CN101142486A - 检查和控制哺乳动物生物体中哺乳动物乳酸发酵过程/需氧葡萄糖发酵代谢途径的方法 - Google Patents

Abstract

定性和定量检测哺乳动物个体中哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径(mam－aGF)的使用程度和正确过程流的方法，其特征在于，酶TKTL1用作指示剂和靶分子，且将所述个体(患者)的生物样品中的所述TKTL1的结构和/或功能参数作为所述个体(患者)的细胞和/或组织中的mam－aGF的定性和定量运行的指示。与该mam－aGF的抑制剂和激活剂的使用相组合，该方法还适用于检查和控制个体(患者)的mam－aGF。

Description

检查和控制哺乳动物生物体中哺乳动物乳酸发酵过程/需氧葡萄糖发酵代谢途径的方法

本发明涉及(1)定性和定量检测哺乳动物个体(患者，哺乳动物生物体)中哺乳动物乳酸发酵过程或哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径的方法，(2)检查和控制(即抑制或激活)所述过程/途径的方法，和(3)该过程/途径的抑制剂和激活剂。

本发明是基于新的科学发现，即(1)迄今为止仅仅从原核细胞(例如乳杆菌)知道的代谢途径，也存在于哺乳动物生物体即哺乳动物细胞中，所述代谢途径包含葡萄糖向乳酸的产能分解，尽管存在足够的游离(分子)氧，且存在生物可利用的即有氧条件，和(2)酶TKTL1是所述新葡萄糖发酵代谢的示踪酶。

在缺氧的情况下，哺乳动物细胞能将葡萄糖分解成乳酸，最终导致肌肉疼痛。该厌氧葡萄糖降解是通过糖酵解途径进行的。在20世纪二十年代，Otto Warburg发现，在有足够利用量的氧存在下，哺乳动物细胞也能将葡萄糖分解成乳酸，即甚至在有足够量的游离的生物可利用的氧存在下，哺乳动物细胞能将葡萄糖发酵成乳酸。他在肿瘤组织以及某些健康组织(如视网膜和睾丸)中，观察到在有氧情况下该厌氧的葡萄糖至乳酸降解途径。由于历史原因，甚至在有氧存在下该葡萄糖至乳酸的降解称作需氧糖酵解或Warburg效应。由于起点和终点(葡萄糖和乳酸)与在缺氧情况下通过糖酵解途径的葡萄糖至乳酸发酵相同，已经将乳酸生成解释为糖酵解途径的结果。但是，在导致本发明的试验过程中，显而易见的是，甚至在有氧存在下，是TKTL1转酮酶允许葡萄糖降解或葡萄糖发酵成乳酸，且该葡萄糖途径与糖酵解途径明显不同。

Coy等已经在几年前(即1996年)发现了TKTL1转酮酶基因(Genomics 32,309-316)。由于在预测的编码外显子中的终止密码子，在序列数据库中已经将TKTL1转酮酶基因注解为拟基因。尽管如此，在2002年，Coy证实了TKTL1基因会编码酶活性的转酮酶。TKTL1转酮酶与2种其它已知人转酮酶TKT和TKTL2在系统发育上同源。但是，所有3种转酮酶由不同的基因编码，在人类中，TKT的基因位于染色体3上，TKTL2的基因位于染色体4上，TKTL1的基因位于染色体X的Xq28带。

酶TKTL1在哺乳动物细胞中的一个最重要的功能是其在有氧存在下(即在有氧条件下)葡萄糖至乳酸的发酵过程中的催化剂功能。TKTL1是新的、最近首次发现的所谓的哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径或哺乳动物乳酸发酵过程的示踪酶。在下文中，该新发现的途径称作哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径，或缩写成mam-aGF。

mam-aGF的细节如下：

含有TKTL1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)的蛋白复合物允许非氧化性的葡萄糖降解。在TKTL1表达细胞中，电子转移不涉及线粒体，并允许不依赖于线粒体的ATP生产。使用抗-TKTL1化合物，或抑制性的硫胺类似物，或对苯醌类(parabenzoquinons)(或苯醌-衍生物)，可以抑制这样的不依赖于线粒体的ATP生产(更具体地，例如在具有基于TKTL1的糖代谢的肿瘤中)。

使用人TKTL1蛋白，本专利申请的发明人证实，在单底物反应中使用X5P作为唯一碳源形成甘油醛-3-磷酸。

通过TKTL1对X5P的代谢，导致乙酰基-CoA的形成。在有氧条件下的厌氧葡萄糖降解产生乳酸，并构建了富含能量的化合物乙酰基-CoA。然后，丙酮酸脱氢酶复合物例如受到乙酰基-CoA的抑制，结果，丙酮酸主要被还原成乳酸。

在图13和图14中，给出了完整mam-aGF的图解。

关于mam-aGF的示踪酶TKTL1的细节如下：

在导致本发明的试验过程中，使用特异性地检测TKTL1蛋白的新的单克隆抗体(Linaris Biologische Produkte GmbH，Wertheim)，在蛋白水平鉴别了不同的TKTL1同种型。

TKTL1蛋白同种型是多蛋白复合物的一部分。在该复合物中，TKTL1也结合转酮酶不相关的蛋白，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，DNA酶X(DNA酶1-样-1)，Akt(＝蛋白激酶B)；组蛋白，组蛋白脱乙酰酶，淀粉状蛋白前体蛋白和肌动蛋白结合蛋白。

已知的转酮酶是携带所有典型的不变的转酮酶氨基酸残基的2个全长蛋白的同源二聚体。转酮酶-样基因编码的TKTL1蛋白同种型构成TKTL1同源二聚体/异源二聚体和TKT/TKTL1或TKTL2/TKTL1异源二聚体。TKTL1蛋白同种型(甚至无酶活性的同种型)的表达，会影响作为TKT/TKTL1或TKTL2/TKTL1异源二聚体的一部分的TKT或TKTL2蛋白的酶活性。分子开关和质子线使TKT/TKTL1、TKTL2/TKTL1和TKTL1/TKTL1同源和异源二聚体中的活性部位同步化。

TKTL1基因(NM_012253；登记号：X91817；BC025382)编码全长转酮酶蛋白以及较小的蛋白同种型的证据，对于基础研究和医学健康具有重要意义。

除了它们的酶功能以外，TKTL1蛋白还表现出多种不同功能，这取决于该蛋白在哺乳动物细胞中的定位和它们的聚集状态。在哺乳动物细胞中，TKTL1蛋白主要位于细胞质中，但是也会存在于细胞核中。TKTL1在细胞质中的主要功能是，催化(转)酮酶反应。位于细胞核中的TKTL1蛋白的其它功能与控制细胞周期和有丝分裂、控制转录(TKTL1基因本身和其它)和调节细胞凋亡有关。

将TKTL1蛋白(它们的功能取决于它们的定位或聚集状态)称作“兼差”蛋白，因为它们根据亚细胞定位、细胞类型以及它的聚集状态，执行不同的功能。

本发明是基于下述目的：(a)提供定性和定量检测(和监测)哺乳动物个体中哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径(mam-aGF)的使用程度(水平)和正确的(正常的，天然的)过程流的方法，即控制该代谢/途径/过程在研究的适当哺乳动物生物体的细胞中是否实际上进行的方法，如果是的话以何种程度和它是否进行“正常”或正确，或具有错误或失常；和(b)提供可以影响、尤其是增强或抑制mam-aGF的手段。

用如下(体外-)方法实现该目的：定性和定量检测(和监测)哺乳动物个体(患者)中真核生物需氧葡萄糖发酵代谢途径″mam-aGF″(或哺乳动物乳酸发酵过程)的使用程度(水平)和正确的(正常的，天然的)过程流的(体外-)方法，其特征在于

(a)酶TKTL1用作指示剂和靶分子，和

(b)所述方法包括下述步骤：

-取(收获，采集)所述个体(患者)的生物样品，

-测定所述个体(患者)样品和对照样品中TKTL1蛋白的活性和/或浓度，和/或细胞定位和/或聚集状态和/或二聚化状态，

-将从所述个体(患者)样品得到的测定数据与从对照样品得到的数据进行对比，

和(i)将所述个体样品与对照样品相比TKTL1蛋白的增强的或降低的活性和/或浓度水平，分别作为哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径″mam-aGF″的增强的或降低的使用程度(水平)的指示，

(ii)将所述个体样品与对照样品相比TKTL1蛋白的异常的细胞定位和/或异常的聚集状态和/或异常的二聚化状态，作为异常的(有缺陷的，紊乱的，错误的)哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径的指示。

检测(测定)可以在溶液中进行，或使用固定化在固相上的试剂。一种或多种分子标记(例如多肽或核酸)的检测，可以在单一反应混合物或2种或分开的反应混合物中进行。或者，几种标记分子的检测反应，可以例如在多孔反应罐中同时进行。TKTL1基因产物特征性的标记可以使用特异性地识别这些分子的试剂检测。标记分子的检测反应可以包含一个或多个反应，其中的检测试剂识别原始的标记分子或识别用于识别其它分子的在先分子。

检测反应还可以包含报告反应，它指示着TKTL1基因标记是否存在和/或水平。报告反应可以是，例如，产生有色化合物的反应，生物发光反应，荧光反应，通常是发射辐射的反应等。在一个优选的实施方案中，不同的标记分子可以由产生不同的报告信号的试剂识别，从而可以区分指示标记分子的信号。

根据本发明的检测反应的适用格式可以是，印迹技术，例如蛋白印迹，DNA印迹，和RNA印迹。印迹技术是本领域普通技术人员已知的，且可以实现为例如电印迹，半干印迹，真空印迹，或点印迹。扩增反应也可以用于检测例如核酸分子。另外，可以使用检测分子的免疫学方法，例如免疫沉淀或免疫学测定，例如ELISA，RIA，横向流测定，免疫细胞化学方法等。

基于该方法得到的信息，医学从业人员能作出关于相应个体(患者)的健康状况的结论，并在必要时制订治疗方案。

因此，所述方法适用于且目的在于，监测(检测，调查和观察)与增加的或减少的和/或异常的即有缺陷的/错误的/紊乱的mam-aGF有关的疾病的进程。

TKTL1活性和/或浓度的测定可以包含，检测样品中TKTL1基因产物的水平，或检测TKTL1的酶活性。

监测可以包含，检测在不同的时间点采集的样品中的TKTL1基因产物或TKTL1酶活性的水平，和检测所述水平的变化。根据所述变化，可以追踪疾病进程。疾病进程可以用于选择特定个体的治疗策略。

检测和监测疾病进程的另一个方面可以包含，检测轻微残留疾病。这可以包含，例如，在初步治疗个体后，一次或在几个时间点，检测一个或多个身体样品中的TKTL1基因产物水平或TKTL1酶活性。根据在样品中测得的TKTL1基因产物水平，可以选择适用于特定个体的治疗。

基于在样品中测得的TKTL1基因产物水平或测得的酶活性，可以将个体细分成亚群。基于这些亚群，可以进行预后评估。根据亚群，可以定制受不同疾病影响的个体的治疗。例如TKTL1基因的过表达和增强的戊糖磷酸循环活性，暗示着硫胺(维生素B1)促进核酸核糖合成的机理和增强的葡萄糖代谢。因此，硫胺摄入对具有转酮酶样-1基因过表达的疾病具有直接影响。这也提供了背景信息，且有助于在临床环境中开发使用抗硫胺转酮酶抑制剂的替代治疗的指导。RNA核糖的分析表明，葡萄糖碳为培养的子宫颈和胰腺癌细胞中超过90％的核糖合成作出贡献，且核糖主要是通过硫胺依赖性的转酮酶途径来合成(＞70％)。抗硫胺化合物会显著抑制核酸合成。硫胺或苯磷硫胺治疗会激活TKTL1，从而激活糖代谢，和减少有毒的或不希望的反应(例如AGE形成，乙二醛)。

另外，所述方法可以包含，检测针对TKTL1基因编码的多肽的自身抗体。通过本领域技术人员已知的方法，根据本发明的方法使用的多肽可以用于检测这样的抗体在体液中存在与否。

所述方法也适用于进行体内或体外分子成像，所以可以在非常早的阶段鉴别与增加的或降低的或异常的即有缺陷的mam-aGF有关的疾病，理想的是在出现典型已知的该疾病症状之前。结果，个体或其医生能在非常早的时间点治疗该疾病，从而显著增加痊愈的机会。

分子成像不同于常规技术，因为它鉴别特定的基因产物和细胞内过程，如特定的酶反应。TKTL1酶的改变的底物特异性和反应反式，可以用于检测具有增加的或减少的TKTL1酶活性的细胞或组织。TKTL1酶的改变的底物特异性和反应反式，允许区分3种转酮酶(-样)酶的酶活性，从而允许体内测量TKTL1酶活性。可以检测酶活性，例如通过正电子发射断层摄影术，化学发光或放射摄影成像。

分子成像可以基于TKTL1分子将惰性或标记的化合物酶促地转化成在分子成像方法过程中可检测到的分子。在另一个实施方案中，分子成像方法可以基于使用携带适用于体内分子成像的标记的化合物，所述标记例如放射性同位素，金属离子等，其在体内特异性地结合TKTL1分子。

这些化合物优选地是无毒的，可以在一定时间段内从生物体(例如人)循环中清除，其允许检测在过表达TKTL1基因的组织中积累的标记。在分子成像的情况下，循环清除不相关(例如由于循环分子产生的低背景等)，使用的化合物应当以药学上可接受形式在组合物中给药，所述组合物可以另外包含任意其它合适的物质，例如其它诊断上有用的物质，治疗上有用的物质，载体物质等。

个体的生物样品可以是从所述个体得到的几乎每种组织或液体样品。所述个体的分离的细胞、裂解的细胞、细胞碎片、肽或核酸也是合适的样品。其它合适的样品是例如活组织检查制品，体液，分泌物，涂片，血清，尿，精液，粪便，胆汁，含有细胞的液体。

本发明的方法的步骤(b)的测定可以在蛋白水平进行，即使用TKTL1蛋白或TKTL1蛋白片段作为靶物。优选地，使用特异性地结合TKTL1蛋白的分子进行测定。

优选地，所述分子是针对TKTL1的抗体或这样的抗-TKTL1-抗体的片段或包含抗原结合表位的肽模拟物(peptidomimetic)或小抗体(mini-antibody)。

合适的靶分子是TKTL1蛋白本身、或其片段、或包含TKTL1蛋白的融合蛋白。

蛋白水平即TKTL1基因产物的测定，可以在例如包含对TKTL1蛋白的检测特异性的抗体的反应中进行。所述抗体可以用于许多不同的检测技术中，例如蛋白印迹，ELISA或免疫沉淀。通常，基于抗体的检测也可以体外进行，或直接地原位进行，例如在免疫组织化学染色反应的过程中。根据本发明，可以使用用于检测生物样品中特定多肽的量的任何其它方法。

用于检测TKTL1基因产物的试剂可以包括能结合TKTL1蛋白分子的任意试剂。这样的试剂可以包括蛋白，多肽，核酸，肽核酸，糖蛋白，蛋白聚糖，多糖或脂类。

在本发明上下文中使用的TKTL1基因产物可以包含由转酮酶样-1基因编码的多肽和核酸。分离了用于执行本发明的方法的多肽和多核苷酸(参见TKTL1，TKR：NM_012253；登记号：X91817；BC025382)。这意味着，所述分子从它们的原始环境中分离。如果它们与在天然环境中共存的一些或所有物质分离，则天然存在的蛋白是分离的。例如如果它们被克隆进载体中，则多核苷酸是分离的。

除了具有增加的或减少的酶活性水平的TKTL1蛋白变体以外，可以检测患者细胞中改变的定位或聚集和/或二聚化的TKTL1蛋白。使用特异性地检测TKTL1蛋白的单克隆抗体(Linaris BiologischeProdukte，Wertheim)，可以在从体液分离的细胞中，检测细胞核内的TKTL1蛋白。使用免疫细胞化学，可以确定来自健康个体和患者的细胞的细胞核和细胞质中的TKTL1的定位。在阿尔茨海默病患者亚群中，在细胞核内可检测到增强的TKTL1定位。阿尔茨海默病患者中也存在不同的TKTL1聚集。使用二维凝胶电泳，可以进行该聚集的检测(图15)。另外，使用TKTL1和GAPDH的抗体，可以通过ELISA检测与其它蛋白例如GAPDH的聚集。

另外，本发明的方法的步骤(b)的测定可以在核酸水平进行，即使用TKTL1核酸或其片段作为靶物。在本上下文中使用的术语″TKTL1核酸″包含TKTL1基因，TKTL1 mRNA和TKTL1编码核酸。

在一个优选的实施方案中，样品中上述相关TKTL1参数的检测，应当使用至少一种能杂交TKTL1核酸的核酸探针来进行。合适的靶分子是TKTL1核酸本身以及包含TKTL1编码核酸或其片段的嵌合核酸。

核酸(DNA和/或RNA)的检测方法可通过例如待测分子与互补的核酸探针、对所述核酸具有结合特异性的蛋白，或任何其它特异性识别和结合上述核酸的实体的结合反应来完成。这些方法可在体外完成，也可直接在原位完成，例如在检测染色反应的过程中。根据本发明的方法，另一种在核酸水平检测样品中TKTL1基因产物的方法为核酸扩增反应，可采用定量的方式，例如聚合酶链式反应来完成。在本发明的一个优选的实施方案中，实时RT-PCR可用来定量样品中的TKTL1RNA水平。

用于进行阳性对照的TKTL1样品可以包含，例如适用形式(例如溶液或盐)的TKTL1核酸或多肽或其片段，适用形式的肽，组织切片样品或阳性细胞。

总之：基于TKTL1基因突变、分离的TKTL1蛋白的减少的或增加的酶活性或TKTL1酶反应的体内成像，可以鉴别个体中TKTL1酶活性的类型(方式)(正常的，减少的或增加的)。通过检测从患者(例如血清，液体，或其它体液)分离的TKTL1蛋白的酶活性，或者通过TKTL1酶活性的体内成像，可以进行诊断。

用于进行本发明的方法的试剂盒可以含有诊断系统，其依赖于生物发光在原位显现观察组织。这些系统还可以包括组合物，其含有被TKTL1酶活性转化的底物。更具体地，这些系统可以包括组合物，其含有生物发光生成反应。该组合物的施用导致靶向组织发光，这允许检测和定位细胞或组织，例如用于手术摘除。

为了在分子成像(尤其是组织的放射摄影成像)的过程中执行本发明的方法，提出使用不透射线的成像剂，它在一个实施方案中与它的功能或生理活性成比例地在组织中细胞内积累。在一个实施方案中成像剂是TKTL1的透细胞膜的、不透射线的、选择性底物或高亲和力配体。

因此，本发明也涉及标记的TKTL1底物和它们作为成像剂的应用，例如作为正电子发射断层摄影术(PET)成像剂或磁共振体层摄影术(MRT)成像剂，用于非侵入性地检测和定位具有增加的或减少的TKTL1酶活性的细胞和组织。

非常适合用作PET的成像剂的标记的底物是¹⁸F-标记的TKTL1。

本发明还涉及合成标记的底物的方法，和包含这样的类似物的组合物。

在导致本发明的试验的过程中，还发现，TKTL1的突变(例如在哺乳动物进化过程中，在TKTL1中发生编码38个氨基酸的外显子的缺失)不仅导致底物特异性的降低，还导致对硫胺亲和力的降低。因而，降低的硫胺水平导致一些TKTL1蛋白的增加的失败，导致归因于降低的TKTL1活性的损害。通过激活该代谢途径，可以避免或至少纠正这些病理变化。TKTL1的硫胺亲和力或TKTL1的量或TKTL1的活性的测定，可以用于鉴别应当用硫胺或具有更好的生物利用度的硫胺-衍生物(例如苯磷硫胺)治疗的个体。

这样的个体可以是，例如，具有糖尿病相关现象的糖尿病患者，所述现象如视网膜病，(心脏自主神经)神经病，或内皮细胞的损害。

因此，本发明还涉及控制需要这种控制的哺乳动物受试者(患者)中mam-aGF的方法，其中所述控制包含，施用有效量的酶TKTL1活性或浓度的至少一种抑制剂或激活剂。

换而言之：本发明还涉及酶TKTL1活性或浓度的抑制剂或激活剂在生产药物组合物中的应用，所述药物组合物用于抑制或激活mam-aGF，即用于治疗性治疗或控制与减少的或增加的mam-aGF有关的疾病。

该技术教导是基于下述科学发现(在新的和令人惊奇的发现mam-aGF的过程中)，即TKTL1酶的另一种重要性质是它作为mam-aGF抑制剂或激活剂的靶分子的适用性。

与TKTL1基因的过表达有关的病症的治疗，可以包含适用于降低个体或个体细胞中TKTL1多肽的活性的任意方法。这些方法可以包含，通过降低基因表达，或通过降低酶活性，降低TKTL1多肽的活性。实例可以包含，施用反义构建体、核酶、酶抑制剂，施用TKTL1多肽的辅因子的拮抗剂，例如抗硫胺化合物，或减少施用酶活性必需的辅因子(例如硫胺)。

与TKTL1基因的过表达有关的病症的一种优选治疗包含，施用抗硫胺化合物，或减少表现出特征在于TKTL1基因过表达的病症的个体的硫胺摄入。

因此，本发明也包含药物组合物，它包含有效量的酶TKTL1活性或浓度的抑制剂或激活剂和药学上可接受的载体。

这样的药物组合物的一个优选实施方案包含选自下述的TKTL1抑制剂：羟基硫胺，benfooxytiamine(＝oxybenfotiamin)，羟基丙酮酸，丙酮酸，对羟基苯基丙酮酸，吡啶硫胺，安普罗铵，2-甲基硫胺，2-甲氧基-对苯醌(2-MBQ)和2，6-二甲氧基-对苯醌(2，6-DMBQ)，金雀异黄素，和黄酮醇例如槲皮素，儿茶素，nitrilosides，花色素苷；或其衍生物。

具有TKTL1抑制剂作用的这样的药物组合物的一个优选实施方案包含，一种或多种具有下述化学结构(结构式)的安普罗铵衍生物：

和/或至少一种具有下述化学结构(结构式)的黄酮醇：

具有TKTL1抑制剂作用的药物组合物的另一个优选实施方案包含，一种或多种具有下述化学结构(结构式)的硫胺和/或苯磷硫胺衍生物

(a)：

硫胺衍生物

和(b)：

苯磷硫胺衍生物。

一种优选的抑制性的苯磷硫胺衍生物是具有下述化学结构(结构式)的oxybenfotiamin(＝benfooxytiamin)：

具有TKTL1激活剂作用的药物组合物的一个优选实施方案包含，硫胺和/或苯磷硫胺和/或其功能等同的(即激活性)衍生物。

激活性硫胺衍生物优选地具有下述化学结构(结构式)：

激活性苯磷硫胺衍生物优选地具有下述化学结构(结构式)：

上面列出的激活剂或抑制剂的衍生物，可以通过取代或添加一个或多个下述基团来产生：

直链和支链(C₁-C₁₂)脂族烷基，其被至少一个选自下述的基团取代：OH，NH₂，SH，CN，CF₃，卤素，CONHR⁵，COOR⁵，OR⁵，SR⁵，SiOR⁵，NHR⁵，脂族(C₃-C₆)环，和芳族(C₃-C₆)环，其中R⁵选自直链和支链(C₁-C₄)烷基，

芳基，

天然的聚合物，合成的聚合物，和共聚物，所述聚合物和共聚物携带至少2个选自下述的基团：羟基，羧酸，伯胺，仲胺，叔胺，硫醇，和醛；

氢原子，卤素原子，CF₃，OH，OCF₃，COOH，R⁷，OR₇，和OCOR⁷，其中R⁷选自直链和支链(C₁-C₄)脂族烷基；

单卤化的和多卤化的直链和支链(C₁-C₄)烷基，和芳基，其中所述芳基任选地被至少一个选自下述的基团取代：OH，NH₂，SH，CN，CF₃，卤素，COOH，CONHR⁸，COOR⁸，OR⁸，SR⁸，和NHR⁸，其中R⁸选自直链和支链(C₁-C₁₂)烷基；和

直链和支链(C₁-C₄)烷基，和CF₃基团。

TKTL1抑制剂或激活剂也可以以一种或多种核酸分子、重组载体、多肽、反义RNA序列、核酶和/或抗体的形式实现。

因此，适用于预防或治疗与突变的TKTL1蛋白的异常细胞定位、聚集状态和/或二聚化状态(与对照contraception相比)有关的疾病的本发明的另一种药物组合物的特征在于，它包含有效量的核酸分子、重组载体、多肽、反义RNA序列、核酶或抗体。

该药物组合物可以例如含有编码功能性TKTL1的DNA。可以以允许原位产生多肽的方式，施用DNA。合适的表达系统是本领域技术人员已知的。转基因的哺乳动物细胞可以用于递送和/或表达核酸。适当方法是本领域技术人员已知的。

或者，药物组合物可以包含一种或多种多肽。掺入药物组合物中的多肽可以是TKTL1多肽以及一种或多种其它已知的多肽，例如酶，抗体，调节因子例如细胞周期蛋白、细胞周期蛋白-依赖性的激酶或CKI，或毒素。

当血糖水平升高时，一些关键种类的细胞(包括神经细胞(神经元)和构成眼视网膜的小血细胞和肾的过滤单元(肾小球)的细胞)也会富含葡萄糖。在这些细胞中产生的高糖水平，会造成葡萄糖的正常细胞代谢的阻塞。该阻塞导致葡萄糖相关的细胞损害，和称作磷酸丙糖的超反应性葡萄糖-代谢中间体在细胞内的积累，导致渐进性糖化终极产物(AGE)。这一旦发生，过量的葡萄糖和磷酸丙糖会攻击细胞中周围的蛋白、脂类和DNA。

在该情况下，通过激活TKTL1来增强mam-aGF是纠正和预防性的。通过mam-aGF途径，将葡萄糖降解成无毒的化合物如脂肪酸，从而避免渐进性糖化终极产物损害。

因此，本发明涉及在需要这种治疗的患者中治疗葡萄糖和磷酸丙糖相关的细胞损害和预防AGE-相关的细胞损害的方法，其包含，给所述患者施用有效量的至少一种TKTL1激活剂。

换而言之：因此，本发明也涉及至少一种TKTL1激活剂在生产药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗和预防患者的AGE-相关的细胞损害。

mam-aGF途径的缺陷/紊乱不通常伴随严重疾病，有时仅仅伴有事实上是主观不适、但是不需要医学治疗的身体状态紊乱。而且，mam-aGF途径不仅可以通过激活或抑制TKTL1酶来控制，也可以通过限制该代谢途径的底物(葡萄糖)来控制。因此，本发明还提供了营养组合物/食品添加物，其含有低葡萄糖/碳水化合物含量，高油/脂肪含量，和中等的蛋白含量，还包含有效量的酶TKTL1活性或浓度的抑制剂或激活剂和药学上可接受的载体。

这样的营养组合物/食品添加物的一个优选实施方案包含，选自下述的TKTL1抑制剂：羟基硫胺，benfooxytiamine，羟基丙酮酸，丙酮酸，对羟基苯基丙酮酸，吡啶硫胺，安普罗铵，2-甲基硫胺，2-甲氧基-对苯醌(2-MBQ)和2，6-二甲氧基-对苯醌(2，6-DMBQ)，金雀异黄素，和黄酮醇例如槲皮素，儿茶素，nitrilosides，花色素苷；或其衍生物。

这样的营养组合物/食品添加物的另一个优选实施方案包含，TKTL1激活剂，尤其是硫胺或苯磷硫胺或其一种或多种衍生物。所述衍生物优选地特征在于，上述化学结构(结构式)。

本发明也涉及化合物在治疗与TKTL1蛋白的增强的或降低的水平或活性、异常细胞定位、聚集状态和/或二聚化状态(与对照相比)有关的疾病中的应用，其中所述化合物是通过包含下述步骤的方法鉴别出的化合物：

(a)使前面定义的TKTL1多肽或表达所述多肽的细胞在能提供可检测信号的组分存在下接触，所述信号响应于生物活性，优选转酮酶活性；和

(b)检测从所述生物活性产生的信号是否存在或其增强，其中信号的不存在、降低或增强指示推定药物。

药物候选物可以是单一化合物或多种化合物。术语″多种化合物″应当理解为，可以相同或不同的多种物质。所述化合物或多种化合物可以化学合成或微生物产生和/或含在例如样品内，例如来自例如植物、动物或微生物的细胞提取物。此外，所述化合物可能为本领域已知的，但迄今不了解其能抑制或激活TKTL1多肽。反应混合物可以是无细胞提取物，或可以包含细胞或组织培养物。合适的设置为本领域技术人员已知的。许多化合物可以例如加入到反应混合物、培养基中，注入到细胞中或应用到转基因动物。可用于本发明的方法的细胞或组织优选地是前文实施方案描述的本发明的宿主细胞、哺乳动物细胞或非人类转基因动物。

如果在本发明的方法中鉴定包含一种化合物或多种化合物的样品，则可能从确定含有能够抑制或激活TKTL1的化合物的原始样品中分离该化合物，或者将原始样品再细分，例如如果样品由多种不同的化合物组成，以降低每个样品中不同物质的数目，并对原始样品的细分重复该方法。根据样品的复杂性，上述步骤可以进行多次，优选地，直至根据本发明方法鉴定的样品只包含有限数目或仅一种物质为止。优选地，所述样品包含具有相似的化学和/或物理特性的物质，最优选地，所述物质相同。

可以试验和鉴定的化合物可以是肽、蛋白、核酸、抗体、小的有机化合物、激素、肽模拟物、PNA等。这些化合物还可作为前导化合物来开发类似物化合物。类似物应当具有稳定的电子构型和分子构象，允许关键的功能基团以同前导复合物基本相同的方式呈现于TKTL1。更具体地，该类似物化合物具有同结合区域相当的空间电子性质，但可以是比前导化合物更小的分子，通常分子量低于大约2kD，并且优选低于大约1kD。可以通过使用例如自洽场(SCF)分析、构型相互作用(CI)分析和简正模式动态分析等技术，鉴定类似物化合物。可用计算机程序实施这些技术；例如Rein，Computer-AssistedModeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss，New York，1989)。

迄今已知，新发现的mam-aGF常规地(正常地，天然地)存在于健康组织中，如视网膜，内皮细胞，神经组织和睾丸。

在导致本发明的试验的过程中，显然地，几种肿瘤组织中的mam-aGF以高代谢回转进行。在这些肿瘤细胞中，检测到了TKTL1酶的过表达，和大量乳酸，导致基质降解。这些发现证实了Warburg的研究，他发现，不仅在缺氧的情况下，而且在有氧存在下，肿瘤组织会将葡萄糖降解成乳酸，有氧发酵葡萄糖降解(需氧糖酵解)、乳酸产生程度与恶性肿瘤之间存在关联。通过对3个TKT家族成员的基于转录物和蛋白的分析，可以证实，TKTL1基因是在肿瘤中过表达的转酮酶基因/蛋白。

因此本发明也包含，治疗需要这样的治疗的患者中与肿瘤细胞中TKTL1酶过表达有关的癌症的方法，其包含，给所述患者施用有效量的至少一种TKTL1抑制剂。

换而言之：因此本发明也涉及至少一种TKTL1抑制剂在生产药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗与肿瘤细胞中TKTL1酶过表达有关的癌症。

由于已知大量乳酸导致基质降解，且这会促进组织重建和伤口愈合，在导致本发明的试验的过程中得到的数据和知识产生了本发明的另一部分，即治疗需要这样的治疗的患者的组织重建、伤口愈合等(或影响其过程)的方法，其包含，给所述患者施用有效量的至少一种TKTL1抑制剂或TKTL1激活剂。

换而言之：本发明也涉及至少一种TKTL1抑制剂或TKTL1激活剂在生产药物组合物中的应用，所述药物组合物用于增强或减低组织重建、伤口愈合等的过程。

包含至少一种TKTL1抑制剂的这种药物组合物的一个实施方案意在应用于心脏瓣膜再狭窄中，以预防内皮细胞的增殖。

多年来，已经将转酮酶蛋白和转酮酶酶活性与神经变性疾病相关联，如韦尼克-科尔萨科夫综合征，阿尔茨海默病患者，等。但是，在完成本发明之前，该关联是怎样的这一问题始终没有答案。

在导致本发明的试验的过程中发现，阿尔茨海默病患者和韦尼克-科尔萨科夫综合征患者都具有降低的TKTL1酶活性、和具有不同的等电点或更小的大小的TKTL1蛋白变体。在韦尼克-科尔萨科夫综合征患者中，可以证实他们的细胞确实携带具有降低的硫胺亲和力的TKTL1蛋白同种型。由于糖化(例如葡萄糖共价结合蛋白-该化学反应称作希夫碱反应)是参与导致神经变性疾病的淀粉状蛋白产生和蛋白斑产生的过程(例如：存在于阿尔茨海默病患者中的原纤维与糖化蛋白共有几种性质，糖化造成从折叠的、可溶形式向β-原纤维的结构转换)之一，降低的TKTL1酶活性导致糖化的增强，最终导致增强的淀粉状蛋白产生和蛋白斑产生。

由于这些事实，本发明也包含，在需要这样的治疗的患者中通过激活mam-aGF来抑制糖化，治疗神经变性疾病如韦尼克-科尔萨科夫综合征、阿尔茨海默病等的方法，其包含，给所述患者施用有效量的TKTL1酶活性的至少一种激活剂(例如硫胺或苯磷硫胺用于食品中)。

而且，增强TKTL1活性和从而增强mam-aGF，可以预防阿尔茨海默病在由于TKTL1而具有发病倾向的个体中发生。因而，本发明还包含，确定具有TKTL1倾向性变体的个体的方法，以鉴别适合预防性TKTL1治疗的个体。

在本上下文中，应当指出，通过用根据本发明的方法鉴别出的激活化合物处理TKTL1，可以减少或阻止细胞(如神经元)中的不希望的细胞凋亡。

就糖尿病患者而言，最近已经显示，对这样的患者的苯磷硫胺治疗，可实现对高血糖损害的3个主要途径的阻断，并预防糖尿病性视网膜病变。现在，在导致本发明的试验的过程中，发明人能将TKTL1酶鉴别为组织(内皮细胞，视网膜，和神经)中苯磷硫胺治疗的靶物，在这些组织中，糖尿病患者遭受归因于AGE(渐进性糖化终极产物)形成的细胞损害或细胞死亡。

AGE也由细胞内过量的葡萄糖和磷酸丙糖造成。通过激活TKTL1来增强mam-aGF，会导致葡萄糖和磷酸丙糖的降解。

由于这些事实，本发明也包含，治疗需要这样的治疗的患者、尤其是糖尿病患者中的AGE的方法，其包含，给所述患者施用有效量的TKTL1酶活性的至少一种激活剂，优选苯磷硫胺。

在导致本发明的试验的过程中，还发现，降低TKTL1活性可以导致生长迟缓和脂肪组织的优先减少。通过抑制脂肪组织中的TKTL1，可以治疗肥胖。

在过去80年中，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多发性硬化(MS)、纤维肌痛、克罗恩病、肠易激综合征(IBS)等疾病已经稳步增加。靶向TKTL1会导致自身免疫病患者的自身抗体水平的显著降低。

通过下面的实施例和附图，解释本发明。

附图简述

图1：(A)胃和肺腺癌样品和它们的对应正常组织中TKTL1转录物的定量。N-正常样品；T-肿瘤样品；M-标记，显示了100bp和200bp片段。

图2：(A)用TKTL1 cDNA探针分析的来自不同人成年组织的多(A)⁺mRNA的RNA印迹上的人TKTL1基因的表达模式。

(B)源自4种不同肿瘤实体的5个肿瘤细胞系中TKTL1蛋白同种型的表达。

(C)在大肠杆菌中表达的TKTL1全长蛋白。

图3：天然的(A)和重组的(B)TKTL1蛋白的转酮酶活性的测定。

图4：下述组织中的TKTL1蛋白表达：

A-B：胃癌患者1的正常尸体组织；

C-F：胃癌患者1的肿瘤组织；

G-I：胃癌患者2的正常窦组织，

J-N：患者2的胃癌细胞，

O，P：分化不良的胃癌；

Q：结肠癌；

R：浅表膀胱癌；

S，T：侵袭性分化不良膀胱癌。

放大率：G x50；C，H，和J x100；A，B，D，E，I，K，M，O，

和S x200；F，L，N，P，Q，R和T x400.

图5：非侵袭性和侵袭性膀胱癌的TKTL1染色。

图6-8：石蜡包埋切片中TKTL1和磷酸化Akt(ph-Akt)的表达：

A-C：正常的，乳头状(PTC)，滤泡性(FTC)，和未分化的(UTC)甲状腺癌；D：正常和NSLC组织，E：结肠癌；F：正常膀胱；G：前列腺癌。

AEC＝红染；苏木精复染＝蓝染，

黄色箭头指示核ph-AKT染色

图9-10：内皮细胞中TKTL1的表达。

图11-12：神经元细胞中TKTL1的表达。

图13-14：mam-aGF途径的示意图。

图15：包含TKTL1蛋白同种型(箭头A)、DNA酶X和GAPDH的多蛋白复合物的二维(2D)-凝胶电泳。

图16：通过免疫染色鉴别出的高分子量TKTL1蛋白同种型(箭头)的二维凝胶电泳。

图17：(A)TKTL1蛋白同种型和(B)分离的TKTL1蛋白的转酮酶活性的ELISA测定。得到的值：

(A)A1-A5：从健康人的白细胞得到，

(A)A6-A10：从健康人的成纤维细胞得到，

(A)B1-B5：从健康人的血清得到，

(A)B6-B10：从健康人的脑细胞得到，

(A)A11-A12：没有探针材料(背景水平)，

(A)B11-B12：没有探针材料(背景水平)，

(A)C1-C3：从AD患者的白细胞得到，

(A)C4-C6：从AD患者的成纤维细胞得到，

(A)C7-C9：从AD患者的血清得到，

(A)C10-C12：从AD患者的脑细胞得到，

(A)D1-D3：从帕金森病患者的白细胞得到，

(A)D4-D6：从帕金森病患者的成纤维细胞得到，

(A)D7-D9：从帕金森病患者的血清得到，

(A)D10-D12：从帕金森病患者的脑细胞得到，

(A)E1-E3：从亨廷顿病患者的白细胞得到，

(A)E4-E6：从亨廷顿病患者的成纤维细胞得到，

(A)E7-E9：从亨廷顿病患者的血清得到，

(A)E10-E12：从亨廷顿病患者的脑细胞得到，

(A)F1-F3：从SLE患者的白细胞得到，

(A)F4-F6：从SLE患者的成纤维细胞得到，

(A)F7-F9：从SLE患者的血清得到，

(A)F10-F12：从SLE患者的肾细胞得到，

(A)G1-G3：从帕金森病患者的白细胞得到，

(A)G4-G6：从帕金森病患者的成纤维细胞得到，

(A)G7-G9：从帕金森病患者的血清得到，

(A)G10-G12：从帕金森病患者的肾细胞得到，

(A)H1-H3：从II型糖尿病患者的白细胞得到，

(A)H4-H6：从II型糖尿病患者的成纤维细胞得到，

(A)H7-H9：从II型糖尿病患者的血清得到，

(A)H10-H12：从II型糖尿病患者的肾细胞得到，

(B)A1-A5：从健康人的白细胞得到，

(B)A6-A10：从健康人的成纤维细胞得到，

(B)B1-B5：从健康人的血清得到，

(B)B6-B10：从健康人的脑细胞得到，

(B)A11-A12：没有探针材料(背景水平)，

(B)B11-B12：没有探针材料(背景水平)，

(B)C1-C3：从健康人得到，

(B)C4-C6：从健康人的神经元细胞得到，

(B)C7-C9：从健康人的肾细胞得到，

(B)C10-C12：从健康人的结肠细胞得到，

(B)D1-D3：从AD患者的白细胞得到，

(B)D4-D6：从AD患者的成纤维细胞得到，

(B)D7-D9：从AD患者的血清得到，

(B)D10-D12：从AD患者的脑细胞得到，

(B)E1-E3：从帕金森病患者的白细胞得到，

(B)E4-E6：从帕金森病患者的成纤维细胞得到，

(B)E7-E9：从帕金森病患者的血清得到，

(B)E10-E12：从帕金森病患者的脑细胞得到，

(B)F1-F3：从SLE患者的白细胞得到，

(B)F4-F6：从SLE患者的成纤维细胞得到，

(B)F7-F9：从SLE患者的血清得到，

(B)F10-F12：从SLE患者的肾细胞得到，

(B)G4-G6：从多发性硬化患者的成纤维细胞得到，

(B)G7-G9：从多发性硬化患者的血清得到，

(B)G10-G12：从多发性硬化患者的肾细胞得到，

(B)H1-H3：从II型糖尿病患者的白细胞得到，

(B)H4-H6：从II型糖尿病患者的成纤维细胞得到，

(B)H7-H9：从II型糖尿病患者的血清得到，

(B)H10-H12：从II型糖尿病患者的肾细胞得到。

关于实施例的一般信息：

细胞来源和培养

从ATCC得到肺癌细胞系A549，乳腺癌细胞系MCF7，肝癌细胞系HepG2，和结肠癌细胞系HCT116和HT29。在37℃、5％CO₂下，在添加了10％FCS、青霉素和链霉素的RPMI 1640或DMEM(Invitrogen)中培养细胞。

RNA印迹分析

在随机引物反应(Feinberg和Vogelstein，1983)中，用[α-³²P]dATP和[α-³²P]dCTP(3000Ci/mmol)标记来自TKTL1转录物(登记号X91817)的3’非翻译区(残基1627-2368)的DNA探针。在65℃，在0.5M磷酸钠，7％SDS，0.2％牛血清白蛋白，0.2％PEG 6000，0.05％聚乙烯吡咯烷酮360000，0.05％Ficoll 70000和0.5％硫酸葡聚糖中，进行杂交过夜。通过在65℃、在40mM磷酸钠，pH7.2，1％SDS中洗涤60min，去除非特异性地结合的探针。将滤膜暴露于X-射线胶片(Kodak)1-5天。多种人成年组织多(A)⁺RNA RNA印迹购自BDBiosciences Clontech。

蛋白印迹分析

关于蛋白印迹分析，在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，150mM氯化钠，1％NP40，0.5％去氧胆酸钠，0.1％SDS，0.02％叠氮化钠，1mM苯甲磺酰氟)中裂解细胞。将50μg可溶蛋白等分试样装载进每个孔中，在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。为了检测TKTL1-蛋白，以1μg/ml的终浓度使用HRP-偶联的JFC12T10 Mab。用ECL蛋白印迹检测系统(AmershamPharmacia Biotech)观察Mab。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

使用普遍的标准ELISA技术，测定从细胞系亲和纯化的TKTL1蛋白。3种不同的亲和纯化的小鼠IgG单克隆抗-TKTL1抗体(5μg/ml)用于包被ELISA平板。辣根过氧化物酶缀合的抗-TKTL1抗体JFC12T10以5μg/ml用作第二试剂。使用针对TKTL1，DNA酶X，ph-Akt，GAPDH的抗体，从细胞系亲和纯化多蛋白复合物中结合的蛋白。通过ELISA技术，使用例如TKTL1和GAPDH抗体的组合，和TKTL1和DNA酶X抗体的组合，和ph-Akt和DNA酶X抗体的组合，评估与某些特定蛋白的结合。

多蛋白复合物的二维分析

通过高分辨率2D凝胶电泳(8×7cm)，分析样品。对于每个样品，将2.5μg蛋白应用于2块2D凝胶，用银将2D凝胶染色，通过半干电印迹，将第二块凝胶的蛋白转移至PVDF膜，用于免疫染色。

实施例1：用TKTL1 cDNA探针分析的来自不同人成年组织的多(A)⁺mRNA的RNA印迹上的人TKTL1基因的表达模式。

在来自不同人成年组织的多(A)⁺mRNA的RNA印迹上，用TKTL1 cDNA探针分析人TKTL1基因的表达模式。结果如图2(A)所示。检测到1.4，1.9，2.5，和2.7kb的4种转录物。尽管在大多数组织中的主要转录物的大小是2.5kb，在心脏中富含1.4kb小转录物，缺失2.5和2.7kb转录物。转录物的大小kb表示。

实施例2：分离和纯化TKTL1全长蛋白

在大肠杆菌中表达TKTL1全长蛋白，并通过N-末端His-标记，通过亲和纯化进行分离。将1μg亲和纯化的TKTL1蛋白上样到4-20％-梯度SDS凝胶，并用考马斯染色。检测到不同大小的蛋白。最大的蛋白(66kDa)代表N-末端His-标记的全长TKTL1蛋白，而较小的TKTL1蛋白可能是由于在分离操作之前已经存在的C-末端蛋白水解切割。注意到，重组的66kDa His-标记的TKTL1-全长蛋白的迁移指示着75kDa的大小。蛋白标记的大小kDa表示。

实施例3：通过测量TKTL1 mRNA水平，检测组织中TKTL1基因表达水平。

可以在原位染色反应中半定量地分析活组织检查解剖标本中TKTL1基因的mRNA水平。如下进行染色反应：

在最高达100％乙醇的递增乙醇浓度中温育组织解剖标本。蒸发乙醇后，在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6,0)中煮沸解剖标本，预处理该组织。通过混合50μl备用的杂交缓冲液(DAKO A/S，Glostrup，Danmark)和约5-10pmol探针，制备杂交混合物。探针是下述序列的荧光素-标记的寡核苷酸：TCTCATCACAAGCAGCACAGGAC。

实施例4：测定天然的(A)和重组的(B)TKTL1蛋白的转酮酶活性

通过340nm吸光度的增加测得的NADH产生，测定天然的(A)和重组的(B)TKTL1蛋白的双底物和单底物反应。木酮糖-5-磷酸(X5P)和核糖-5-磷酸(R5P)用于测定双底物反应，而单独的X5P用于测定单底物反应。在图3中，显示了产生类似结果的3个独立的酶测定的一个代表。

实施例5：通过ELISA测定TKTL1同种型

TKTL1抗体JFC6T8和JFC5T3的组合，会测定特异性地存在于神经变性疾病患者中的TKTL1蛋白同种型。将抗体JFC6T8和JFC5T3偶联到ELISA平板上，并与来自健康人和患者的样品一起温育。去除非特异性结合的物质后，如上所述测定酶活性。在健康人的样品中得到高酶活性。各结果显示在图17(A)中。

实施例6：通过二维凝胶电泳鉴别高分子量TKTL1蛋白同种型

分离神经变性疾病(AD)患者的高分子量TKTL1蛋白同种型，通过二维凝胶电泳分析，并通过免疫染色进行鉴定。结果如图16所示。

实施例7：含有TKTL1，DNA酶X，和GAPDH的多蛋白复合物

使用偶联到carbo-link上的TKTL1抗体JFC12T10，从人慢性髓细胞性白血病K562细胞亲和纯化含有TKTL1，DNA酶X，和GAPDH的多蛋白复合物。进行该多蛋白复合物的二维(2D)-凝胶电泳。通过免疫染色和序列测定，鉴别出存在于复合物中的TKTL1蛋白同种型(箭头A)和其它蛋白。结果如图15所示。

实施例8：用ELISA测定从健康人和患者来源标本分离的KTL1的转酮酶活性

将TKTL1抗体JFC3T9偶联到ELISA平板上，与来自健康人和患者的样品一起温育。去除非特异性结合的物质后，如上所述测定酶活性。在健康人的样品中得到高酶活性。各结果显示在图17(B)中。

实施例9：用于检测化合物增强或降低TKTL1酶活性的测定

由于TKTL1蛋白同种型代表兼差蛋白，必须使用用于鉴别有活性的小化合物的不同测定。使用重组蛋白同种型或使用从人细胞分离的天然蛋白同种型，可以实现用于检测化合物增强或降低TKTL1酶活性的测定。

(A)提供重组的TKTL1蛋白同种型

这可以通过在大肠杆菌中表达重组TKTL1蛋白同种型来实现。将cDNA序列(登记号BC025382)的TKTL1开放读码框(MADAE...CMLLN)克隆进pDEST17载体(Invitrogen)。在大肠杆菌菌株BL21-AI(Invitrogen)中进行细菌表达，在21℃用0.2％阿拉伯糖诱导表达4h。通过冷冻(干冰，10min)和融化(37℃，5min)3次，在裂解缓冲液(20mM Tris[pH7.5]，5mM咪唑，5mM β-巯基乙醇，500mM NaCl，和1％Triton X-100)中制备粗细胞裂解物。通过在4℃、12.000×g离心细胞裂解物30min，得到可溶蛋白级分。根据生产商的说明书，使用含有200mM咪唑的洗脱缓冲液，用Ni-NTA树脂(Qiagen)纯化His₆-TKTL1蛋白。随后，通过在0.1M Tris(pH 7.5)中透析，去除咪唑和盐。在-20℃，将纯化的酶保藏在40％甘油和0.1％二硫苏糖醇(DTT)中。

(B)提供从人细胞分离的天然蛋白同种型

必须纯化从人细胞系收获的天然TKTL1蛋白和携带TKTL1的蛋白复合物，例如，通过亲和纯化。这可以如下实现：

根据生产商的说明书(carbo-link；Pierce)，将10mg的MAbJFC12T10偶联到2ml carbo-link上。在无血清的培养基(ISF-1，InVivo BioTech Services GmbH)中培养细胞。离心后，将2.2×10⁹细胞沉淀溶于50ml含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的PBS中。使用弗氏细胞压碎器，进行细胞裂解，随后在50.000×g离心。过滤(0.2μm)上清液，在4℃进行上清液向亲和材料的结合过夜(批式)。转移至柱子后，用150mM PBS缓冲液pH7.4进行洗涤操作。为了洗脱柱子结合的蛋白，使用100mM Glycin-HCl pH2.0。使用基于UV 280nm的检测系统，检测到2个蛋白峰，收集，并用Tris pH7.4中和。

酶测试可以用重组的或天然的、亲和纯化的TKTL1蛋白进行。

(C)通过测定双底物转酮酶反应，检测合适化合物

(C-1)在25℃，通过偶联酶测定，测量TKTL1的转酮酶(双底物)活性。通过(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下，添加重组的和天然的TKTL1蛋白，开始反应，并以下述反应次序通过NAD⁺还原速率，用分光光度计测量：木酮糖-5-磷酸(X5P)和核糖-5-磷酸(R5P)＞(TKTL1活性)＞甘油醛-3-磷酸，景天庚酮糖-7-磷酸＞(甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性[GAPDH])＞NAD⁺-＞NADH+H⁺，1，3-磷酸甘油酸。

在下述反应(终浓度)中，测定(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下的转酮酶双底物活性：4mM X5P，4mM R5P，500μM NAD⁺，2mM MgCl₂，200μM硫胺PP，5μg重组的TKTL1蛋白，或4μg天然的TKTL1蛋白，3U GAPDH，0.15mol/l Tris缓冲液pH7.4，反应体积为1ml。通过省略R5P，使用单独的X5P作为底物，测定转酮酶单底物活性。GAPDH购自Sigma。

(C-2)在非限制性偶联酶的条件下，通过使用常规的酶联方法，可以测量(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下的转酮酶活性。通过向100mmol/L Tris-HCl(pH7,5)、10mmol/L核糖-5-磷酸、2mmol/L木酮糖-5-磷酸、1,2mmol/L MgCl₂、0,1mmol/LNADH、2000U/L甘油-3-磷酸脱氢酶和丙糖磷酸异构酶的除酶之外的完全反应混合物中加入转酮酶蛋白，开始反应。反应在37℃进行。在氧化NADH(它与转酮酶活性成正比)之后，监测340nm吸光度的降低。

(C-3)如果使用赤藓糖-4-磷酸(1mM)作为受体，可以测试作为可能的供体的底物(以可变浓度)。在这样的反应中，会产生果糖-6-磷酸。使用葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶和6-磷酸葡萄糖-异构酶，可以将果糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡萄糖酸内酯，导致NADPH的产生。

(C-4)可以使用甲醛(以可变浓度)作为受体，产生二羟基丙酮。接下去的甘油-脱氢酶反应会产生甘油，与NADH的氧化相伴随。

(D)检测单底物转酮酶反应

(D-1)通过NADH的氧化：

在非限制性偶联酶的条件下，通过使用常规的酶联方法，可以测量(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下的转酮酶活性。通过向100mmol/L Tris-HCl(pH7,5)、5mmol/L木酮糖-5-磷酸、1,2mmol/L MgCl₂、3mmol/L磷酸盐、0,1mmol/L NADH、2000U/L甘油-3-磷酸脱氢酶和丙糖磷酸异构酶的除酶之外的完全反应混合物中加入转酮酶蛋白(a)以及测试化合物和(b)在没有测试化合物存在下，开始反应。反应在37℃进行。在氧化NADH(它与转酮酶活性成正比)之后，监测340nm吸光度的降低。

(D-2)通过NAD的还原：

在非限制性偶联酶的条件下，通过使用常规的酶联方法，可以测量(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下的转酮酶活性。通过向100mmol/L Tris-HCl(pH7,5)、5mmol/L木酮糖-5-磷酸、3mmol/L磷酸盐、1,2mmol/L MgCl₂、0,1mmol/L NAD、2000U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶的除酶之外的完全反应混合物中加入转酮酶蛋白(a)以及测试化合物和(b)在没有测试化合物存在下，开始反应。反应在37℃进行。在还原NAD(它与酮酶活性成正比)之后，监测340nm吸光度的增加。另外，可以测量乙酰基-磷酸的产生。

(E)用其它底物测定转酮酶反应

在非限制性偶联酶的条件下，通过使用常规的酶联方法，可以测量(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下的转酮酶活性。通过向100mmol/L Tris-Cl(pH7.5)、5mmol/L乙醛、5mmol/L丙酮酸、1,2mmol/L MgCl₂的除酶之外的完全反应混合物中加入转酮酶蛋白(a)以及测试化合物和(b)在没有测试化合物存在下，开始反应。反应产生3-羟基丁酮(乙偶姻)和CO₂。反应在37℃进行。通过HPLC-色谱测量转酮酶活性。

其它底物可以是：

(a)甲醛和丙酮酸，产生羟基丙酮和CO₂。

(b)甘油醛和丙酮酸，产生1-脱氧木酮糖和CO₂。

(F)基于乳酸生产鉴别TKTL1抑制剂的体内测定

可以测试的细胞系是，例如，成胶质细胞瘤细胞系LN18，结肠癌细胞系HT29，乳腺癌细胞系MCF7。细胞系必须生长在含有2mg/ml葡萄糖的培养基中，(a)在有测试化合物存在下和(b)在没有测试化合物存在下。

葡萄糖消耗和乳酸生产必须测试5天。每天测试培养基中的葡萄糖和乳酸含量。作为另一个对照，可以使用成胶质细胞瘤细胞系LN229，它不会表现出高葡萄糖消耗和高乳酸生产速率。

实施例10：药物候选物的筛选方法

(A)单一化合物测试的测定

在有和没有待测化合物的情况下，培养细胞系(例如如上所述)。作为合成的测试化合物，可以使用例如，硫胺，羟硫胺，对羟基苯基丙酮酸，吡啶硫胺，安普罗铵，2-甲基硫胺，benfooxytiamine，苯磷硫胺，2-甲氧基-对苯醌(2-MBQ)和2，6-二甲氧基-对苯醌(2，6-DMBQ)，金雀异黄素，和黄酮醇例如槲皮素，儿茶素，nitrilosides和花色素苷，或它们的衍生物。

通过取代或添加一个或多个下述基团，可以产生上述化合物的衍生物：

直链和支链(C₁-C₁₂)脂族烷基，其被至少一个选自下述的基团取代：OH，NH₂，SH，CN，CF₃，卤素，CONHR⁵，COOR⁵，OR⁵，SR⁵，SiOR⁵，NHR⁵，脂族(C₃-C₆)环，和芳族(C₃-C₆)环，其中R⁵选自直链和支链(C₁-C₄)烷基，

芳基，

天然的聚合物，合成的聚合物，和共聚物，所述聚合物和共聚物携带至少2个选自下述的基团：羟基，羧基，伯胺，仲胺，叔胺，硫醇，和醛；

氢原子，卤素原子，CF₃，OH，OCF₃，COOH，R⁷，OR₇，和OCOR⁷，其中R⁷选自直链和支链(C₁-C₄)脂族烷基；

单卤化的和多卤化的直链和支链(C₁-C₄)烷基，和芳基，其中所述芳基任选地被至少一个选自下述的基团取代：OH，NH₂，SH，CN，CF₃，卤素，COOH，CONHR⁸，COOR⁸，OR⁸，SR⁸，和NHR⁸，其中R⁸选自直链和支链(C₁-C₁₂)烷基；和

直链和支链(C₁-C₄)烷基，和CF₃。

天然产物或其提取物或级分也可用于鉴别激活或抑制TKTL1酶活性的化合物，例如发酵的麦胚提取物AVEMAR或苹果提取物。对TKTL1特异性的底物或底物类似物，可以用于加速或抑制TKTL1酶活性。对TKTL1蛋白同种型特异性的反应，可以用于抑制或激活TKTL1酶活性。

会抑制TKTL1酶活性的化合物，可以用于预防肥胖。

因而，可以鉴别出会导致减少的葡萄糖消耗或乳酸生成的化合物。这样的化合物可以用于，例如，减肥，减少或抑制精子发生，精子中的乳酸生产(导致在子宫内的基质降解)，从而可以用作避孕药。

另外，可以鉴别出会导致增强的葡萄糖消耗或乳酸生成的化合物。这样的化合物可以用于，例如，加速伤口愈合和骨修复，降低和正常化糖尿病患者的血糖水平，预防或减轻糖尿病患者小血管和大血管的病理改变，减轻糖尿病患者的视网膜病变或神经病变，和抑制或预防神经变性疾病，如阿尔茨海默病，韦尼克-科尔萨科夫综合征，亨廷顿病，和帕金森病。

(B)用于检测影响突变的TKTL1蛋白同种型的蛋白-蛋白相互作用 的化合物的测定

蛋白-蛋白相互作用在调节酶活性和调节细胞功能的信号转导途径中起作用。小分子蛋白-蛋白相互作用抑制剂(SMPII)的数量迅速增加。活细胞持续暴露于许多种来自它们的微环境和大环境的信号。许多这样的信号会被存在于细胞表面上的受体检测到，然后被加工并通过细胞内的信号传递级联转导。因为信号传递级联的最终作用部位经常远离细胞表面，细胞内信号传递途径的一个固有特征是，需要蛋白从细胞内的一个位置转移到另一个位置。这些易位和从而细胞信号传递和反应，关键性地取决于介导蛋白通过细胞内空间易位的蛋白-蛋白相互作用。

作为典型的涉及蛋白易位的信号转导途径的一个实例，描述了参与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径对生长因子(例如胰岛素)的细胞应答的信号传递和蛋白易位步骤。该途径会影响TKTL1，并受TKTL1的影响。

1.胰岛素结合和激活它在细胞表面上的受体。激活后，受体募集衔接蛋白，并激活细胞内信号传递分子，包括PI3K。

2.激活的PI3K会增加脂质磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸盐(PIP3)的质膜浓度。

3.质膜中的PIP3提供蛋白激酶的停泊位点，所述蛋白激酶包括Akt1/PKBa和PDK1；只有当二者都停泊在膜上时，Akt才会被PDK1激活。该易位步骤是Akt激活的绝对要求。

4.一旦被质膜处的PDK1激活，Akt自由扩散回到细胞内部，它在这里可以磷酸化底物，例如转录因子Forkhead(FKHR，FOXOA1).

5.未磷酸化的FKHR通常驻留于核中，它在这里调控参与细胞周期停滞和细胞凋亡的基因。但是，一旦被Akt1磷酸化，FKHR会易位到胞质中，它在这里不再能调控靶基因。

蛋白-蛋白相互作用和易位参与每个这样的步骤，特别对于Akt1和Forkhead。因而，胰岛素与细胞表面受体的结合引发的信号，会通过蛋白易位事件的连续级联，调控参与细胞生长和存活的基因的转录。当认为改变的信号传递反应经常是正常和患病组织的细胞之间的关键区分特征时，其治疗关联变得清楚。

(C)小分子蛋白-蛋白相互作用抑制剂的测定

历史上，大肽和天然产物已经被视作能调控蛋白-蛋白相互作用的主要化合物类别。但是，文献中和来自筛选试验的越来越多的证据表明，小分子也可以调控负责蛋白-蛋白复合物的相互作用。这些化合物可以直接地(通过抑制蛋白-蛋白界面)或间接地(通过结合变构部位和诱导靶蛋白或相关分子的构象变化)起作用。

传统的小分子药物开发主要注意化合物针对纯化的靶物的活性，例如与细胞表面受体的结合，或抑制酶的催化活性。尽管这些方案已经开发了大量有用的药物，它们显然具有局限性。因为细胞内信号传递发生在复杂的网络环境中，有利的是，在活细胞中筛选化合物，以再现药物最终必须作用的途径和网络背景。当用作途径筛选策略的一部分时，基于细胞的易位测定会提供发现和发展全新类别的主要通过调控蛋白相互作用起作用的化合物的机会。

监测靶分子的细胞内行为(而不是纯化的蛋白的结合或催化活性)的基于细胞的测定，现在可以用于发现和表征SMPPII的高通量筛选中。

已知的转酮酶(TKT)基因编码具有酶活性的单一蛋白，然而已经检测到大小不同的TKTL1转录物和蛋白。而且，TKTL1蛋白的一部分存在于细胞核中。因此，一个基因/一种蛋白/一项功能的关系对于TKTL1基因是错误的。已知的转酮酶是携带所有典型的不变的转酮酶氨基酸残基的2个全长蛋白的同源二聚体。转酮酶-样基因编码的TKTL1蛋白同种型会形成TKTL1同源/异源二聚体和TKT/TKTL1(和TKTL2/TKTL1)异源二聚体。TKTL1蛋白同种型(甚至无酶活性的)的表达，会影响作为TKT/TKTL1异源二聚体的一部分的TKT蛋白的酶活性。这也适用于TKTL2/TKTL1异源二聚体。分子开关和质子线使TKT/TKTL1异源二聚体和TKTL1/TKTL1同源和异源二聚体中的活性部位同步化。

存在另一种类型的蛋白相互作用，因为TKTL1蛋白同种型是多蛋白复合物的一部分。TKTL1蛋白结合转酮酶不相关的蛋白，如GAPDH，DNA酶X(DNA登记号X90392；蛋白登记号CAA62037)，(磷酸化的)Akt，组蛋白，组蛋白乙酰化酶，肌动蛋白结合蛋白，和淀粉状蛋白前体蛋白(APP)。多蛋白复合物的每个成员的存在或结合会变化。该变化受到胞质定位的蛋白向核中的易位的影响。一旦到达核，以前的胞质蛋白会发挥与在胞质中的功能不同的功能。我们在凋亡的和肿瘤细胞中，已经检测到DNA酶X从胞质向核中的易位。我们还已经在肿瘤细胞中检测到，ph-Akt从胞质向核中的易位(图6-8)。已经在凋亡的神经元细胞中检测到GAPDH的易位。直接易位进核中的蛋白从胞质结合位点的释放或新合成，产生诱导细胞凋亡的多蛋白复合物。该细胞凋亡是细胞死亡的基础，例如神经变性疾病患者脑中的神经元。在肿瘤细胞中，自杀分子DNA酶X存在于核中(但是不发挥DNA酶活性)，导致肿瘤细胞的细胞凋亡和细胞死亡。相反地，结合该多蛋白复合物，会导致DNA酶X在肿瘤细胞中的灭活。因此阻断细胞凋亡。在神经变性疾病中，DNA酶X，GAPDH和TKTL1会导致本不应当死亡的细胞的细胞凋亡。不希望的细胞凋亡导致严重后果。

使用针对TKTL1，DNA酶X，ph-Akt，和GAPDH的抗体，从细胞系中亲和纯化出多蛋白复合物中的结合蛋白。通过ELISA技术，使用例如TKTL1和GAPDH抗体的组合，TKTL1和DNA酶X抗体的组合，TKTL1和ph-Akt抗体的组合，TKTL1和TKT抗体的组合，TKTL1和TKTL2抗体的组合，评估与某些蛋白的结合。

(D)用于发现和表征影响TKTL1蛋白同种型蛋白-蛋白相互作用 的SMPPII的体内高通量筛选

可以鉴别出影响TKTL1同源/异源二聚体和TKT/TKTL1异源二聚体的产生和与多蛋白复合物的其它蛋白的相互作用的SMPPII。可以鉴别出影响TKTL1蛋白与诸如DNA酶X、GAPDH或淀粉状蛋白β肽(Aβ)等其它蛋白的相互作用的产生的SMPPII。可以鉴别出影响TKTL1蛋白聚集体的产生的SMPPII。

可以鉴别出影响与其它蛋白的蛋白-蛋白相互作用和GAPDH或淀粉状蛋白β肽(Aβ)等蛋白聚集体的随后产生的SMPPII。可以鉴别出影响TKTL1蛋白同种型的易位(例如胞质向核中的易位)的SMPPII。

TKTL1酶的改变的底物特异性和反应方式，可以用于破坏具有增强的TKTL1酶活性的细胞或组织。可以将无毒底物应用于具有增强的TKTL1酶活性的患者。具有增强的TKTL1表达的细胞，携带靶向进行选择性杀死的细胞的基因产物(TKTL1酶)。表现出增强的TKTL1酶活性的那些细胞，会通过使细胞变得对无毒前药或化疗剂敏感，将无毒底物转化成有毒药物，从而消除不希望的细胞。通过在例如食物中施用无毒的前药，可以将这样的杀死不希望的细胞的策略应用于例如上皮细胞(头和颈，食管，胃，结肠和直肠和泌尿道上皮细胞)。

(E)已经检测出导致具有不同的等电性质和降低的对硫胺的亲和 力的TKTL1蛋白同种型的TKTL1基因内突变

通过基于DNA的方法，可以进行鉴别TKTL1基因内的突变的测试。使用对TKTL1蛋白特异性的单克隆抗体，通过分离TKTL1蛋白同种型，可以进行测试。抗体可以结合到微量滴定板上。可以分析血清或其它样品，可以从这些标本分离TKTL1蛋白同种型。可以进行标准化的酶转酮酶测试，以测定转酮酶活性或对硫胺的Km-值。使用该方法，可以在疾病开始之前，鉴别出具有降低的TKTL1活性的个体，所述疾病例如糖尿病，韦尼克-科尔萨科夫综合征，亨廷顿病。那些患者应当用TKTL1激活剂化合物治疗。

可以用细胞进行体内测定，用于筛选会抑制TKTL1蛋白向核中的易位或在核中的聚集的小化合物，这通过例如(体内)免疫组织化学方法来监测。可以分析细胞是否存在携带TKTL1的高分子量复合物，或是否存在具有降低的溶解度的蛋白复合物。上述体内测定也可以使用TKTL1-GFP融合蛋白来进行。

实施例11：通过基于营养物的治疗，控制mam-aGF

本发明的另一个实施方案涉及一种新的治疗方案，它基于TKTL1的表达和其伴随的糖代谢。除了小化合物或抑制性的底物对TKTL1酶活性的抑制以外，通过使用靶向的营养物，也可以用有限的底物利用度抑制TKTL1酶活性。基于靶向的营养物的治疗或预防，包含测定肿瘤或非恶性细胞/组织中的TKTL1酶活性的测定，随后给予特定营养物。

基本营养物组成如下：选择的脂肪酸组合物，优选量为55-65％(w/w)；选择的碳水化合物组合物，优选量为5-15％(w/w)，优选地具有少于2％(w/w)的葡萄糖(或淀粉)含量，优选地主要包含果糖，寡果糖，半乳糖，寡半乳糖；选择的蛋白(氨基酸)组合物，优选量为10-25％(w/w)，优选地具有超过40％(w/w)(赖氨酸，亮氨酸)、优选地超过30％(w/w)(异亮氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸)；生育三烯酸和电子受体或其组合：

优选的实施方案包含：

a)62％脂肪酸组合(参见表1)；

b)12％碳水化合物，具有少于2％葡萄糖(或淀粉)含量，主要由果糖，寡果糖，半乳糖，寡半乳糖组成；

c)18％蛋白，具有超过40％(赖氨酸，亮氨酸)，和超过30％(异亮氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸)

d)生育三烯酸(例如γ-生育三烯酸)

e)至少一种电子受体，例如，对苯醌，苯醌，羟基醌和其衍生物。

与药学上可接受的载体和激活TKTL1酶活性的硫胺或硫胺衍生物(苯磷硫胺等)相组合的基础营养物，可以用于预防或治疗神经变性疾病，糖尿病，糖尿病并发症，代谢综合征，大血管和微血管损伤，老化，视网膜细胞损伤，内皮细胞炎症，中枢和外周神经元细胞损伤，因为在正常(非恶性的)细胞例如，视网膜细胞，中枢和外周神经元，和内皮细胞中，TKTL1活性会保护免于导致AGE或自由基形成的不充分糖代谢的损害作用。

对于癌症治疗，必须调节每天的基础营养物，优选地，达到0.2mg硫胺的最大总量。这可以通过选择低硫胺水平的营养物，通过硫胺酶处理营养物，或通过加热/煮沸营养物，来实现。如果在癌症患者的肿瘤或转移灶中检测到高TKTL1-活性和/或转录物/蛋白浓度，可以给他们施用具有药学上可接受的载体和低水平硫胺的基础营养物，或添加了抑制性硫胺类似物(羟硫胺，oxybenfotiamin等)的具有低水平硫胺的基础营养物。

该营养方案导致对TKTL1酶的抑制，从而减少葡萄糖代谢和抑制肿瘤增殖。

表1：脂肪酸混合物的实例，重量％：

辛酸(C8)           46.6

癸酸(C10)          28.2

亚油酸(ω6-C18:2)  3.6

SDA(ω3-C18:4)     0.2

ETA(ω3-C20:4)     0.3

EPA(ω3-C20:5)     5.7

DPA(ω3-C22:5)     0.9

DHA(ω3-C22:6)     4.9

其它               9.6

总MCFA             74.8

总n-3 PUFA         12.0

总其它             13.2

DHA:EPA            0.86

n-3:n-6            3.1

MCFA＝中链脂肪酸(即具有8-14个碳原子的脂肪酸)，PUFA＝多不饱和脂肪酸(即具有超过一个双键的脂肪酸)

实施例12：检测甲状腺、肺和结肠的癌组织和正常(健康)组织中的TKTL1-蛋白-水平

通过免疫组织化学，分析了甲状腺组织、肺组织和结肠组织的5μm厚的人癌症和正常石蜡切片。将脱蜡切片加热，用于在10mM柠檬酸钠(pH6.0)中抗原暴露，在450W 1分钟，然后在100W 5分钟。在dH₂O中冲洗后，通过与3％-H₂O₂一起温育5min，抑制内源过氧化物酶。然后，将切片暴露于生物素封闭系统(DAKO)10min，以封闭内源的抗生物素蛋白-生物素。在Tris/盐水缓冲液(TBS)中洗涤2次后，将载玻片与1％山羊血清一起温育30min，以阻断非特异性染色。接着，将切片在4℃暴露于小鼠抗-TKTL1(克隆JFC12T10；小鼠IgG2_b)抗体(25g/ml)或抗-Ser473磷酸-Akt(587F11；小鼠IgG2_b；CellSignaling Technology)过夜。然后，在TBS中洗涤载玻片，并与生物素化的抗-小鼠免疫球蛋白一起在室温温育30min，用链霉抗生物素-过氧化物酶(DAKO)处理。使用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物，显示染色。使用苏木精水溶液进行细胞核复染色。

在图6，7和8中显示了该免疫组织化学染色的结果。对于每种癌症类型，显示了3个独立试验的一个代表。TKTL1和磷酸化的Akt在甲状腺癌组织中高度表达。非小细胞肺癌(NSLC)和结肠癌表达高水平的TKTL1和磷酸化的Akt。

实施例13：检测胃癌患者、结肠癌患者和非侵袭性和侵袭性膀胱癌患者的肿瘤中的TKTL1-蛋白-水平

检测了3个胃癌患者(图4A-P)、1个结肠癌患者(图4Q)、1个非侵袭性膀胱癌患者(图4R)和1个侵袭性膀胱癌患者(图4S-T)的肿瘤中的TKTL1蛋白表达，并与对应的正常组织相对比。

在单克隆抗-TKTL1抗体的辅助下，进行TkTL1蛋白测定。用二氨基联苯四氢氯化物(DAB；褐染)揭示了抗-TKTL1抗体。用苏木精(蓝染)进行复染色。

胃癌患者1的标本揭示了肿瘤组织中TKTL1的强胞质表达，但是在周围间质细胞中不表达(图4C-F)。注意到肿瘤细胞中的异源表达(图4E-F)，对应的正常组织没有表现出TKTL1的表达(图4A-B)。

胃癌患者2的标本揭示了肿瘤细胞中的强胞质表达(图4J-N)，和肿瘤细胞中的异源表达(图4L)。对应的正常窦组织没有表现出TKTL1的表达(图4G-I)。

胃癌患者3的标本揭示了分化不良的胃癌中的核表达(图4O-P)。

结肠癌患者的标本揭示了胞质染色(图4Q)。

浅表膀胱癌患者的标本揭示了无TKTL1表达(图4R)。

侵袭性分化不良膀胱癌患者的标本揭示了强胞质表达(图4S-T)。

在图5中显示了非侵袭性和侵袭性膀胱癌组织的对比。非侵袭性膀胱癌组织表现出无染色或仅仅少量的染色，这表明无TKTL1表达，而侵袭性膀胱癌组织表现出强染色，指示TKTL1的强表达。

实施例14：源自4种不同肿瘤实体的5个肿瘤细胞系中的TKTL1蛋白同种型的表达

使用特异性地检测TKTL1蛋白同种型且不与其它转酮酶家族成员反应的Mab，检测源自4种不同肿瘤实体的5个肿瘤细胞系中的TKTL1蛋白同种型的表达。结果如图2(B)所示。每个细胞系都表现出独特的TKTL1蛋白同种型表达模式。以kDa为单位，指示分子量标准。

实施例15：TKTL1和磷酸化的Akt(ph-Akt)在癌和正常组织中的表达

用抗-TKTL1或抗-ph-Akt，对正常的、乳头状(PTC)、滤泡性(FTC)和未分化的(UTC)甲状腺癌(图6A-C)、正常和NSLC组织(图7D)、结肠癌(图7E)和正常或膀胱和前列腺癌(图8F-G)的石蜡包埋切片，进行TKTL1或ph-Akt的免疫组织化学分析。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC；红染)揭示抗-TKTL1或抗-ph-Akt。用苏木精(蓝染)进行复染色。使用同种型匹配的IgG作为阴性对照。

TKTL1主要定位于胞质内，但是在一小组肿瘤中也鉴别出了核染色。磷酸化的Akt定位于胞质和/或核内。

实施例16：检测胃癌患者、结肠癌患者、非侵袭性膀胱癌患者和侵袭性膀胱癌患者的TKTL1-水平

将3μm厚石蜡切片加热，用于抗原暴露，在10mM柠檬酸钠(pH6.0)中在900W 5分钟，在dH₂O中在900W 5分钟，在10mM柠檬酸钠(pH6.0)中在900W 5分钟。在磷酸盐/盐水缓冲液(PBS)中洗涤后，如上所述抑制内源过氧化物酶。然后，将切片暴露于生物素-抗生物素蛋白封闭缓冲液(Vector Laboratories)15min。用如上所述的山羊血清阻断非特异性的染色。用抗生物素蛋白-生物素化的辣根过氧化物酶复合物(ABC)和二氨基联苯四氢氯化物(DAB)(Elite kit；VectorLaboratories)，显现观察一抗，并用Mayer′s苏木精复染色。

在图4，5，和9-16中显示了免疫组织化学染色的结果。

实施例17：定量胃和肺腺癌样品和它们的对应正常组织中的TKTL1转录物

将15μl实时PCR反应物上样到3％-琼脂糖凝胶上，以观察150bpTKTL1扩增产物。在实时数据的基础上，已经计算了肿瘤和对应正常组织之间的表达差异，并显示为肿瘤样品相对于对应正常样品的倍数诱导。(B)肺腺癌和对应正常样品中的TKT，TKTL1，TKTL2，和β-肌动蛋白基因的实时转录物定量。对β-肌动蛋白观察到最高表达水平。在转酮酶基因家族内，TKT基因表现出最高的表达水平。正常肺中的TKTL1和TKTL2表达水平低于TKT和β-肌动蛋白的水平。与此相反，肺腺癌中TKTL1的表达水平比对应正常组织高60-倍。

实施例18：神经变性疾病的诊断

通过ELISA、电聚焦凝胶分析、二维凝胶电泳和免疫染色，分析来自健康受试者和阿尔茨海默病或其它神经变性疾病患者的成纤维细胞细胞系、包皮成纤维细胞或白细胞中的TKTL1异常。通过不同的ELISA方案，进行ELISA试验。一类ELISA代表典型的ELISA，其中捕获或检测抗体是针对某种蛋白。使用的另一类ELISA包含针对一种蛋白的抗体和针对另一种蛋白的抗体。第1类ELISA的实例是TKTL1抗体JFC12T10和TKTL1抗体JFC10T9的组合。JFC12T10会检测TKTL1蛋白的表位，不与TKT或TKTL2交叉反应。JFC10T9会检测TKTL1的另一个表位。使用ELISA JFC12T10/JFC10T9，可以检测和测量TKTL1蛋白。第2类ELISA的实例是针对TKTL1的抗体JFC12T10和针对DNA酶X的抗体JFC11D8。使用该ELISA，可以检测TKTL1和DNA酶X的蛋白相互作用。两类ELISA反应都用来自健康人和患者的样品进行。一类样品包含体液，如血清，并直接分析蛋白和蛋白相互作用的存在。使用偶联到carbo-link上的抗体(例如JFC12T10或JFC11D8)进行另一类分析。使用亲和纯化方法，我们分离了细胞(源自细胞培养物或天然组织)的多蛋白复合物。通过电聚焦或二维凝胶电泳，随后进行免疫染色或酶活性测定(例如转酮酶双或单底物反应；DNA酶测试，GAPDH活性)，分析多蛋白复合物。使用这些测定，可以鉴别特异性地存在于神经变性疾病(如AD)患者中的蛋白同种型。在神经变性疾病(如AD)患者中，已经检测到具有高碱性pI、低双或单底物反应、和低硫胺亲和力的TKTL1变体。另外，使用标准的PAGE，与健康人相比，在来自那些患者的完整细胞或细胞提取物中，检测到与全长TKTL1相比较小的蛋白同种型和更大量较小的蛋白。另外，已经在以后(数月和数年后)表现出神经变性疾病(如AD)的健康人中，观察到TKTL1的降低的双或单底物反应，或TKTL1的较低的硫胺亲和力。观察到的TKTL1变体导致细胞中降低的糖代谢。这些降低的糖代谢导致增强的AGE形成，且AGE形成导致高分子蛋白聚集体和细胞死亡。这种适当脑功能必需的细胞的不希望死亡，是这些神经变性疾病的重要原因。为了鉴别包含具有降低的双或单底物反应或较低的硫胺亲和力的TKTL1变体的个体，制备了可以用于从待测样品中分离TKTL1蛋白的TKTL1抗体(例如JFC12T10)。这些样品可以是体液(例如血清)或细胞样品(例如成纤维细胞或白细胞的蛋白)。偶联到ELISA平板上的TKTL1抗体会捕获TKTL1蛋白，洗掉TKT和TKTL2蛋白后，可以在偶联酶反应中酶法检测(转)酮酶双或单底物反应，例如通过还原的NADH的构建(酶测定如上所述)。类似地，用不同浓度的硫胺，进行酶反应。通过降低测定中的硫胺水平，在神经变性疾病患者中鉴别出具有降低的硫胺亲和力的TKTL1变体。使用该ELISA方案和酶分析，可以在出现神经变性疾病迹象之前的时间点，鉴别出易患神经变性疾病的TKTL1变体。这可以用于预防神经变性疾病，例如通过应用更易溶的硫胺衍生物(如苯磷硫胺)或具有降低水平的糖或某些类型的糖(例如葡萄糖)的饮食。除了鉴别具有降低的双或单底物反应或较低的硫胺亲和力的TKTL1变体以外，在神经变性疾病(如AD)患者中鉴别出具有降低的溶解度的TKTL1变体或存在于高分子量复合物中的TKTL1变体。发明人制备了TKTL1特异性的抗体，其与存在于神经变性疾病(如AD)患者细胞核中的高分子量复合物中的TKTL1变体特异性地反应(JFC7T4)。使用ELISA反应或免疫组织化学染色，可以在体液(例如血清)或组织样品(例如白细胞，成纤维细胞，活组织检查)中鉴别那些疾病特异性的TKTL1变体。另外，与针对存在于那些多蛋白复合物中的其它蛋白的抗体相组合，可以进行ELISA来检测蛋白相互作用的存在。这样的包含TKTL1抗体JFC8T7和DNA酶X抗体JFC7D4的第2类ELISA，鉴别出对进入细胞凋亡的细胞特异性的TKTL1和DNA酶X的蛋白相互作用。包含TKTL1抗体JFC8T7和GAPDH抗体JFC3G6的另一种第2类ELISA，鉴别对进入细胞凋亡的细胞特异性的TKTL1和GAPDH的蛋白相互作用。这些蛋白复合物的存在，可以用于检测和治疗神经变性疾病。TKTL1和其它蛋白(如GAPDH、DNA酶X和ph-Akt)之间的这种蛋白相互作用的鉴别，可以用于分离抗细胞凋亡的化合物。那些化合物可以用作治疗神经变性疾病的药剂。通过亲和标记，和例如通过BIAcore技术，可以鉴别特异性地结合TKTL1的化合物。使用减少的程序性细胞死亡(通过例如细胞凋亡梯、胱天蛋白酶-3、膜联蛋白观察)，可以检测抗细胞凋亡作用。TKTL1和GAPDH彼此紧密地结合。剪切X5P等糖的TKTL1(转)酮酶反应，会导致GAP的生成。由于GAPDH紧密结合TKTL1，生成的GAP从GAPDH直接使用，导致生成1，3-磷酸甘油酸，同时将NAD⁺还原为NADH+H⁺。为了分离抑制TKTL1和GAPDH相互作用的小化合物，应当使用不同的NAD⁺浓度，因为有些化合物的结合依赖于NAD⁺的浓度。使用抗体JFC12T10作为唯一抗体，检测另一类蛋白相互作用。如果TKTL1蛋白作为单一蛋白存在，如果仅仅一种抗体用作捕获和检测抗体，ELISA反应不应生效。在TKTL1的情况下，抗体JFC12T10可以用作捕获和检测抗体。因此，使用该抗体，可以检测TKTL1和另一种TKTL1蛋白的蛋白相互作用。由于有些TKTL1蛋白同种型缺少N-末端蛋白序列，可以将由TKTL1和TKTL1组成的二聚体区分成同源和异源TKTL1-二聚体。有些二聚体由与另一全长TKTL1蛋白结合的全长TKTL1蛋白组成(TKTL1同源二聚体)。有些二聚体由全长TKTL1蛋白和缺少N-末端的较小的TKTL1同种型组成。使用定位于TKTL1蛋白内的不同部位的TKTL1抗体，可以进行区分。例如，N-末端定位的TKTL1抗体可以与C-末端定位的抗体一起使用，可以将该ELISA的结果与仅仅使用C-末端定位的抗体的ELISA相比较。这两种ELISA结果之间的比，可以用于鉴别患者，和用于鉴别以后会发生TKTL1-相关疾病的健康人。(也参见图11-12)

实施例19：TKTL1在内皮细胞中的表达

大多数正常组织和细胞都不显示TKTL1表达。在视网膜、内皮细胞和神经元细胞中，存在TKTL1的表达。视网膜、内皮细胞和神经元细胞会受到高葡萄糖水平的损害。如图9和图10所示，TKTL1蛋白在内皮细胞(和视网膜，和神经元细胞；未显示)的细胞核和/或胞质中表达。

Claims (18)

1.定性和定量检测哺乳动物个体(患者)中哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径(mam-aGF)的使用程度和正确过程流的方法，其特征在于

(a)酶TKTL1用作指示剂和靶分子，和

(b)所述方法包括下述步骤：

-采集所述个体(患者)的生物样品，

-测定所述个体(患者)样品和对照样品中TKTL1蛋白的活性和/或浓度，和/或细胞定位和/或聚集状态和/或二聚化状态，

-将从所述个体(患者)样品得到的测定数据与从对照样品得到的数据进行对比，

-和(i)将所述个体样品与对照样品相比TKTL1蛋白的增强的或降低的活性和/或浓度水平，分别作为哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径的增强的或降低的使用程度的指示，

(ii)将所述个体样品与对照样品相比TKTL1蛋白的异常的细胞定位和/或异常的聚集状态和/或异常的二聚化状态，作为异常的哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径的指示。

2.权利要求1的方法，其中所述方法是检测和监测与增强的或降低的和/或异常的哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径有关的疾病的方法。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，它用于体内或体外分子成像方法的过程中。

4.根据权利要求1-3中的任一项的方法，其中所述生物样品是组织样品，活组织检查，体液，分泌物，涂片，血清，尿，精液，粪便，胆汁，含有细胞的液体，裂解的细胞，细胞碎片，肽或核酸。

5.根据权利要求4的方法，其中步骤(b)中的测定在蛋白水平进行，即使用TKTL1蛋白或TKTL1蛋白片段作为靶物。

6.根据权利要求5的方法，其中使用特异性地结合TKTL1蛋白的分子，进行在蛋白水平的步骤(b)中的测定。

7.根据权利要求6的方法，其中所述分子是针对TKTL1的抗体或这样的抗-TKTL1-抗体的片段或包含抗原结合表位的肽模拟物或小抗体。

8.根据权利要求4的方法，其中步骤(b)中的测定在核酸水平进行，即使用TKTL1基因或TKTL1 mRNA或其片段作为靶物。

9.根据权利要求8的方法，其中使用至少一种能与TKTL1基因或TKTL1 mRNA杂交的核酸探针来进行测定。

10.根据权利要求8或9的方法，其中使用包含TKTL1核酸或其片段的嵌合核酸来进行测定。

11.在需要这种控制的哺乳动物个体(患者)中控制哺乳动物需氧葡萄糖发酵代谢途径的方法，其中所述控制包含，施用有效量的酶TKTL1活性或浓度的至少一种抑制剂或激活剂。

12.药物组合物，其包含有效量的酶TKTL 1活性或浓度的抑制剂或激活剂和药学上可接受的载体.

13.根据权利要求12的药物组合物，其中所述抑制剂选自：羟基硫胺，benfooxytiamine(＝oxybenfotiamin)，羟基丙酮酸，丙酮酸，对羟基苯基丙酮酸，吡啶硫胺，安普罗铵，2-甲基硫胺，2-甲氧基-对苯醌(2-MBQ)和2，6-二甲氧基-对苯醌(2，6-DMBQ)，金雀异黄素，和黄酮醇例如槲皮素，儿茶素，nitrilosides，花色素苷；或其衍生物。

14.根据权利要求12的药物组合物，其中所述激活剂是硫胺或苯磷硫胺或其功能等同的衍生物。

15.用于预防或治疗与突变的TKTL1蛋白的异常细胞定位、聚集状态和/或二聚化状态(与对照contraception相比)有关的疾病的药物组合物，其包含有效量的核酸分子、重组载体、多肽、反义RNA序列、核酶或抗体。

16.营养组合物或食品添加物，其包含有效量的酶TKTL1活性或浓度的抑制剂或激活剂和药学上可接受的载体。

17.根据权利要求16的营养组合物/食品添加物，其中所述抑制剂选自：羟基硫胺，benfooxytiamine(＝oxybenfotiamin)，羟基丙酮酸，丙酮酸，对羟基苯基丙酮酸，吡啶硫胺，安普罗铵，2-甲基硫胺，2-甲氧基-对苯醌(2-MBQ)和2，6-二甲氧基-对苯醌(2，6-DMBQ)，金雀异黄素，和黄酮醇例如槲皮素，儿茶素，nitrilosides，花色素苷；或其衍生物。

18.根据权利要求16的营养组合物/食品添加物，其中所述激活剂是硫胺或苯磷硫胺或其衍生物。

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