CN110214272A - 通过位置同位素辨别进行的有氧糖酵解确定 - Google Patents

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Abstract

提供了采用经同位素标记葡萄糖的检测有氧糖酵解的方法。

Description

通过位置同位素辨别进行的有氧糖酵解确定
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月20日提交的美国申请序列号62/352,165的申请日的权益，其公开内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明在分别由国立卫生研究院(National Institutes of Health)和国家科学基金会(National Science Foundation)授予的1R01CA157012-01A1、以及IOS-1400818和IOS-1238812的政府支持下完成。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
虽然正常细胞通过氧化磷酸化由葡萄糖产生ATP，但已知大多数癌细胞即使在有氧条件下也通过将葡萄糖转化为乳酸(lactate)来产生ATP(DeBerardinis等，2008)。近一个世纪以前，德国科学家Otto Warburg发现了这一现象，其被称为有氧糖酵解或瓦博格效应(Warburg effect)(Warburg，1954)。然而，其直至正电子发射断层显像(positronemission tomography，PET)扫描技术的开发才被认识到。该成像技术使用经放射性标记的葡萄糖类似物氟脱氧葡萄糖(fluorodeoxyglucose，FDG)通过测量体内升高的葡萄糖摄取来在癌症患者中检测转移性病变或评估治疗应答。
PET扫描结果显示，葡萄糖摄取的显著提高与乳腺肿瘤侵袭性提高和预后差密切相关(Ueda等，2005)。使用改进的PET计算机断层显像或PET/CT技术对原发性乳腺肿瘤进行评价进一步表明，较高水平的葡萄糖摄取与乳腺癌的数种生物标志显著相关，例如雌激素受体(estrogen receptor，ER)和孕酮受体(progesterone receptor，PR)的阴性状态、较高的erbB-2(Her2)表达、以及肿瘤大小和淋巴结转移(Ueda等，2005)。
虽然PET或PET/CT扫描结果表明葡萄糖摄取升高可以是癌细胞中有氧糖酵解增强背后的驱动力之一，但尚不清楚癌细胞中葡萄糖摄取活性与糖酵解率的相关性有多密切。除糖酵解之外，乳酸还可在癌细胞代谢期间从其他代谢途径(例如戊糖磷酸途径(pentosephosphate pathway，PPP))产生(图1)。因此，需要可明确测量肿瘤细胞中葡萄糖通过糖酵解向乳酸转化的方法，以准确地确定癌细胞中葡萄糖摄取与糖酵解之间的关系。
发明概述
癌细胞通过有氧糖酵解产生乳酸的能力是癌症(包括乳腺癌)的一致标志。如本文中所述，建立了采用位置同位素标记(positional isotopic labeling)和质谱(MS)(例如LC-MS)的方法，其可特别地测量葡萄糖通过糖酵解向乳酸的转化。使用该方法，显示在乳腺癌细胞中有氧糖酵解率(rate of aerobic glycolysis)与葡萄糖摄取和乳酸浓度密切相关。在转移性乳腺癌细胞和小鼠中早期转移性乳腺肿瘤中也发现[3-13C]乳酸的产生显著升高，这可引起用于诊断侵袭性乳腺癌的生物标志的开发。
本公开内容提供了在包含细胞的样品中检测有氧糖酵解的方法。在一个实施方案中，该方法检测与PPP和/或谷氨酰胺分解(glutaminolysis)无关(与其不相关或不受其干扰)的糖酵解。该方法包括：提供包含从细胞(例如，癌细胞)获得的样品和经标记葡萄糖(例如，[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6,6-氘标记葡萄糖)的混合物；使用MS随时间在混合物中测量经标记葡萄糖向经标记乳酸的转化，例如[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化、或经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化；以及确定例如相对于对照细胞(例如相应的正常细胞或相应的具有低转移潜能的癌细胞)或相对于t＝0时来确定样品中细胞中的葡萄糖摄取、乳酸浓度或有氧糖酵解率。在一个实施方案中，样品包含无丙酮酸盐的培养基。在一个实施方案中，样品是生理样品，例如生理流体样品，包括但不限于血液样品、血浆样品、尿样品或乳样品。在一个实施方案中，样品是组织样品，例如组织活检物样品。在一个实施方案中，细胞包含乳腺癌细胞。在一个实施方案中，细胞包含前列腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、皮肤癌细胞等。在一个实施方案中，MS是LC-MS，其灵敏度可以是NMR和GC-MS的高至1000倍。在一个实施方案中，测量随时间样品中细胞中的葡萄糖摄取。例如，与对照细胞或t＝0时相比葡萄糖摄取提高大于1.2倍、1.5倍、1.7倍或2倍或更多指示样品中的细胞具有提高的转移潜能。在一个实施方案中，测量乳酸浓度。例如，与对照细胞相比乳酸浓度提高2％、5％、7％、10％或更多(例如随时间从至少0.025mM提高至约0.2mM)指示样品中的细胞具有提高的转移潜能。在一个实施方案中，在体外测量相对有氧糖酵解率。例如，与对照细胞或t＝0时相比相对糖酵解率提高大于1.5倍、2倍或3倍或更多指示样品中的细胞具有提高的转移潜能。
还提供了检测化合物改变癌细胞中有氧糖酵解的效力的方法。该方法包括：使化合物、包含细胞的样品和一定量的经标记葡萄糖(例如，[1-13C]葡萄糖)相接触，从而提供混合物；以及使用质谱来测量混合物中经标记葡萄糖向经标记乳酸的转化，例如[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化。在一个实施方案中，细胞是癌细胞。在一个实施方案中，样品是活检物。
还提供了检测基因突变对癌细胞中有氧糖酵解的作用的方法。该方法包括接触在代谢途径中具有突变的细胞(例如哺乳动物细胞)；以及使用质谱来测量[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化。
在一个实施方案中，提供了检测癌细胞的转移潜能(侵袭前(pre-invasiveness))的方法。该方法包括提供包含与一定量经标记葡萄糖(例如，[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6,6-氘标记葡萄糖)接触的哺乳动物癌细胞(例如人癌细胞)的混合物。使用质谱来测量混合物中经标记葡萄糖向经标记乳酸的转化(例如，[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化)，并基于混合物中经标记乳酸(例如，[3-13C]乳酸)的存在或量或者经标记葡萄糖向经标记乳酸的转化率(例如，[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率)来确定细胞是否具有提高的转移潜能。在一个实施方案中，该方法用于检测侵袭前乳腺癌或其他类型的侵袭前癌细胞，其例如具有转移侵袭性的潜能。
本公开内容还提供了检测体内有氧糖酵解的方法。该方法包括：从施用经标记葡萄糖(例如，[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6,6-氘标记葡萄糖)的哺乳动物收集生理流体(例如，乳、血液或尿)或组织样品；以及使用质谱在样品中测量[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值。在一个实施方案中，样品是血液样品。在一个实施方案中，样品是乳样品。在一个实施方案中，样品是尿样品。在一个实施方案中，样品是组织样品。
本公开内容提供了在哺乳动物中检测或诊断侵袭前(pre-invasive)或恶变前(pre-malignant)癌症的方法。该方法包括：从施用经标记葡萄糖(例如，[1-13C]葡萄糖、[1，2]-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6,6-氘标记葡萄糖)的哺乳动物收集生理样品，例如生理流体样品(例如，血液、乳或尿样品)或组织样品；以及使用质谱在样品中测量[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值。在一个实施方案中，使用质谱来测量样品中[1-13C]乳酸/未经标记乳酸的比值或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值。在一个实施方案中，将活检物与[1-13C]葡萄糖或经氘标记葡萄糖混合并使用质谱来测量随时间[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化或经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化，例如[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值。例如相对于来自未患癌症的哺乳动物的相应样品，具有升高的经标记乳酸水平的样品指示哺乳动物患有侵袭前或恶变前癌症。在一个实施方案中，样品是生理流体样品。在一个实施方案中，样品是生理组织样品。例如，与正常哺乳动物或t＝0时相比相对糖酵解率或经标记乳酸提高大于1.5倍、2倍或3倍或更多指示哺乳动物患有侵袭前或恶变前癌症。
在一个实施方案中，提供了在哺乳动物中监测癌症复发的方法。该方法包括：提供混合物，其包含来自哺乳动物的包含细胞的样品和一定量的经13C或氘标记葡萄糖；使用LC-MS在混合物中测量经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化，例如[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值；以及基于混合物中经13C或氘标记乳酸的存在或量或者经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化率(例如，[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值)来确定哺乳动物是否处于癌症复发的风险之中。在一个实施方案中，哺乳动物是进行乳腺癌治疗的人。在一个实施方案中，哺乳动物是针对除乳腺癌之外的癌症进行治疗的人。在一个实施方案中，将混合物中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率(例如[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值)与对照混合物或者在较早时间点从所述哺乳动物获取的一个或更多个样品中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率进行比较。在一个实施方案中，将混合物中经氘标记乳酸的存在或量或者经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化率与对照混合物或者在较早时间点从所述哺乳动物获取的一个或更多个样品中经氘标记乳酸的存在或量或者经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化率进行比较。在一个实施方案中，样品是生理流体样品。在一个实施方案中，样品是生理组织样品。例如，与对照哺乳动物或t＝0时相比相对糖酵解率提高大于1.5倍、2倍或3倍或更多指示哺乳动物具有癌症复发。
在一个实施方案中，提供了在患有癌症的哺乳动物中监测针对癌症治疗(例如，化学治疗、放射治疗或免疫治疗)的治疗应答的方法。在一个实施方案中，该方法包括：提供混合物，其包含来自哺乳动物的包含细胞的样品和一定量的经13C或氘标记葡萄糖；使用LC-MS在混合物中测量经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化，例如测量[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值；以及基于混合物中经13C或氘标记乳酸的存在或量或者经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化率来确定哺乳动物是否具有针对治疗的治疗应答。在一个实施方案中，哺乳动物是人。在一个实施方案中，哺乳动物患有乳腺癌。在一个实施方案中，哺乳动物是患有除乳腺癌之外的癌症的人。在一个实施方案中，将混合物中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率与对照混合物或者在较早时间点从所述哺乳动物获取的一个或更多个样品中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率进行比较。在一个实施方案中，将混合物中经氘标记乳酸的存在或量或者经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化率与对照混合物或者在较早时间点从所述哺乳动物获取的一个或更多个样品中经氘标记乳酸的存在或量或者经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化率进行比较。在一个实施方案中，样品是生理流体样品。在一个实施方案中，样品是生理组织样品。例如，与对照哺乳动物中或t＝0时相比相对糖酵解率提高大于1.5倍、2倍或3倍或更多指示哺乳动物不对治疗作出应答。
附图简述
图1.显示[1-13C]葡萄糖通过糖酵解和戊糖磷酸途径代谢的总结图。100％糖酵解在乳酸的C3处产生1∶1的13C与12C，但是如果葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢的话，所有经标记碳将作为13CO2丢失。
图2.与MDA-MB-453细胞相比，MDA-MB-231细胞表现出更高的葡萄糖摄取。将亚汇合细胞血清饥饿过夜。然后，用PBS洗涤细胞，并用无葡萄糖和血清培养基替代细胞培养基。然后，以30μg/mL的浓度添加经荧光标记的2-NBDG(Cayman Chemical)持续30分钟。在添加2-NBDG之后，将细胞用100nM胰岛素处理另外45分钟。然后，如下文中所述测量葡萄糖摄取。该图表示来自3个单独实验的2-NBDG葡萄糖摄取的平均值±SEM(p＜0.05)。
图3.与MDA-MB-453细胞相比，MDA-MB-231细胞表现出更高的糖酵解率。在含有10％FBS的DMEM培养基中培养等数目的MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞。将亚汇合(60％至80％汇合)细胞血清饥饿过夜。然后，用PBS洗涤细胞，并用无葡萄糖/丙酮酸盐/血清培养基替代细胞培养基。在葡萄糖/丙酮酸盐饥饿90分钟之后开始D-[1-13C]葡萄糖(10mM)的标记。在指定的时间点取40μL细胞培养基，并随后用160μL甲醇稀释以使蛋白质沉淀。用Q-Exactive质谱仪进行细胞培养基的LC-MS分析。该图表示来自3个重复的糖酵解率的平均值±SEM。
图4.MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中的相对有氧糖酵解率与乳酸的产生相关。对从在图3中进行的[1-13C]葡萄糖标记实验获得的细胞培养基进行乳酸浓度测定。使用L-乳酸测定试剂盒按照制造商的方案测量乳酸。该图表示来自3个单独实验的乳酸浓度的平均值±SEM。
图5.具有早期转移性乳腺肿瘤的小鼠显示血清样品中的糖酵解率显著升高。A)在第四腹股沟乳房脂肪垫中向C57BL/6小鼠原位注射在盐水中的E0771细胞，或仅注射盐水。3至4周后，当肿瘤变得可见时，将具有或没有乳腺肿瘤的小鼠禁食过夜，并在第二天早上通过尾静脉注射0.2mL的1M无菌[1-13C]葡萄糖。在注射之后1小时通过面静脉抽血。随后将血液样品离心，收集小鼠血清并处理用于LC-MS分析。结果表示为来自具有早期转移性乳腺肿瘤的小鼠(n＝6)与无肿瘤小鼠(n＝6)的血清样品中的[1-13C]乳酸/未经标记乳酸(p＜0.05)。B)对从上述进行的小鼠实验获得的血清样品进行乳酸浓度测定。使用L-乳酸测定试剂盒按照制造商的说明测量乳酸。该图表示来自3个单独实验的乳酸浓度的平均值±SEM。
图6.来自图3的培养的乳腺癌细胞中同位素标记结果的重新呈现。结果示出了在用[1-13C]葡萄糖标记乳腺癌细胞系3小时之后[1-13C]葡萄糖在其向乳酸转化方面通过糖酵解与戊糖磷酸途径的相对通量。
图7A至B.A)将亚汇合的MDA-MB-231细胞血清饥饿过夜。将细胞用PBS洗涤，并随后用10μM KU-55933(Halaby等，2008)在无葡萄糖和血清培养基中预处理30分钟。然后，添加经荧光标记的2-NBDG(30μg/m1)持续30分钟。将细胞用100nM胰岛素处理另外45分钟。然后，按照制造商的说明(Cayman Chemical)测量葡萄糖摄取。B)将MDA-MB-231细胞在含有10％FBS的DMEM中进行培养。在达到约80％汇合之后，将细胞血清饥饿过夜。然后，将细胞用PBS洗涤，并在无血清和葡萄糖/丙酮酸盐的DMEM中孵育90分钟。在用补充有10mM D-[1-13C]-葡萄糖±10μM KU-55933的新鲜无血清和葡萄糖/丙酮酸盐的DMEM替代培养基之后开始标记。在孵育9小时之后，取出40μL培养基并用160μL甲醇稀释以使蛋白质沉淀。对于LC-MS分析，进样2μL上清液并用Q-Exactive质谱仪进行分析。条形图表示来自3个单独实验的平均相对糖酵解率±SEM(*p＜0.05)。还在标记1、3和6小时时取样，其也显示KU-55933对糖酵解率的显著抑制。
发明详述
代谢物组学(metabolomics)是涵盖多种分析方法的领域，这些方法与在细胞和生物系统内发现的小分子或代谢物的高通量测量的共同目标相一致(Hegeman，2010)。在这些不同的分析方法中，稳定同位素标记或示踪是用于确定底物对特定代谢途径的相对贡献的有效方法，并且当与质谱(MS)联用时，其使得能够量化具有不同同位素组成的分子的相对丰度。
本公开内容描述了基于位置同位素标记和质谱的方法，例如基于液相色谱(LC)-MS的方法，其可特别地测量癌细胞中通过糖酵解从葡萄糖向乳酸的转化。通过该方法获得的有氧糖酵解率显示与乳腺癌细胞中的葡萄糖摄取活性和乳酸浓度密切相关。结果还显示在转移性乳腺癌细胞和小鼠早期转移性乳腺肿瘤中[3-13C]乳酸的产生显著升高，这可引起用于侵袭性乳腺癌的有前景生物标志的开发。
检测方法可用于在于禁食过夜后向患者中注射少量经稳定同位素标记[1-13C]葡萄糖之后测量血清样品中升高的作为侵袭前乳腺癌生物标志[3-13C]-乳酸的产生。这是侵入性极低、不具有放射性且经济的操作，其可在通过乳房X线照相术筛查和/或MRI检测已经患有DCIS的女性中进行。该方法还可用于在已用针对糖酵解的化学治疗剂治疗的患者中监测治疗应答和/或肿瘤复发。在一个实施方案中，该方法可用于高通量筛选可特别地抑制多种类型癌细胞中有氧糖酵解的药物。该方法还可用于生物医学研究，检测不同病理生理条件或基因突变对癌细胞中有氧糖酵解的作用，这可有助于用于癌症患者的个体化治疗的开发。
与包括测量细胞培养基中酸度(Seahorse Biosciences)或通过基于酶的方法检测乳酸(多个生物技术公司)的早期方法相比，本发明方法可测量来自单个代谢途径(而不是多个代谢途径)的相对乳酸产生。
与早期方法相比，本发明方法的灵敏度更高。其可在培养的细胞中或在体内在癌症的动物模型中准确地追踪通过糖酵解从葡萄糖向乳酸的转化，因为其测量从[1-13C]-葡萄糖向[3-13C]-乳酸的转化而不受戊糖磷酸途径(进入该途径的稳定13C变成CO2)和谷氨酰胺分解(经标记谷氨酰胺不向培养基中添加或注射到身体中)干扰。其还可用于评估抗糖酵解药物在体外和体内的效力。此外，该方法可用于高通量筛选能够抑制癌症中有氧糖酵解的药物。
本发明将通过以下非限制性实施例进一步描述。
实施例
材料和方法
材料
葡萄糖和乳酸购自Sigma。[1-13C]葡萄糖和[3-13C]乳酸购自Cambridge IsotopeLaboratories。
2-NBDG摄取测定
使用来自Cayman Chemical的2-NBDG(2-脱氧-2-[(7-硝基-2，1，3-苯并二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖，经荧光经标记的2-脱氧葡萄糖)葡萄糖摄取试剂盒来分析葡萄糖摄取。简单地说，将细胞以200,000个细胞/孔平板接种在24孔板中，并使其生长至亚汇合。然后，将细胞血清饥饿过夜。第二天早上，将细胞在无血清和葡萄糖培养基中孵育30分钟。然后，将细胞用30μg/mL 2-NBDG孵育另外30分钟。孵育后，将细胞用100nM胰岛素处理45分钟。然后，将细胞转移至透明底黑色96细胞板。将板以400×g离心5分钟。通过抽吸除去培养基，并用PBS洗涤细胞，然后向每个孔添加基于细胞的测定缓冲液(在试剂盒中提供)。用Synergy 2(BioTek)微板阅读器在激发/发射＝485/535nm下测量信号强度。
乳酸浓度测定
使用L-乳酸测定试剂盒(Eton Biosciences)按照制造商的方案测量乳酸。简单地说，将样品用nano纯水1∶10稀释至50μL总体积，并随后在96孔板中与试剂盒中提供的50μLL-乳酸测定溶液混合。然后，将板在37℃下孵育30分钟。用Multiskan Ascent(Labsystems)微板阅读器在492nm的波长下测量吸光度。
细胞培养和1-13C-葡萄糖标记
MDA-MB-231是具有强侵袭能力的侵袭性乳腺癌细胞系，而MDA-MB-453是表现出相对低侵袭能力或无侵袭能力的乳腺癌细胞系(Zhang等，2013；Wang等，2011)。将这些乳腺癌细胞在补充有抗生素和10％胎牛血清的DMEM中进行培养。在标记实验之前，将相等的细胞数(5×105/孔)平板接种在6孔板上并使其生长至亚汇合。标记操作是由Ben-Sahra等(2013)中描述的操作改进而来的。简单地说，将细胞血清饥饿过夜。第二天早上，用PBS洗涤细胞，并用无血清/葡萄糖/丙酮酸盐培养基替代细胞培养基持续90分钟。在葡萄糖/丙酮酸盐饥饿之后，将培养基替换为补充有10mM[1-13C]葡萄糖的新鲜无血清/葡萄糖/丙酮酸盐培养基以启动同位素标记，并在1小时、3小时、6小时和9小时时间点时取出细胞培养基(40μL)用于进一步的LC-MS分析。
动物研究
在第四腹股沟脂肪垫中向12周龄C57BL/6雌性小鼠(Harlan)原位注射在盐水中的约200,000个同基因E0771细胞，或在相同部位仅注射盐水。E0771是来源于C57BL/6小鼠的小鼠乳腺肿瘤细胞系，并且当接种于C57BL/6小鼠中时在体内具有转移性(Chen等，2012)。3至4周后，将具有或没有乳腺肿瘤的小鼠禁食过夜，并随后在第二天早上，通过尾静脉注射向每只小鼠中输注0.2mL的1M无菌[1-13C]葡萄糖。在肿瘤发生的该早期阶段，小鼠体重(平均值＝约23g/小鼠)在对照组和荷瘤组之间没有表现出显著变化。在注射之后1小时，从小鼠收集血液。在离心后制备小鼠血清，并将其储存在-80℃下用于进一步的LC-MS分析。随后，处死小鼠并收集小鼠肿瘤和小鼠组织样品用于进一步的病理学分析以确认肿瘤分级和转移。
LC-MS分析
将从细胞和小鼠同位素标记实验取得的细胞培养基或制备的小鼠血清与100％甲醇以2∶8(40μL/160μL)比例混合以使蛋白质沉淀。在通过涡旋连续混合10分钟之后，将混合物以13,000×g离心10分钟，并将上清液用于LC-MS分析。简单地说，使用与带有加热电喷雾电离(heated electrospray ionization，HESI)源的Q Exactive四级杆-轨道阱混合质谱仪(Dionex/Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)偶联的Ultimate 3000UHPLC系统，将来自每个样品的2μL上清液进样到来自Merck SeQuant(Darmstadt，Germany)的100mm×2.1mm，3μm的ZIC-HILIC柱中。八分钟梯度用流动相A(水中0.1％甲酸)和B(乙腈中0.1％甲酸)使用400μL/分钟的流量以以下梯度进行：初始，98％B；0至6分钟，98％至40％B；6至8分钟，40％B。使用以下MS条件：负全扫描模式，扫描范围为80至1200m/z，分辨率为35,000(在m/z 200下)，目标自动增益控制(AGC)为1×106，并且最大填充时间为200ms。收集数据并在Xcalibur软件2.2版(Thermo Scientific，Bremen，Germany)中查看。使用真实标准通过保留时间、准确质量和片段化谱验证乳酸的身份。使用来自ProteoWizard的msConvert工具将.raw文件转换为mzXML文件(Chambers等，2012)。用在R中实施的XCMS和ProteinTurnover软件包二者都用于数据处理(Smith等，2006)。用于数据处理的代码的实例可在这里找到：https：//github.com/dfreund/Lactate1-13C.git。通过将[1-13C]葡萄糖掺入[3-13C]乳酸中来测量每种癌细胞系的相对糖酵解率。简单地说，针对乳酸同位素体(isotopomer)：[M0]＝89.024m/z(未经标记乳酸)和[M1]＝90.028(经标记[3-13C]乳酸)生成了特定保留时间窗口的提取离子色谱图(extracted ion chromatogram，EIC)。使用保留时间相关策略，绘制每个点的EIC，并在图上进行线性回归。该线的斜率是同位素体的强度比(M1/M0，[3-13C]乳酸/未经标记乳酸)。使用在通过葡萄糖/丙酮酸盐饥饿耗尽培养基中残留的乳酸并随后用含有[1-13C]葡萄糖的新培养基更换旧培养基之后初始标记阶段期间经标记[3-13C]乳酸(来自糖酵解)与[未经标记乳酸+经标记[3-13C]乳酸](来自糖酵解和PPP途径二者)的比值来计算葡萄糖通过糖酵解途径和戊糖磷酸途径(PPP)到乳酸中的相对通量。具体而言，使用以下等式来计算糖酵解的百分比：2*(M1/(M0+M1)*100％。使用2的放大系数来反映糖酵解途径中DHAP与甘油醛3-P之间的异构化或同位素交换(图1)。
结果
使用经荧光标记2-脱氧葡萄糖2-NBDG通过2-脱氧-葡萄糖掺入法来测量两种乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-453的葡萄糖摄取活性。结果显示，这两种细胞系响应于胰岛素刺激均表现出提高的葡萄糖摄取。令人感兴趣的是，发现，侵袭性转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231在基础条件和胰岛素介导的条件下均比具有低转移能力的乳腺癌细胞系MDA-MB-453表现出更高(约2倍)的葡萄糖摄取活性(图2)(Zhang等，Wang等，2011)。为了直接确定癌细胞中葡萄糖摄取与糖酵解之间的联系，建立了基于稳定同位素标记和LC-MS的方法来测量癌细胞中[1-13C]葡萄糖通过糖酵解向[3-13C]乳酸的转化。该LC-MS方法被开发用于迅速分离和检测来自培养基或血清样品的80％甲醇提取物中的乳酸。用真实标准确认乳酸的鉴定，验证了保留时间、准确质量和片段化或串联质谱(MS/MS)(数据未显示)。
使用该方法，测量了MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中来自葡萄糖的乳酸产生。与乳腺癌细胞中提高的葡萄糖摄取一致，结果表明，即使在正常有氧培养条件下，在这些乳腺癌细胞中也由[1-13C]葡萄糖产生[3-13C]乳酸。令人感兴趣的是，发现，与MDA-MB-453细胞相比，MDA-MB-231细胞显示来自[1-13C]葡萄糖的[3-13C]乳酸产生显著提高(图3)。比较了MDA-MB-231细胞与其他非转移性或低转移性乳腺癌细胞系中的乳酸产生，并且发现与这些细胞系相比，MDA-MB-231细胞也显示出更高的[3-13C]乳酸产生(数据未显示)。
最初，认为乳酸/乳酸根是糖酵解的废产物，但是现在已知乳酸水平升高与肿瘤侵袭性提高和预后差密切相关(Doherty和Cleveland，2013；Dhup等，2012)。为了确定来自LC-MS方法的结果是否与培养基中从癌细胞分泌的乳酸的量一致，使用市售分光光度乳酸测定试剂盒来测量细胞培养基中的乳酸浓度。结果表明，测量结果(图4)与使用LC-MS方法获得的有氧糖酵解率一致。
接下来，在具有或没有乳腺肿瘤的C57BL/6小鼠中比较乳酸产生率。向C57BL/6小鼠接种来源于相同小鼠物种的转移性小鼠乳腺肿瘤细胞系E0771细胞(Chen等，2012)或者接种盐水。在来源于E0771细胞的肿瘤变得可见之后，在将小鼠禁食过夜后监测这些小鼠中的乳酸产生率。与来自没有携带乳腺肿瘤的小鼠的血清样品相比，在来自携带早期转移性乳腺肿瘤的小鼠的血清样品中观察到[3-13C]乳酸的显著升高(图5A)。
与其中在良好控制的培养条件下通过单批均一化细胞产生乳酸的培养癌细胞相比，小鼠中的乳酸产生还涉及由其他器官(即肌肉组织)产生的乳酸。因此，在来自具有或没有乳腺肿瘤的C57BL/6小鼠的血清样品中测量乳酸浓度的基础水平。令人感兴趣的是，在具有或没有乳腺肿瘤的小鼠之间观察到相同的乳酸浓度水平(图5B)。这些结果表明，用于监测瞬时乳酸掺入率的LC-MS方法在区分具有或没有转移性肿瘤的小鼠中的乳酸产生方面非常灵敏，尽管这些小鼠中乳酸的基础水平相同。
讨论
癌细胞通过有氧糖酵解产生大量乳酸的能力与高葡萄糖摄取率相关(Chen和Russo，2012)。事实上，葡萄糖摄取和糖酵解提高是癌症(包括乳腺癌)的最一致标志(DeBerardinis等，2008；Chen和Russo，2010)。细胞代谢中的这些改变通过使癌细胞不依赖于对生长因子和其他环境刺激的需要而在保护癌细胞免于凋亡中发挥关键作用。磁共振波谱术(Magnetic Resonance Spectroscopy，MRS)，也称为NMR波谱术，主要用于检测来自葡萄糖的升高的糖酵解或乳酸产生作为脑癌(例如胶质瘤)中肿瘤发生的指标(Schupp等，1993)。然而，这种方法在其他类型癌症中的使用由于传统NMR技术的灵敏度而受到限制(Wolfender等，2014)。
然而，与传统基于GC-MS或NMR的技术相比，LC-MS的最新进展已显著提高了该方法的灵敏度(Wolfender等，2014)，这使得检测极低浓度的小分子或代谢物成为可能。此外，用于葡萄糖代谢的代谢示踪的最常用方法之一是使用[2-13C]葡萄糖，但是使用该经同位素标记葡萄糖分子难以区分导致产生乳酸的不同途径。此外，目前没有其他不受其他代谢途径干扰的可监测癌细胞中葡萄糖通过糖酵解的乳酸产生的可用检测方法。包括测量细胞培养基中酸度(Seahorse Biosciences)或通过基于酶的方法检测乳酸(多个生物技术公司)的商业上可利用的方法仅测量糖酵解的最终产物乳酸的浓度，而乳酸可来自多个代谢途径。
与这些方法相比，本文中描述的方法在培养的癌细胞中不仅更加灵敏，而且其还可准确地追踪，至少在初始标记阶段可准确地追踪葡萄糖通过糖酵解向乳酸的转化，而不受例如PPP途径和谷氨酰胺分解的其他途径干扰。如图1中所示，葡萄糖的C1处的碳(异头碳)在PPP途径中变为CO2。此外，经标记谷氨酰胺没有被添加到培养基中或注射到小鼠中，因此不追踪来自谷氨酰胺分解的乳酸产生。实际上，本发明结果显示癌细胞中来自[1-13C]葡萄糖的[3-13C]乳酸产生显著提高，这与乳腺癌细胞中提高的葡萄糖摄取活性和小鼠乳腺肿瘤的侵袭性一致。
本研究建立的检测方法已显示出在培养的癌细胞中比较体外糖酵解率的有前景结果。由于通过长时间的葡萄糖/丙酮酸盐饥饿过程耗尽了基础乳酸产生水平，因此结果还可准确地反映糖酵解与戊糖磷酸途径的比值，至少在初始标记阶段(1至3小时)期间如此(图6)。已知，癌细胞中的糖酵解率受葡萄糖摄取以及数种关键糖酵解酶影响。因此，该方法可潜在地用于在培养的癌细胞中评估靶向葡萄糖摄取或糖酵解过程中不同酶的多种化合物的效力。同样，该方法也可用于生物医学研究，检测不同基因突变对癌细胞中有氧糖酵解的作用，这可有助于用于癌症患者的个体化治疗的开发。
大多数癌症相关死亡(包括乳腺癌的那些)由转移引起。最近的研究已表明，乳酸可被邻近的癌细胞或基质细胞用作促进血管生成和转移的能量来源(Doherty和Cleveland，2013；Dhup等，2012)。实际上，本发明结果表明，来自糖酵解的乳酸产生升高是乳腺癌细胞系中肿瘤转移的指标(Zhang等，2013；Wang等，2011)。事实上，在MDA-MB-231而非MDA-MB-453细胞或其他低侵袭性或非侵袭性乳腺癌细胞系中已报道多种转移相关蛋白质的表达提高(Zhang等，2013；Wang等，2011)，这与本发明结果一致。该结果还同意使用经同位素标记同基因非转移性与转移性癌细胞的最近发现，其显示在转移性癌细胞中乳酸产生提高(Simoes等，2016)。
虽然乳房X线照相术筛查已导致对原位导管癌或DCIS乳腺肿瘤(局限于乳导管内的惰性异常细胞)的早期检测提高，但最近的报道表明，这种方法无法降低来自转移性乳腺癌的乳腺癌死亡，因为其不能区分侵袭前乳腺癌与惰性乳腺癌(Miller等，2014)。虽然使用经放射性标记FDG的PET成像技术被认为是模拟癌细胞中有氧糖酵解率的方法，但是该方法对于检测乳腺肿瘤的小病变不够灵敏并且不能用于检测侵袭前癌症。然而，大多数DCIS从未转移，并且尚不清楚为什么某些DCIS病变会发展为侵袭性乳腺癌。结果，相当多的患者遭受侵入性治疗相关的病况。因此，迫切需要新方法和新技术来寻找适合于检测侵袭前癌症的生物标志。
在具有早期转移性乳腺肿瘤或没有肿瘤的小鼠中获得的血清样品中观察到[1-13C]葡萄糖在向[3-13C]乳酸中的掺入率的显著差异。与测量糖酵解/PPP比值的体外细胞研究结果不同，小鼠研究中体内同位素掺入的相对比值反映了使用基础乳酸水平作为对照的糖酵解率。因此，其可以是体内癌细胞的异常糖酵解的更好指标。可想到，可进一步开发这种方法以在禁食过夜后向患者中注射少量经稳定同位素标记[1-13C]葡萄糖之后测量患者血清样品中升高的[3-13C]乳酸产生作为侵袭前乳腺癌的生物标志。这可以是侵入性极低、不具有放射性且经济的操作，其可在通过乳房X线照相术筛查检测已经发生DCIS乳腺肿瘤的女性中进行。因此，本发明结果可为在临床试验中进一步探索升高的稳定同位素乳酸产生作为侵袭前乳腺癌的有前景生物标志铺平道路。
虽然已经测试了数种新开发的基于NMR的技术检测侵袭性癌症的能力，但是这些技术(例如PET成像)比本发明技术昂贵得多，并且仍处于早期开发阶段(Lupo等，2010；Pickup等，2008)。相比之下，本发明的检测方法可以是侵入性极低、不具有放射性且经济的操作，其可在通过乳房X线照相术筛查检测已经发生DCIS乳腺肿瘤的女性中进行。因此，本发明结果可为在临床试验中进一步探索升高的稳定同位素乳酸产生作为侵袭前乳腺癌的有前景生物标志铺平道路。
总之，癌细胞通过有氧糖酵解产生大量乳酸的能力(瓦博格效应)被认为是癌症(包括乳腺癌)的最一致标志之一。已知，有氧糖酵解升高与乳腺肿瘤侵袭性提高和预后差密切相关。当与质谱(MS)联用时，稳定同位素标记是用于确定底物对特定代谢途径的相对贡献的有效方法，其使得能够量化具有不同同位素组成的分子的相对丰度。液相色谱(LC)-MS技术的灵敏度使得检测癌细胞中产生的极低浓度的小分子或代谢物成为可能。目前，没有方法可监测癌细胞中葡萄糖通过糖酵解的乳酸产生而不受其他代谢途径干扰。开发了基于位置同位素标记和LC-MS的方法，其可特别地测量癌细胞中葡萄糖通过糖酵解向乳酸的转化。此外，通过该方法获得的有氧糖酵解率显示与乳腺癌细胞中的葡萄糖摄取活性和乳酸浓度密切相关。该结果还示出在转移性乳腺癌细胞和小鼠早期转移性乳腺肿瘤中[3-13C]乳酸的产生显著升高，这可引起用于诊断和治疗侵袭性乳腺癌的有前景生物标志的开发。
参考文献
Ben-Sahra et al.，Science，339：1323(2013).
Chambers et al.，Nat.Biotechnol.，30：918(2012).
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Wolfender et al.，J.Chromatol.，1382：136(2015).
Zhang et al.，Oncogene，33：3375(2014).
所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。虽然在前述的说明书中已经结合本发明的某些优选实施方案描述了本发明，并且出于举例说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员来说明显的是，本发明易于有其他实施方案并且在不脱离本发明基本原理的情况下，可对本文中的某些细节作出相当大的变化。

Claims (46)

1.在包含细胞的样品中检测有氧糖酵解的体外方法，其包括：
a)提供包含从哺乳动物细胞获得之样品和经同位素标记葡萄糖的混合物；
b)使用液相色谱-质谱(LC-MS)在所述混合物中测量经同位素标记葡萄糖向经同位素标记乳酸的转化；以及
c)基于所述混合物中所述经标记乳酸的存在或量或者所述经标记葡萄糖向所述经标记乳酸的转化率来确定所述样品中所述细胞中的葡萄糖摄取、乳酸浓度或有氧糖酵解率。
2.权利要求1所述的方法，其中所述标记是13C或氘(2H)。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述经标记葡萄糖是[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6，6-氘标记葡萄糖。
4.权利要求1所述的方法，其中确定[3-13C]乳酸的存在或量、[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率或经氘标记葡萄糖向经氘标记乳酸的转化率。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品是生理样品。
6.权利要求5所述的方法，其中所述样品是活检物。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞或卵巢癌细胞。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中确定葡萄糖摄取。
9.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中确定乳酸浓度。
10.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中确定有氧糖酵解率。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中随时间测量葡萄糖摄取、乳酸浓度或有氧糖酵解率。
12.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将所述混合物中的葡萄糖摄取、乳酸浓度或有氧糖酵解率与具有对照细胞或无细胞的相应混合物进行比较。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞来自患有DCIS、侵袭前乳腺癌或转移性乳腺癌的女性。
14.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞来自患有惰性癌症、侵袭前癌症或转移性癌症的哺乳动物。
15.检测受试化合物改变有氧糖酵解的效力的体外方法，其包括：
a)使受试化合物、包含哺乳动物细胞的样品和一定量的经13C或氘标记葡萄糖相接触以提供混合物；以及
b)使用LC-MS相对于对照来测量所述混合物中所述经标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化或转化率，从而确定受试化合物改变有氧糖酵解的效力。
16.权利要求15所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述样品是活检物或生理流体样品。
18.权利要求15、16或17所述的方法，其中所述受试化合物抑制所述经标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化或转化率。
19.检测基因突变对有氧糖酵解的作用的体外方法，其包括：
a)使具有选定突变的哺乳动物细胞与一定量的经13C或氘标记葡萄相糖接触；
b)使用LC-MS来测量所述细胞中所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化；以及
c)将转化的乳酸的量与不具有所述选定突变的相应细胞中转化的乳酸的量进行比较，所述相应细胞与所述一定量的所述经13C或氘标记葡萄糖相接触。
20.检测哺乳动物癌细胞的转移潜能的方法，其包括：
a)提供包含含有癌细胞之样品和一定量经13C或氘标记葡萄糖的混合物；
b)使用LC-MS在所述混合物中测量所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化；以及
c)基于所述混合物中所述经13C或氘标记乳酸的存在或量或者所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化率来确定所述细胞是否具有提高的转移潜能。
21.权利要求20所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞或卵巢癌细胞。
22.权利要求21或22所述的方法，其中将所述混合物中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率与相应非癌细胞中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率进行比较。
23.权利要求20、21或22所述的方法，其中所述经标记葡萄糖是[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6，6-氘标记葡萄糖。
24.检测体内有氧糖酵解的方法，其包括：
a)从施用以13C或氘标记的葡萄糖的哺乳动物收集生理样品；以及
b)使用LC-MS在所述样品中测量经13C或氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值或经13C或氘标记乳酸的量，从而检测所述哺乳动物中的有氧糖酵解。
25.权利要求24所述的方法，其中所述样品是血液样品、尿样品或乳样品。
26.权利要求24所述的方法，其中所述样品是组织样品。
27.权利要求24、25或26所述的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。
28.在哺乳动物中检测或诊断侵袭前或恶变前癌症的方法，其包括：
a)提供来自施用一定量经13C或氘标记葡萄糖的哺乳动物的生理样品；以及
b)使用质谱在所述样品中测量[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值，其中相对于来自未患癌症的哺乳动物的相应样品具有升高的经标记乳酸水平的样品指示哺乳动物患有侵袭前或恶变前癌症。
29.权利要求28所述的方法，其中测量所述样品中[1-13C]乳酸/未经标记乳酸的比值。
30.权利要求28所述的方法，其中测量所述样品中经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值。
31.权利要求28、29或30所述的方法，其中所述样品是流体样品。
32.权利要求28、29或30所述的方法，其中所述样品是组织样品。
33.在哺乳动物中监测癌症复发的方法，其包括：
a)提供混合物，其包含来自进行癌症治疗的哺乳动物的包含细胞的样品和一定量的经13C或氘标记葡萄糖；
b)使用LC-MS在所述混合物中测量所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化；以及
c)基于所述混合物中所述经13C或氘标记乳酸的存在或量或者所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化率来确定所述哺乳动物是否处于复发的风险之中。
34.权利要求33所述的方法，其中所述哺乳动物是进行乳腺癌治疗的人。
35.权利要求33或34所述的方法，其中将所述混合物中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率与对照混合物或者在较早时间点从所述哺乳动物获取的一个或更多个样品中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率进行比较。
36.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述经标记葡萄糖是[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6，6-氘标记葡萄糖。
37.权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述样品是生理流体样品。
38.在患有癌症的哺乳动物中监测针对癌症治疗的治疗应答的方法，其包括：
a)提供混合物，其包含来自所述哺乳动物的包含细胞的样品和一定量的经13C或氘标记葡萄糖；
b)使用LC-MS在所述混合物中测量所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化；以及
c)基于所述混合物中所述经13C或氘标记乳酸的存在或量或者所述经13C或氘标记葡萄糖向经13C或氘标记乳酸的转化率来确定所述哺乳动物是否具有针对所述治疗的治疗应答。
39.权利要求38所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
40.权利要求38或39所述的方法，其中将所述混合物中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率与对照混合物或者在较早时间点从所述哺乳动物获取的一个或更多个样品中[3-13C]乳酸的存在或量或者[1-13C]葡萄糖向[3-13C]乳酸的转化率进行比较。
41.权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述经标记葡萄糖是[1-13C]葡萄糖、[1，2-13C2]葡萄糖、[13C6]葡萄糖或经6，6-氘标记葡萄糖。
42.权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述样品是生理流体样品。
43.权利要求38至42中任一项所述的方法，其中所述样品是生理组织样品。
44.权利要求42所述的方法，其中所述样品是血液样品、尿样品或乳样品。
45.权利要求33至44中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有乳腺癌、前列腺癌、肝癌或卵巢癌。
46.权利要求24至44中任一项所述的方法，其中确定[3-13C]乳酸/未经标记乳酸或经氘标记乳酸/未经标记乳酸的比值。
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