
10.根据权利要求9所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，在步骤(a)中，将anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体分别与包被缓冲液混合，制成的浓度均为1～10μg/mL，然后取80-150μL加入酶标板的反应孔中，4-10℃放置8-12h，弃掉反应孔中的液体，洗涤2-3次，anti-TKTL1抗体和anti-DNASE1L1抗体分别包被在不同的酶标板的反应孔中；
优选地，在步骤(b)中，每个酶标板的反应孔中添加8-15倍稀释的白细胞裂解物0.1mL。
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