CN107677821A - 一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤抗原水平检测领域，具体而言，涉及一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒及其检测方法。一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒，包括抗体一以及显示所述抗体一的物质，和/或抗体二以及显示所述抗体二的物质；抗体一的抗原为TKTL1，抗体二的抗原为DNASE1L1；液相芯片试剂盒还包括微球。本发明还提供了一种肿瘤抗原的检测方法，采用液相芯片技术检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1来获知肿瘤抗原的信息。本发明采用液相芯片技术进行检测，只需要使用微量的样品，在较短的时间内，就可以得到所需的数据，同时灵敏度和可靠性更好，操作更为简单。

Description

一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及肿瘤抗原水平检测领域，具体而言，涉及一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒及其检测方法。
背景技术
单核/巨噬细胞是人类免疫系统细胞的重要组成部分。人类外周血细胞可以主要分为无核细胞(主要为血红细胞)和有核细胞(白细胞等)。单核细胞约占有核细胞总数的5％左右，由髓系造血祖细胞分化而来，是免疫系统中抗原递呈细胞(APC细胞)的重要组分。其在人体循环系统内成熟分化并实现免疫学功能可以大致分为以下步骤：毛细血管中的单核细胞→透过血管壁进入血管外组织→发现异源性物质(细菌、病原体、肿瘤细胞等)，分化为成熟的巨噬细胞→吞噬并消化，将抗原递呈到特定的细胞表面分子上→经由淋巴管回流到外周血→完成抗原递呈激活杀伤性免疫细胞。作为机体抗击外来病原侵袭和清楚自身非正常细胞机制的哨兵，巨噬细胞是免疫系统形成免疫应答的重要环节，作用重大。在正常人体内每时每刻都有向着肿瘤化(永生化、非正常凋亡)发展的细胞产生，正常的机体免疫机制可以通过上述过程，将其及时清除。但随着肿瘤细胞的演化，生成了躲避免疫杀伤的机制，或者机体总体免疫力的下降，形成免疫逃逸，最终在患者体内形成肿瘤包块。由此可见无论健康人群还是癌症患者体内巨噬细胞对于肿瘤化细胞的吞噬作用，都是无时无刻不在进行的。针对单核/巨噬细胞内肿瘤来源物质(包括蛋白质、核算、脂类等)的观测，可以为我们提供一个监控体内肿瘤发生、发展的崭新视角，其应用前景必然非常广泛。
单核/巨噬细胞作为有核细胞的重要组分，现有技术一般是通过其表面抗原分子CD14和CD16进行检测的，目前可以买到成熟的抗体。主要的临床应用集中在血细胞组成检测和造血系统肿瘤(如：粒/单核细胞性白血病)方面的检测中，为临床诊断提供重要参考。就目前专利和文献检索来看，将肿瘤抗原与实体肿瘤的监控联系还有待进一步研究。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒，该试剂盒采用液相芯片技术针对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平。
本发明的第二目的在于提供一种肿瘤抗原的检测方法，该方法采用液相芯片技术进行检测，只需要使用微量的样品，在较短的时间内，就可以得到所需的数据，同时灵敏度和可靠性更好，操作更为简单。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒，包括抗体一以及显示所述抗体一的物质，
和/或
抗体二以及显示所述抗体二的物质；
所述抗体一的抗原为TKTL1，所述抗体二的抗原为DNASE1L1；
所述液相芯片试剂盒还包括微球。
肿瘤细胞与正常体细胞的差异，最主要在两个方面：
1.物质代谢：肿瘤细胞由于其增殖快并且不受正常细胞周期调控，往往表现出对能量物质(葡萄糖等)的饥渴式的需求，但由于其代谢机制的变异，物质代谢特别是能量代谢效率往往远低于正常体细胞，例如，不能对葡萄糖进行完全有效的代谢利用，而是一种浪费式的消耗。而肿瘤细胞在此代谢过程中所需要的酶类物质，其表达量与正常体细胞也存在巨大的差异，可以将其作为肿瘤细胞检测的突破点。
2.细胞凋亡：肿瘤细胞区别于正常体细胞的另一个特点就是永生化，肿瘤细胞是不受正常细胞周期调控的。细胞凋亡机制已经有了较为清晰的研究，肿瘤细胞不凋亡，那必然导致调控细胞凋亡或者在细胞凋亡过程中起到关键作用的因子、信号物质或者酶的表达量出现明显异常，这同样可以作为肿瘤细胞检测的突破点。
TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)分别对应于以上两点，其在巨噬细胞内的降解产物是本发明检测技术的两个目标被检物，简要介绍如下：
TKTL1：主要调节糖代谢途径中的非氧化途径，在多种肿瘤中高表达，其表达量与肿瘤的发展阶段、侵袭和转移以及预后有密切关系。对肿瘤患者的营养搭配及后续的治疗等方面有着重要的提示作用。
DNASE1L1：在细胞凋亡过程中起重要作用，但在肿瘤细胞中，正常的凋亡机制失效，DNASE1L1活性受到抑制，但其大量表达并在肿瘤细胞中积累。其表达量可作为鉴别肿瘤细胞或凋亡机制异常细胞的指标。
本发明针对TKTL1和DNASE1L1采用液相芯片技术进行检测，来判断血液中肿瘤抗原的水平。
进一步地，，所述显示所述抗体一的物质为标记在所述抗体一上的荧光标记，所述显示所述抗体二的物质为标记在所述抗体二上的荧光标记；
或者
所述抗体一为两种不同种属来源的抗体一，所述显示所述抗体一的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体一配对的二抗；所述抗体二为两种不同种属来源的抗体二，所述显示所述抗体二的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体二配对的二抗。
其中，抗体一的二抗和抗体二的二抗可以为相同也可以为不同。
进一步地，抗体一为anti-TKTL1，所述抗体二为anti-DNASE1L1。
anti-TKTL1与anti-DNASE1L1为市售产品，这两种抗体可以产自各种动物，如常用的小鼠、大鼠、兔子、猴子等等。如anti-TKTL1可以购买自sigma，货号HPA000505，rabbitpolyclonal；anti-DNASE1L1可以购买自sigma，货号HPA072635，rabbit polyclonal；相应地，二抗可以为购买自abcam驴抗兔的PE多克隆抗体，其货号为ab7007。
如上述的一样，本发明中也可以省略掉二抗，这通过将anti-TKTL1和anti-DNASE1L1进行荧光标记实现。
进一步地，所述液相芯片试剂盒还包括裂解液A、裂解液B、包被缓冲液、封闭液、细胞洗涤缓冲液中的任意一种或几种；
所述裂解液A含有以下浓度的各成分：
10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.4-7.6)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
所述裂解液B含有以下浓度的各成分：
150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mMHEPES以及10％±0.5％甘油；
所述包被缓冲液为EDC和S-NHS的混合溶液，在所述包被缓冲液中，EDC的浓度为45-55mg/ml，S-NHS的浓度为45-55mg/ml；
所述封闭液为含有体积百分数为0.8％-1.2％BSA的PBS。
进一步地，所述荧光标记为PE、CY5、CY7、per-CP以及TRITC中的任一种。
荧光标记是为了定量相应的抗体的含量。
优选地，所述微球为微米级微球。所用的微球的直径一般在3-10μm。
进一步地，所述微球为聚苯乙烯荧光微球。该微球为一种市售产品，如购买BIO-PLEX公司大小为5.5μm的荧光微球，微球还可为购自Luminex公司的MultiAnalyte微球和SeroMap微球，等等。
本发明还提供了一种肿瘤抗原的检测方法，采用上述的液相芯片试剂盒检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1来获知肿瘤抗原的信息。
该方法采用液相芯片技术进行检测，只需要使用微量的样品，在较短的时间内，就可以得到所需的数据，同时灵敏度和可靠性更好，操作更为简单。
进一步地，所述白细胞裂解物通过以下方法制备：
取血液样品，采用所述的裂解液A裂解红细胞，去除除白细胞外的所有成分；
得到的白细胞采用所述的裂解液B进行裂解，得到白细胞裂解物。
本发明通过将血液样品的红细胞裂解，进而去除除白细胞外的所有成分，得到白细胞，此处所述的去除除白细胞外的所有成分也只是尽量去除。得到的白细胞裂解得到待测物。白细胞可以吞噬肿瘤细胞，通过对血液中的白细胞裂解物进行特异性检测，增加检测的准确性和特异性。
优选地，所述裂解液A与所述血液样品的体积比为15-20:1，裂解的时间为10-20min。
经验证，裂解液A能特异性将红细胞裂解，为红细胞的去除提供良好的基础。通过在血液中添加特定比例的裂解液A，并限定特定的裂解时间，以充分的将红细胞进行裂解。
进一步地，采用离心的方式去除除白细胞外的所有成分，所述离心的条件为：750-850g，4-6min，离心后去除上清即可。
该步骤根据裂解后的成分与未裂解的白细胞的沉降度不同而进行分离。经试验，上述离心的条件能达到更好的分离效果。
为了使得到的白细胞的纯度更好，去除血液中其他残留的成分，优选地，离心后得到的沉淀采用PBS洗涤2-3次。
进一步地，所述裂解液B与所述血液样品的体积比为4-6:1，裂解的时间为8-15min。
经验证，裂解液B能将白细胞裂解，为获得白细胞的裂解物提供良好的基础。通过添加特定比例的裂解液B，并限定特定的裂解时间，以充分的将白细胞裂解。
进一步地，所述的液相芯片试剂盒检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1的具体步骤如下：
(a)、所述微球采用所述包被缓冲液活化后，将所述抗体一和所述抗体二分别包被在所述微球上，分别得到抗体一包被的微球和抗体二包被的微球，采用上述的封闭液进行封闭处理；
(b)、所述白细胞裂解物分别与抗体一包被的微球和抗体二包被的微球混合，孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(c)、在对应的微球反应体系中加入带有荧光标记的抗体一或带有荧光标记的抗体二，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
或者
在对应的微球反应体系中加入与步骤(a)不同种属来源的抗体一或与步骤(a)不同种属来源的抗体二，孵育后，用PBS缓冲液洗涤，然后在相应的微球反应体系中加入带有荧光标记的相应的抗体一的二抗或带有荧光标记的相应的抗体二的二抗，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(d)、采用多功能液相芯片分析平台进行检测即可。
当检测涉及到二抗的时候，为了防止二抗与步骤(a)中的抗体结合，首先进行了封闭处理，然后将两次使用的抗体一和抗体二选用不同种属来源的抗体，很好了保证了检测的准确性和稳定性。
其中，步骤(a)中，在抗体一包被在所述微球上的反应体系中，抗体一的含量为50-120μg/mL；
在抗体二包被在所述微球上的反应体系中，抗体二的含量为50-120μg/mL。
需要说明的是，抗体偶联微球所用的抗体中不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它含自由氨基的添加物，并且已溶在PBS，pH7.4中，测定抗体浓度后直接用于偶联；若抗体含有以上任何一种添加物，需要进行如下处理：使用Micro Bio-Spin 6微型柱进行更换缓冲液，1000g，2min离心去除缓冲液；加入500μl PBS，1000g，2min离心，重复5次；20－75μl的抗体上样到柱子中，1000g，5min离心，抗体冰浴，测定抗体浓度后可直接用于偶联。
在步骤(b)中，白细胞裂解物的添加量一般为：将得到的白细胞裂解物稀释8-15倍，然后与抗体包被的微球按体积比1:0.5-1.5添加。
在步骤(c)中添加的带有荧光或者不带有荧光的抗体一和抗体二依赖于步骤(b)中添加的抗原，为了充分的抗原与抗体结合，步骤(c)中添加的抗体一和抗体二稍微过量，过量的抗体经过洗涤去除，添加后，抗体一和抗体二的浓度均为0.08-0.15μg/mL。
同样地，二抗的添加量则根据步骤(c)中的一抗的添加量。优选地，在步骤(c)中，带有荧光标记的抗体一的二抗和带有荧光标记的抗体二的二抗的终浓度均为0.08-0.15μg/mL。
本发明在检测白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1的同时还以细胞内参GAPDH做对照，目的蛋白检测值与内参的比值即为GCI指数，通过引入细胞内参，来控制检测过程中的误差，从而增加检测的准确度。
需要说明的是，本发明白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1在整个检测过程中分别进行检测。另外，多功能液相芯片分析平台检测所用的波长根据一抗或二抗标记的荧光种类选择。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒，该试剂盒采用液相芯片技术针对血液中的TKTL1(转酮酶-样1)和DNASE1L1(脱氧核糖核酸酶1-样1)进行检测，进而获知血液中肿瘤抗原的水平，可应用于体检，为肿瘤患者提供预警。
(2)本发明还提供了肿瘤抗原的检测方法，相对于肿瘤组织的切片方法和PCR检测手段，该方法采用液相芯片技术进行检测，只需要使用微量的样品，在较短的时间内，就可以得到大量所需的数据，同时灵敏度和可靠性更好，操作更为简单。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
包被缓冲液：为EDC和S-NHS的混合溶液，在包被缓冲液中，EDC的浓度为45mg/ml，S-NHS的浓度为45mg/ml；
封闭液为含有体积百分数为0.8％BSA的PBS；
1.取血液样本100μL，加2mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育15min，裂解红细胞；
2.800g离心5min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入2ml PBS洗涤，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗3次，洗完后重悬细胞；
4.加入500μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为10min，作为待检样品；
5.包被：包被缓冲液活化微球，得到的活化微球分别偶联抗体anti-TKTL1(mousepolyclonal)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal)，用含1％BSA的PBS封闭微球，25℃封闭1h；
6.加样：待检样品分别加入已包被抗体的微球体系中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
7.在相应的微球体系中加入anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1抗体(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)，37℃，孵育20min；
8.加入2mL PBS洗涤2次；
9.分别加入1：5000稀释的anti-rabbit-PE抗体(donkey polyclonal，abcam，货号ab7007)，避光孵育10min；
10.加入2mL PBS洗2次，Luminex检测；
仪器名称：Merckmillipore Luminex；
11.结果判读方法：用细胞内参GAPDH作为对照，目的蛋白检测值与内参GAPDH的比值即为GCI指数。
实施例2
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.4)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
包被缓冲液：为EDC和S-NHS的混合溶液，在包被缓冲液中，EDC的浓度为50mg/ml，S-NHS的浓度为50mg/ml；
封闭液为含有体积百分数为1％BSA的PBS；
1.取血液样本200μL，加3mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育10min，裂解红细胞；
2.750g离心6min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入3ml PBS洗涤，涡旋混匀，750g离心5min，去上清，洗2次，洗完后重悬细胞；
4.加入800μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为8min，作为待检样品；
5.包被：包被缓冲液活化微球，得到的活化微球分别偶联抗体anti-TKTL1(mousepolyclonal)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal),用含1％BSA的PBS封闭微球，25℃封闭1h；
6.待检样品分别加入已包被抗体的微球体系中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
7.在相应的微球体系中加入anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1抗体(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)，37℃，孵育15min；
8.加入2mL PBS洗涤2次；
9.分别加入1：5000稀释的anti-rabbit-PE抗体(donkey polyclonal，abcam，货号ab7007)，避光孵育15min；
10.加入2mL PBS洗2次，Luminex检测；
仪器名称：Merckmillipore Luminex；
11.结果判读方法：用细胞内参GAPDH作为对照，目的蛋白检测值与内参GAPDH的比值即为GCI指数。
实施例3
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.6)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
包被缓冲液：为EDC和S-NHS的混合溶液，在包被缓冲液中，EDC的浓度为55mg/ml，S-NHS的浓度为55mg/ml；
封闭液为含有体积百分数为1.2％BSA的PBS；
1.取血液样本100μL，加2mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育20min，裂解红细胞；
2.850g离心4min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入2ml PBS洗涤，涡旋混匀，850g离心5min，去上清，洗3次，洗完后重悬细胞；
4.加入400μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为15min，作为待检样品；
5.包被：包被缓冲液活化微球，得到的活化微球分别偶联抗体anti-TKTL1(mousepolyclonal)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal),用含1％BSA的PBS封闭微球，25℃封闭1h；
6.加样：待检样品分别加入已包被抗体的微球体系中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
7.在相应的微球体系中加入anti-TKTL1(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA000505)和anti-DNASE1L1抗体(rabbit polyclonal，sigma，货号HPA072635)，37℃，孵育30min；
8.加入2mL PBS洗涤3次；
9.分别加入1：5000稀释的anti-rabbit-PE抗体(donkey polyclonal，abcam，货号ab7007)，避光孵育10min；
10.加入2mL PBS洗3次，Luminex检测；
仪器名称：Merckmillipore Luminex；
11.结果判读方法：用细胞内参GAPDH作为对照，目的蛋白检测值与内参GAPDH的比值即为GCI指数。
实施例4
一种肿瘤抗原的检测方法，包括以下步骤：
制备以下溶液：
裂解液A：10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
裂解液B：150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
包被缓冲液：为EDC和S-NHS的混合溶液，在包被缓冲液中，EDC的浓度为45-55mg/ml，S-NHS的浓度为45-55mg/ml；
封闭液为含有体积百分数为1％BSA的PBS；
1.取血液样本100μL，加2mL裂解液A，涡旋震荡混匀，孵育15min，裂解红细胞；
2.800g离心5min，去除上清，缓慢倒掉上清，用纸吸取残留液体，涡旋震荡细胞；
3.加入2ml PBS洗涤，涡旋混匀，800g离心5min，去上清，洗3次，洗完后重悬细胞；
4.加入500μl裂解液B，裂解白细胞，裂解时间为10min，作为待检样品；
5.包被：包被缓冲液活化微球，得到的活化微球分别偶联抗体anti-TKTL1(mousepolyclonal)和anti-DNASE1L1(mouse polyclonal),用含1％BSA的PBS封闭微球，25℃封闭1h；
6.待检样品分别加入已包被抗体的微球体系中，置37℃孵育1小时，然后PBS洗涤3次；同时做空白对照(不加待检样品)、阴性对照(待检样品换为裂解液B)和阳性对照(将待检样品相应的替换为TKTL1蛋白或DNASE1L1蛋白)；
7.在相应的微球体系中加入带有荧光标记的anti-TKTL1或带有荧光标记的anti-DNASE1L1抗体，37℃，避光孵育20min；
8.加入2mL PBS洗2次，Luminex检测；
仪器名称：Merckmillipore Luminex；
9.结果判读方法：用细胞内参GAPDH作为对照，目的蛋白检测值与内参GAPDH的比值即为GCI指数。
试验例1
取确诊的癌症一期患者的血样采用实施例1-4的方法分别进行检测，该血样均分为21份，每个实施例进行平行试验3个；同时设置对照组1-3，每个对照组进行平行试验3个；对照组1：血液去血清，得到的血细胞100μL加2mL含有1％SDS的PBS溶液,混匀，于4℃裂解10min，得到的裂解液作为待检样品；对照组2：血液去血清，得到的血细胞100μL加2mL含有1％Triton X-100的PBS溶液,混匀，于4℃裂解10min，得到的裂解液作为待检样品；对照组3：取血液的血清作为待检样品；对照组1-3后续的检测步骤同实施例2。然后将得到的荧光信号进行计算统计，分别得到TKTL1和DNASE1L1的GCI指数，平行试验的三个样本的GCI指数的标准偏差具体如表1所示。
表1检测结果
组别 TKTL1标准偏差 DNASE1L1标准偏差
实施例1 0.015 0.020
实施例2 0.010 0.018
实施例3 0.017 0.025
实施例4 0.012 0.021
对照组1 0.256 0.297
对照组2 0.279 0.305
对照组3 0.007 0.009
从表1可以看出，采用本发明提供的试剂盒进行检测，每个实施例检测同一样本的TKTL1和DNASE1L1的GCI指数标准偏差均在0.03以内；而对照组1-2中采用血细胞的裂解物作为待测样本，由于杂质多，得到的数据不稳定，偏差大；而对照组3中采用血清作为待测样本，虽然偏差小，但血清中目标蛋白含量很少，基本检测不到。另外，本发明还对其他的样本进行这种检测，相同样本的标准偏差均在0.03以内。可见，本发明提供的试剂盒检测稳定性好，灵敏性高。
试验例2
分别取确诊的早期良性肿瘤患者的血样(样1)、癌症一期患者的血样(样2)、癌症二期患者的血样(样3)、癌症三期患者的血样(样4)以及正常人的血样(样5)分别采用实施例2的方法进行检测，同时将每个样本稀释不同的倍数进行检测，得到的TKTL1和DNASE1L1的GCI指数进行分析，得出：样本经稀释后，TKTL1的GCI指数和DNASE1L1的GCI指数均仍然具有很好的灵敏度和准确度；并且，不同确诊的样本原液以及稀释4倍以内的样本之间的数值均具有显著的差异。另外，大批试验也证实了不同确诊的样本之间的数值具有显著的差异。
此外，不同确诊的患者血样采用实施例1、3-4中的方法进行检测，得到的结果与实施例2结果一致。
经大量试验发现，待检测样品根据其中TKTL1和DNASE1L1的变化而检测相应强度变化的特异性荧光，检测结果稳定可靠，为肿瘤的辅助检测提供技术支持。具体地，本发明可以有以下方面的应用：
对不同个体的血液检测肿瘤抗原的水平，不同的个体可以为：健康与不同时期的肿瘤患者；通过大规模试验，分别通过得到的TKTL1和DNASE1L1换算的GCI指数获得大量不同个体的肿瘤抗原水平，进而可以设置一个特定值，以区分不同的患者。由于测定的样本中的TKTL1和DNASE1L1的数值由多种因素造成，因此，在后续检测过程中，根据对人体的血液中肿瘤抗原的水平，若是超出一定数值，则需要做进一步的检测，进而才能判断是否患有肿瘤。本发明通过测定GCI指数来辅助预测个体患肿瘤风险，为肿瘤预警提供技术支持。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于检测肿瘤抗原的液相芯片试剂盒，其特征在于，包括抗体一以及显示所述抗体一的物质，
和/或
抗体二以及显示所述抗体二的物质；
所述抗体一的抗原为TKTL1，所述抗体二的抗原为DNASE1L1；
所述液相芯片试剂盒还包括微球。
2.根据权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述显示所述抗体一的物质为标记在所述抗体一上的荧光标记，所述显示所述抗体二的物质为标记在所述抗体二上的荧光标记；
或者
所述抗体一为两种不同种属来源的抗体一，所述显示所述抗体一的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体一配对的二抗；所述抗体二为两种不同种属来源的抗体二，所述显示所述抗体二的物质为带有荧光标记的并与任一种抗体二配对的二抗；
优选地，抗体一为anti-TKTL1，所述抗体二为anti-DNASE1L1。
3.根据权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述液相芯片试剂盒还包括裂解液A、裂解液B、包被缓冲液、封闭液、细胞洗涤缓冲液中的任意一种或几种；
所述裂解液A含有以下浓度的各成分：
10±0.5mM Tris-HCl(pH 7.4-7.6)、10±0.5mM NaH2PO4、130±5mM NaCl、1％±0.05％Triton X-100以及10±0.5mM Na4P2O7；
所述裂解液B含有以下浓度的各成分：
150±5mM NaCl、0.1％±0.005％Triton X-100、1±0.05mM EDTA、20±0.1mM HEPES以及10％±0.5％甘油；
所述包被缓冲液为EDC和S-NHS的混合溶液，在所述包被缓冲液中，EDC的浓度为45-55mg/ml，S-NHS的浓度为45-55mg/ml；
所述封闭液为含有体积百分数为0.8％-1.2％BSA的PBS。
4.根据权利要求1-3任一项所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述荧光标记为PE、CY5、CY7、per-CP以及TRITC中的任一种；
所述微球优选为微米级微球，更优选为聚苯乙烯荧光微球。
5.一种肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的液相芯片试剂盒检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1来获知肿瘤抗原的信息。
6.根据权利要求5所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，所述白细胞裂解物通过以下方法制备：
取血液样品，采用所述的裂解液A裂解红细胞，去除除白细胞外的所有成分；
得到的白细胞采用所述的裂解液B进行裂解，得到白细胞裂解物；
优选地，所述裂解液A与所述血液样品的体积比为15-20:1，裂解的时间为10-20min。
7.根据权利要求6所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，采用离心的方式去除除白细胞外的所有成分，所述离心的条件为：750-850g，4-6min，离心后去除上清即可；
优选地，离心后得到的沉淀采用PBS洗涤2-3次。
8.根据权利要求6所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，所述裂解液B与所述血液样品的体积比为4-6:1，裂解的时间为8-15min。
9.根据权利要求5-8任一项所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，所述的液相芯片试剂盒检测血液中的白细胞裂解物中的TKTL1和DNASE1L1的具体步骤如下：
(a)、所述微球采用所述包被缓冲液活化后，将所述抗体一和所述抗体二分别包被在所述微球上，分别得到抗体一包被的微球和抗体二包被的微球，采用权利要求3中的封闭液进行封闭处理；
(b)、所述白细胞裂解物分别与抗体一包被的微球和抗体二包被的微球混合，孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(c)、在对应的微球反应体系中加入带有荧光标记的抗体一或带有荧光标记的抗体二，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
或者
在对应的微球反应体系中加入与步骤(a)不同种属来源的抗体一或与步骤(a)不同种属来源的抗体二，孵育后，用PBS缓冲液洗涤，然后在相应的微球反应体系中加入带有荧光标记的相应的抗体一的二抗或带有荧光标记的相应的抗体二的二抗，避光孵育后，用PBS缓冲液洗涤；
(d)、采用多功能液相芯片分析平台进行检测即可。
10.根据权利要求5所述的肿瘤抗原的检测方法，其特征在于，还设置细胞内参GAPDH作为对照，根据目的蛋白检测值与细胞内参GAPDH检测值判断所述肿瘤抗原的信息。
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