CN107271673A - 一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用 - Google Patents
一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用,属于多金属氧簇检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6技术领域。本发明利用EuW10和HPV E6蛋白上一段富含碱性氨基酸的小肽间的强识别相互作用,实现了对HPV E6蛋白的检测。研究发现E6小肽和蛋白均能通过与EuW10组装成球体进而促使EuW10的荧光显著增强。本发明为首例利用多金属氧簇体外检测E6蛋白的实例。本发明所利用的多金属氧簇EuW10合成方法简单,易得。本发明的检测方法检测速度快、操作简便、体系简单、信号稳定、灵敏度高、无需任何预处理,无需复杂的检测仪器。通过这一发明,我们拓展了多金属氧簇作为生物探针的应用,这对宫颈癌的癌前早期检测具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于多金属氧簇检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6技术领域,具体涉及一种利用多金属氧簇Na9[EuW10O36]·32H2O(EuW10)与E6蛋白上一段富含碱性氨基酸的小肽间相互作用为平台进行HPV早期致癌蛋白E6的体外检测。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一类能侵染人类皮肤和粘膜基底层鳞状上皮细胞的、小的、双链DNA病毒。HPV能够在女性(宫颈、阴道、外阴、肛门和口咽部)和男性(口咽、肛门和阴茎)中引起多种癌症,以及良性疾病,如生殖器疣等。全世界范围内,每年大约有500,000例宫颈癌患者发病,导致超过250,000病人死亡,这使得宫颈癌成为女性健康的第二大杀手 (The Lancet,2007,370,890-907.)。
目前,对HPV的常规筛查只是为了预知宫颈癌,而对病毒DNA的检测(通常基于PCR检测)已经被不同的国家用于宫颈癌预防计划。然而,尽管这些测试对HPVs的检测具有高灵敏性(The Lancet,2014,383,524-532.),但它们不能预测肿瘤的癌前病变。因此,目前所面临的挑战是发展能够更好区分自修复的 HPV感染和那些可能发展为癌前病变和癌症的感染的测试方法。
HPV16早期致癌蛋白E6,对宿主细胞的转化至关重要。不像HPV16的其他蛋白可以在病毒生命周期的始终不同程度的表达,E6蛋白则可以在癌前病变和癌变的组织中表达。基于此,E6蛋白成为具有诊断潜力的理想生物标记物。由于其在HPV引起的癌症(生殖器、头、颈上皮细胞)中的重要作用,可靠的基于蛋白水平的E6的检测将成为宝贵的诊断工具(Virology,2013,435, 425-432.)。大多数有用的诊断方法需要发展针对主要抗原的抗体。80年代中期,多克隆的HPV18E6抗体被用于E6蛋白的免疫沉淀反应(The EMBO journal,1987,6,989-992.)。随着单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAb)的问世,原位检测E6蛋白顺理成章的成为研究的第二步。科学家们利用mAb C1P5对 HPV18 E6在昆虫和一个重组的杆状病毒表达系统进行核、膜定位。随后的研究针对HPV16 E6开放阅读框的mAb通过免疫荧光法显示了细胞质的着色 (Yonsei Med.J.,1994,35,1-9.)。由于缺少可靠的检测方法,90年代对HPV E6 定位的研究结果都不具有代表性。在2000年代早期,抗重组HPV16 E6的新的 mAbs被生产并用于确定在转染细胞中E6的准确位置以及细胞内E6的分布是否与不依赖p53的功能有关(J.Gen.virol.,2003,84,2099-2104.)。抗体1F4, 1F1和6F4对HPV E6的免疫印迹产生了阳性反应,且免疫荧光显微镜显示在转染细胞中的核定位。然而这个研究组没能肯定的检测内源性的HPV E6蛋白。最近,这个研究小组合成了针对HPV16 E6上第二个锌结合结构域的抗体,并通过其与之前的6F4mAb(特异性针对N末端)结合抑制E6同E6AP降解p53 的过程(J.Gen.virol.,2005,86,1001-1007.)。总之,缺少HPV16 E6有效、商业可得的mAbs是目前研究者们所面临的困境。
多金属氧簇(POMs)是一类多功能、可控的无机多核金属氧簇。POMs结构的多样性使得它们在催化、材料科学和药物领域有着广泛应用。POMs也具有生物活性,能同蛋白相互作用。近年来,科学家们已经报道了一系列关于POMs 同人血清白蛋白(HSA)相互作用的研究(J.Phys.Chem.B,2007,111, 1809-1814;J.Phys.Chem.B,2007,111,11253-11259;Biomacromolecules, 2008,9,812-817.)。此外,一些POMs说有着独特的光学性质,是用作生物标记及检测的新候选。例如,含Eu的POMs具有较强且敏感的荧光,这使得它们成为有吸引力的新型生物探针(J.Biol.Inorg.Chem.,2010,15,1079-1085.)。
发明内容
本发明的目的在于利用含Eu多金属氧簇实现对HPV早期致癌蛋白E6的检测,以期实现对宫颈癌的早期检测。
本发明主要利用含Eu的多金属氧簇灵敏的荧光特性,选择了一个含有9个负电荷的多金属氧簇EuW10作为荧光探针去体外检测HPV早期致癌蛋白E6。首先,我们选择了HPV(包括HPV16和HPV31两种亚型)E6蛋白上一段富含碱性氨基酸的小肽(C末端107~126位氨基酸的一段小肽),并构建了一个该小肽和EuW10相互作用的平台。我们分别配制了1、1、2mmol/L的HPV16 E6、 HPV31 E6小肽和EuW10溶液,通过检测10μmol/L EuW10溶液随着HPV16 E6 小肽加入的荧光变化来确定二者间的相互作用。结果发现随着HPV16 E6小肽的加入,EuW10的荧光迅速增强(图2);当HPV16 E6小肽的浓度达到15μM 时,EuW10的荧光强度达到最大值,并且随着小肽浓度的继续增加,EuW10的荧光基本保持不变。此时EuW10在593nm处的荧光强度是初始荧光强度的11 倍(图3)。这一结果说明了HPV16 E6小肽能和EuW10之间发生强的相互作用。
为了进一步解释EuW10同HPV16 E6小肽的相互作用能引起EuW10荧光增强的机理,我们测了10μmol/L EuW10同HPV16 E6小肽作用的时间分辨荧光。据报道,Eu3+的荧光极易被水分子淬灭,是因为受其5D0能级态耦合OH振动能级的影响(J.Phys.Chem.A,1997,101,5046-5053.)。因此,水分子的存在能够促使5D0能级态去活化过程,从而极大缩短Eu3+的荧光寿命。若使用其他配体来取代水分子则可以阻碍这种淬灭作用(Phys.Chem.Chem.Phys.,2010,12, 1299-1304.)。基于此,我们认为EuW10跟E6小肽结合会排开Eu3+周围的水分子而使得EuW10的荧光恢复。结果所示,在MES-NaOH缓冲液中,10μM EuW10在593nm处的荧光寿命呈现一个双指数衰减的趋势(图4)。对应的两个寿命值分别为短寿命248.75μs和长寿命2439.82μs,二者所占的比例分别为 99.82%和0.18%。这一结果表明,在缓冲液中10μMEuW10主要以分散态的形式存在。然而,随着HPV16 E6小肽的加入,EuW10的荧光寿命发生了巨大的变化。EuW10荧光长寿命所占的比例迅速增加,而短寿命所占的比例则相应地减少。例如,当加入的HPV16 E6小肽的浓度达到15μM时,EuW10的两个寿命值分别为281.19μs和2728.73μs,二者所占的比例分别为3.22%和96.78%;而当体系中存在25μM HPV16 E6小肽时,EuW10的荧光寿命变为281.19μs 和2728.73μs,且保持稳定不再变化。此时,长寿命组分占主要(98.17%),也就是说在这种条件下EuW10主要以聚集态的形式存在(图5)。HPV16 E6小肽能够诱导EuW10的荧光寿命由短寿命向长寿命的变化,这一结果表明EuW10和HPV16 E6小肽分子间存在着明显的相互作用。小肽上一些氨基酸的官能团可能作为配体取代了EuW10周围的水分子,从而导致EuW10荧光寿命发生了重大的变化。
为了确定EuW10同HPV16 E6小肽相互作用的热力学数据及结合机制,我们利用等温滴定量热法研究了二者在不同温度下的作用。随着HPV16 E6小肽的不断滴入,未被小肽结合的EuW10的浓度逐渐减小,反应所放出的热量也随之减少。直到反应结束,体系几乎没有热量放出(图6)。且体系的焓变随着温度的升高而增加,这说明焓变同温度呈正相关(图7),即EuW10同HPV16 E6 小肽相互作用的恒压热容ΔCp为正值,这说明表面暴露的极性氨基酸减少, EuW10同HPV16 E6小肽的结合过程是静电和氢键相互作用驱动的。
在明确了EuW10与HPV16 E6小肽之间能通过静电相互作用结合并导致 EuW10的荧光增强之后,我们想通过透射电子显微镜更直观的观察二者组装体的形貌特征。10μM EuW10溶液中EuW10主要以分散态的形式存在,粒子大小约为2nm左右(图8A)。当向10μM EuW10溶液中滴加HPV16 E6小肽至二者的摩尔浓度比为1:0.2时,从电镜图片上可以观察到不规则的球形组装体(图 8B),当继续增大HPV16 E6小肽的浓度至EuW10与小肽的摩尔浓度比达到1:1时,EuW10与HPV16 E6小肽的组装体进一步交联聚集形成更紧密的球形聚集体(图8C)。继续增大HPV16 E6小肽的浓度至EuW10与小肽的浓度比为1: 2.5时,可以观察到更大的球形组装体,粒径在180~220nm之间(图8D)。这一结果说明高浓度的HPV16 E6小肽能够引起EuW10组装成更大粒径的组装体。电镜结果直观可见的展示了HPV16 E6小肽和EuW10间确实发生了相互作用。
HPV16 E6小肽同EuW10相互作用的一系列结果为利用EuW10进行HPV16 E6蛋白的检测提供了可能。10μmol/L EuW10同大肠杆菌中重组的HPV16 E6 蛋白的相互作用首先通过荧光滴定响应来检测。结果发现,随着HPV16 E6蛋白浓度的增加,EuW10的荧光强度显著增强(图14)。同E6小肽的荧光结果类似,当E6:EuW10的浓度比达到2.7:1时,EuW10的荧光增强达到最大值,且不再随着E6蛋白浓度的增加而增强。此时,EuW10的荧光强度是初始荧光强度的23倍(图15)。值得注意的是,由HPV16 E6蛋白所引起的EuW10的荧光增强倍数大于E6小肽的,这可能是由于蛋白含有更多的正电荷而对多酸起到更大的保护。这一结果说明EuW10同碱性蛋白E6之间存在着强烈的相互作用,这为使用EuW10作为荧光探针去检测HPV E6蛋白提供了一个强有力的证据。最后, E6蛋白浓度在0~20μM的范围时,EuW10的荧光呈线性响应,这时所计算的荧光检测限为0.28μM(图16)。这里所获得的检测限为使用无机材料去检测HPV E6蛋白提供了一个新的荧光方法,成为首个利用多金属氧簇去检测E6蛋白的应用。为了进一步证明EuW10同HPV E6蛋白间的结合,我们测了10μmol/L EuW10的时间分辨荧光衰减曲线(图17)。结果发现,HPV16 E6蛋白的存在使得EuW10在593nm处的荧光衰减有着明显的改变。而且曲线拟合揭示了两个寿命所占的比例随着E6浓度改变的变化。随着E6的加入,EuW10荧光长寿命所占的比例显著增加,而短寿命所占的比例则相应地减少。最后长寿命所占的比例占主要,大约占94.17%(图18)。这说明HPV16 E6能够引起EuW10的聚集,从而通过排开Eu3 +周围的水分子而使EuW10的荧光显著增强。
等温滴定量热的方法用于测HPV16 E6蛋白同EuW10的结合过程以给出二者相互作用的热力学数据。25℃下,开始时二者的结合放热量为Hi~-5.04 kcal/mol,这比小肽同EuW10结合的放热量略低,可能是由于蛋白的稀释浓度更大导致的。随着EuW10的不断滴入,未被结合的E6蛋白的浓度逐渐减小,反应所放出的热量也随之减少。直到反应结束,体系几乎没有热量放出(图19)。同 E6小肽相比,25℃时,E6蛋白同EuW10之间有着更大的结合数n,这说明每个E6蛋白需要更多的EuW10饱和。然而E6蛋白同EuW10之间的结合平衡常数却比E6小肽的小,这可能是由蛋白的空间效应引起的。结合上述的n值,我们推测E6蛋白同EuW10的结合不仅仅局限于我们所选的这段小肽,E6蛋白上的其他碱性氨基酸可能也参与了同EuW10的结合,然而,由于蛋白大分子的空间效应实际上损害了二者间的结合亲和力。除此之外,在ITC结果上所观察到的蛋白的很强的放热可推测蛋白同EuW10的相互作用也是电荷相互作用。
为了更直观的观测EuW10同E6蛋白组装体的形貌,我们通过透射电子显微镜检测了二者不同浓度比时的形貌。结果发现,当E6跟EuW10的浓度比为0.2:1 时,只能观察到分散的球形组装体(图20B);当继续加大E6的浓度至E6: EuW10=1:1时,球形组装体之间形成交联状态(图20C)。这说明HPV16 E6 确实能同EuW10发生强烈的相互作用,致使EuW10的荧光及荧光寿命产生了极大的增强,二者形成的组装体的形貌也发生了不小改变。因此,利用EuW10作为探针去检测HPV16 E6的实验方法是可行的。同时,根据此实验结果,我们利用同样的检测手段对HPV31亚型的E6蛋白上相同位置的一段小肽进行了检测,结果同HPV16 E6亚型小肽的结果类似,因此我们可以推测EuW10也可用于HPV31 E6蛋白的检测。
本发明为首例利用多金属氧簇体外检测E6蛋白的实例。目前对HPV E6蛋白的检测大都基于抗原抗体检测,这种检测方法操作繁琐、条件严格,最重要的是缺少有效、商业可得的单克隆抗体。而本发明所利用的多金属氧簇EuW10合成方法简单,易得。本发明的检测方法检测速度快、操作简便、体系简单、信号稳定、灵敏度高、无需任何预处理,无需复杂的检测仪器。通过这一发明,我们拓展了多金属氧簇作为生物探针的应用,这对宫颈癌的癌前早期检测具有重要的意义。
附图说明
图1:经表达纯化后获得的切去GST标签的E6蛋白的SDS-PAGE图及带 GST标签的E6蛋白的Western-Blot图。
图2:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6小肽(0,1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,16,20,22,26μmol/L)相互作用的荧光发射光谱图。
图3:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6小肽(0,1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,16,20,22,26μmol/L)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图;横坐标为小肽浓度,纵坐标为EuW10在593nm处荧光发射强度。
图4:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6小肽(0,5, 10,15,20,25μmol/L)相互作用的时间分辨荧光光谱图。
图5:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6小肽(0,5,10,15,20,25μmol/L)相互作用的荧光寿命变化图。
图6:不同温度下,EuW10溶液(4.0×10-5mol/L)与HPV16 E6小肽(6.0×10-4 mol/L)相互作用的等温量热滴定曲线及对应的热量拟合曲线。A.25℃时, HPV16 E6小肽滴定EuW10的等温量热滴定曲线(上)及对应的热量拟合曲线 (下);B.15℃时,HPV16 E6小肽滴定EuW10的等温量热滴定曲线(上)及对应的热量拟合曲线(下);C.5℃时,HPV16 E6小肽滴定EuW10的等温量热滴定曲线(上)及对应的热量拟合曲线(下)。
图7:EuW10溶液(4.0×10-5mol/L)与HPV16 E6小肽(6.0×10-4mol/L) 相互作用的焓变随温度变化的曲线图。
图8:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6小肽相互作用的透射电子显微镜照片。A.1.0×10-5mol/L EuW10溶液单独存在时的透射电子显微镜照片;B.1.0×10- 5mol/L EuW10与2.0×10-6mol/L HPV16 E6小肽相互作用的透射电子显微镜照片;C.1.0×10-5mol/L EuW10与1.0×10-5mol/L HPV16 E6 小肽相互作用的透射电子显微镜照片;D.1.0×10-5mol/L EuW10与2.5×10-5 mol/L HPV16 E6小肽相互作用的透射电子显微镜照片。
图9:EuW10溶液(3.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV31 E6小肽(0、3、 6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45μmol/L)相互作用的荧光发射光谱图。
图10:EuW10溶液(3.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV31 E6小肽(0、3、 6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45μmol/L)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图;横坐标为小肽浓度,纵坐标为 EuW10在593nm处荧光发射强度。
图11:EuW10溶液(3.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV31 E6小肽(0、6、 9、12、15、18、21、24、27μmol/L)相互作用的时间分辨荧光光谱图。
图12:EuW10溶液(3.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV31 E6小肽(0、6、 9、12、15、18、21、24、27μmol/L)相互作用的荧光寿命变化图。
图13:EuW10溶液(3.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV31 E6小肽相互作用的透射电子显微镜照片。A.1.0×10-5mol/L EuW10溶液单独存在时的透射电子显微镜照片;B.1.0×10- 5mol/L EuW10与1.0×10-5mol/L HPV31 E6小肽相互作用的透射电子显微镜照片;C.1.0×10-5mol/L EuW10与2.5×10-5mol/L HPV31 E6 小肽相互作用的透射电子显微镜照片。
图14:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6蛋白(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μmol/L)相互作用的荧光发射光谱图。
图15:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6蛋白(0、2、 4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μmol/L)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图;横坐标为蛋白浓度,纵坐标为EuW10在593nm处荧光发射强度。
图16:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与低浓度HPV16 E6蛋白相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图;其横坐标为E6蛋白浓度,纵坐标为其在593nm处荧光发射强度。
图17:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6蛋白(0、2、 5、10、15、20μmol/L)相互作用的时间分辨荧光光谱图。
图18:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6蛋白(0、2、 5、10、15、20μmol/L)相互作用的荧光寿命变化图。
图19:25℃时,EuW10溶液(1.5×10-3mol/L)与HPV16 E6蛋白(2.0×10-5 mol/L)相互作用的等温量热滴定曲线及对应的热量拟合曲线。
图20:EuW10溶液(1.0×10-5mol/L)与不同浓度HPV16 E6蛋白相互作用的透射电子显微镜照片。A.1.0×10-5mol/L EuW10溶液单独存在时的透射电子显微镜照片;B.1.0×10- 5mol/L EuW10与2.0×10-6mol/L HPV16 E6蛋白相互作用的透射电子显微镜照片;C.1.0×10-5mol/L EuW10与1.0×10-5mol/L HPV16 E6 蛋白相互作用的透射电子显微镜照片。
具体实施方式
本发明中使用的人乳头瘤病毒(HPV16、HPV31)E6小肽是位于E6蛋白 C末端107~126处的一段天然氨基酸序列,均购自上海楚肽生物科技有限公司,高效液相色谱(HPLC)分析报告给出其纯度分别高于99.01%、99.13%,其氨基酸序列为QKPLCPEEKQRHLDKKQRFH和QRPLCPEEKQRHLDKKKRFH。 EuW10是一种较为常见的多金属氧簇,其合成与表征方法遵循参考文献(J. Chem.SOC.(A),1971,1836-1839.)。2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)购自美国Sigma公司。HPV16 E6小肽、多金属氧簇EuW10经称量后分别加入市售娃哈哈纯净水配成浓度为1mmol/L、2mmol/L的储备液。MES-NaOH缓冲液(10 mmol/L MES,NaOH调节溶液pH=6.0):市售娃哈哈水配制。人乳头瘤病毒 (HPV16)E6蛋白的表达、纯化过程遵循参考文献(ProteinEng.,2001,14, 297~305;J.Virol.,2004,78,12366~12377;Nature,2016,529,541~545.)。
实施例1:
将编码151个氨基酸的HPV16 E6 4C/4S突变体 (MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCI VYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYSYSLYGTTLEQQYNKPLSDLLIRCIN CQKPLSPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCSRSSRTRRETQL)基因按照基因工程的方法克隆(Nature,2016,529,541-545.)到质粒pGEX-6p-1 载体,并将0.5μL此质粒转化到50μL大肠杆菌XA90的感受态细胞中,利用含有50mg/mL Amp的LB固体培养基(配比:100mL水中加1g蛋白胨,0.5 g酵母粉,1g氯化钠,1.5g琼脂粉)进行单克隆菌落的筛选,并在37℃的恒温培养箱中培养过夜。挑单克隆菌落加入到5mL含有50mg/mL Amp的LB培养基中(配比:100mL水中加1g蛋白胨,0.5g酵母粉,1g氯化钠),在37℃恒温培养摇床中以220rpm的速度震荡培养14h。取1mL上述菌液加入到1L 含有50mg/mL Amp的新的LB培养基中,继续在37℃恒温培养摇床中以180 rpm的速度震荡培养4h,当细胞生长密度达到OD600在0.8时,加入终浓度为0.2mM的IPTG,并在20℃恒温培养摇床中以180rpm的速度震荡培养18h,以诱导含GST标签的目的蛋白的表达。将培养了18h的菌液收集到1L的离心筒中,并在大容量冷冻离心机中以4℃,6000×g的条件离心30分钟,弃上清,加20mL缓冲液(50mM Tris-HCl,0.2M NaCl,2mMDTT,pH 6.8)重悬菌体,离心弃上清,加50mL缓冲液重悬菌体。
将重悬的菌液置于冰水混合物中,用超声波细胞破碎仪进行细胞裂解,裂解有效时间为30分钟;超声完毕后,将细胞裂解液均分到两个50mL离心筒中,配平后在高效冷冻离心机中以4℃,16000×g的条件离心30分钟,将上清和包涵体分离。之后将上清经孔径为0.45μm的滤膜过滤除杂后加入到GST亲和层析柱中进行GST融合蛋白的纯化,GST亲和层析柱提前用10倍柱体积的缓冲液平衡,待上样完毕,用20倍柱体积的缓冲液分三次冲洗柱料以洗去柱料上未结合的杂质;随后向GST亲和层析柱中加入200U的PPase,于4℃环境孵育消化14小时。利用MES-NaOH缓冲液将酶切过夜的蛋白洗脱下来,并通过 SDS-PAGE和Western-blot对所获得的HPV16 E6蛋白进行了鉴定。所得E6 蛋白浓度通过BCA蛋白浓度检测方法标定,并利用超滤离心浓缩蛋白至浓度为 50×10-6mol/L。经上述一系列步骤,可获得纯的HPV16 E6蛋白进行后续实验。
实施例2:
将8.3g Na2WO4·2H2O溶解于20mL水中,用CH3COOH调节溶液pH至 7.0。随后,将2mL含有1.1g Eu(NO3)3·6H2O的水溶液在90℃搅拌条件下逐滴滴加到上述溶液中。室温下冷却后可析出无色晶体Na9[EuW10O36]·32H2O (EuW10),质量为6.58g。
实施例3:
取3.39mg实施例2得到的无色晶体EuW10溶于1mL娃哈哈纯净水中配成浓度为2mmol/L的储备液,将10μL EuW10储备液加入到1990μL MES-NaOH缓冲液中,充分混匀。向混合后的溶液中逐渐滴加HPV16 E6小肽储备液,使其终浓度分别为0~26μmol/L(0,1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,12,16,20,22,26μmol/L),每加完一个浓度后用涡旋振荡器充分振荡混匀样品,并于室温下放置5分钟。之后利用荧光光谱仪记录多金属氧簇EuW10溶液对不同浓度的HPV16 E6小肽响应的荧光发射光谱(激发波长265nm)。如图1所示,随着HPV16 E6小肽浓度的增加,EuW10溶液在593nm和619nm 处的荧光发射峰强度迅速增加。同时绘制该体系荧光发射强度(593nm)与 HPV16 E6小肽浓度的关系曲线图(如图2所示)。
实施例4:
取3.39mg实施例2得到的无色晶体EuW10溶于1mL娃哈哈纯净水中配成浓度为2mmol/L的储备液,取10μL EuW10储备液加入到1990μL MES-NaOH缓冲液中,充分混匀。向混合后的溶液中逐渐滴加HPV16 E6小肽储备液,使其终浓度分别为0~25μmol/L(0,5,10,15,20,25μmol/L),每加完一个浓度后用涡旋振荡器充分振荡混匀样品,并于室温下放置5分钟。之后利用时间分辨荧光光谱记录多金属氧簇EuW10荧光寿命的变化情况(激发波长265nm,发射波长593nm)。如图3所示,随着HPV16 E6小肽的加入,EuW10的荧光寿命发生了显著的变化,长寿命所占的比例迅速增加,短寿命所占的比例则相应地减少(图4),HPV16 E6小肽能够促使EuW10的荧光寿命由短寿命向长寿命的变化。
实施例5:
取120μL E6小肽储备液并向其中加入80μL MES-NaOH缓冲液配成浓度为600μmol/L的小肽溶液备用;取20μL EuW10储备液并向其中加入580μL 娃哈哈水和400μL MES-NaOH缓冲液配成浓度为40μmol/L的EuW10溶液备用。向等温滴定微量热仪的样品池中加入200μL配好的EuW10溶液,进样针吸取40μL配好的E6小肽溶液,待进样完毕后进行等温滴定反应。滴定时,将1μL 进样针中的样品每隔两分钟加入到样品池中,转速设为1000rpm,每两滴之间的时间间隔为120s,总滴数为35滴,测试温度为5、15、25℃三个梯度。通过系统自带的Origin软件对每滴样品的热量峰进行拟合并对基线进行校正。利用一态结合模式拟合所放出的热量可以获得标准的结合热力学常数——化学反应计量数(n),反应结合常数(Ka),焓变(ΔH)和熵变(ΔS)。其他热力学常数通过公式:ΔG=ΔH-TΔS或ΔG=-RT ln Ka计算得到。其中T为绝对温度, R=8.3151J mol-1K-1。由热力学数据可知焓变与温度呈正相关,这说明E6小肽同EuW10之间相互作用的主要驱动力是静电相互作用。
实施例6:
取4μL EuW10储备液向其中加入796μL娃哈哈水,充分混匀后将其均分为四份。分别向其中加入0、0.4、2、5μL E6小肽储备液至小肽终浓度为0、2、 10、25μmol/L,振荡充分混匀后静置2h。分别取一滴上述四种溶液滴到培养皿中备好的四个铜网上,静置1分钟后,用滤纸吸去多余液体,静置过夜(8h) 后进行透射电子显微镜的表征。如图6所示,E6小肽能够诱导EuW10组装成球形组装体,并且随着小肽浓度的增加球形组装体越大。
实施例7:
取30μL EuW10储备液加入到1970μL MES-NaOH缓冲液中,充分混匀。向混合后的溶液中逐渐滴加HPV31 E6小肽,使其终浓度分别为0~45μmol/L (0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45μmol/L),每加完一个浓度后用涡旋振荡器充分振荡混匀样品,并于室温下放置5分钟。之后利用荧光光谱仪记录多金属氧簇EuW10溶液对不同浓度的HPV31 E6小肽响应的荧光发射光谱(激发波长265nm)。如图7所示,随着HPV31 E6小肽浓度的增加,EuW10溶液在593nm和619nm处的荧光发射峰强度迅速增加。同时绘制了该体系荧光发射强度(593nm)与HPV31 E6小肽浓度的关系曲线图 (如图8所示)。
实施例8:
取30μL HPV31 E6小肽储备液加入到1970μL MES-NaOH缓冲液中,充分混匀。向混合后的溶液中逐渐滴加HPV31 E6小肽,使其终浓度分别为0~27 μmol/L(0、6、9、12、15、18、21、24、27μmol/L),每加完一个浓度后用涡旋振荡器充分振荡混匀样品,并于室温下放置5分钟。之后利用时间分辨荧光光谱记录多金属氧簇EuW10荧光寿命的变化情况(激发波长265nm,发射波长 593nm)。如图9所示,随着E6小肽的加入,EuW10的荧光寿命发生了显著的变化,长寿命所占的比例迅速增加,短寿命所占的比例则相应地减少(图10), E6小肽能够促使EuW10的荧光寿命由短寿命向长寿命的变化。
实施例9:
取9μL EuW10储备液向其中加入591μL娃哈哈水,充分混匀后将其均分为三份。分别向其中加入0、1.5、7.2μL HPV31 E6小肽储备液至小肽终浓度为0、7.5、36μmol/L,振荡充分混匀后静置2h。分别取一滴上述四种溶液滴到培养皿中备好的四个铜网上,静置1分钟后,用滤纸吸去多余液体,静置过夜 (8h)后进行透射电子显微镜的表征。如图11所示,E6小肽能够诱导EuW10组装成球形组装体,并且随着小肽浓度的增加球形组装体越大。
实施例10:
取10μL EuW10储备液加入到1990μL MES-NaOH缓冲液中,充分混匀。向混合后的溶液中逐渐滴加实施例1制备的HPV16 E6蛋白,使其终浓度分别为0~40μmol/L(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、 40μmol/L),每加完一个浓度后用涡旋振荡器充分振荡混匀样品,并于室温下放置5分钟。之后利用荧光光谱仪记录多金属氧簇EuW10溶液对不同浓度的 HPV16 E6蛋白响应的荧光发射光谱(激发波长265nm)。如图12所示,随着 HPV16 E6蛋白浓度的增加,EuW10溶液在593nm和619nm处的荧光发射峰强度迅速增加。同时绘制了该体系荧光发射强度(593nm)与HPV16 E6蛋白浓度的关系曲线图(如图13所示)。
实施例12:
为了进一步证明E6蛋白同EuW10之间的相互作用,我们利用时间分辨荧光测了二者之间的相互作用。取10μL EuW10储备液加入到1990μL MES-NaOH 缓冲液中,充分混匀。向混合后的溶液中逐渐滴加HPV16 E6蛋白,使其终浓度分别为0~20μmol/L(0、2、5、10、15、20μmol/L),每加完一个浓度后用涡旋振荡器充分振荡混匀样品,并于室温下放置5分钟。之后利用时间分辨荧光光谱记录多金属氧簇EuW10荧光寿命的变化情况(激发波长265nm,发射波长593nm)。如图15所示,随着E6蛋白的加入,EuW10的荧光寿命发生了显著的变化,长寿命所占的比例迅速增加,短寿命所占的比例则相应地减少(图16), E6蛋白(E6蛋白C末端107~126处的一段天然氨基酸序列,蛋白序列: MFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIV YRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYSYSLYGTTLEQQYNKPLSDLLIRCINCQKPLSPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCSRSSRTRRETQL;小肽序列:QKPLCPEEKQRHLDKKQRFH,两处红字的内容并不一致呀!这是因为我们表达蛋白的时候为了提高蛋白的可溶性表达用的是4C/4S突变体基因,不一致的位置是因为我们在构建蛋白表达基因的时候突变了那个基因)也能够促使 EuW10的荧光寿命由短寿命向长寿命的变化,这一结果表明EuW10和E6蛋白间存在着明显的相互作用。
实施例13:
取10μL HPV16 E6蛋白并向其中加入125μL MES-NaOH缓冲液、365μL 娃哈哈纯净水配成浓度为20μmol/L的蛋白溶液备用;取75μL EuW10储备液并向其中加入25μL MES-NaOH缓冲液配成浓度为1.5mmol/L的EuW10溶液备用。向等温滴定微量热仪的样品池中加入200μL配好的E6蛋白溶液,进样针吸取40μL配好的EuW10溶液,待进样完毕后进行等温滴定反应。滴定时,将1 μL进样针中的样品每隔两分钟加入到样品池中,转速设为1000rpm,每两滴之间的时间间隔为120s,总滴数为35滴,测试温度为25℃。通过系统自带的 Origin软件对每滴样品的热量峰进行拟合并对基线进行校正。利用一态拟合对滴定曲线进行拟合可以得到化学反应计量数(n),反应结合常数(Ka),焓变(ΔH) 和熵变(ΔS)。其他热力学常数通过公式:ΔG=ΔH-TΔS或ΔG=-RT ln Ka计算得到。其中T为绝对温度,R=8.3151J mol-1K-1。
实施例14:
取3μL EuW10储备液向其中加入597μL娃哈哈水,充分混匀后将其均分为三份。分别向其中加入0、0.4、2μL E6蛋白至蛋白终浓度为0、2、10μmol/L,振荡充分混匀后静置2h。分别取一滴上述四种溶液滴到培养皿中备好的四个铜网上,静置1分钟后,用滤纸吸去多余液体,静置过夜(8h)后进行透射电子显微镜的表征。如图18所示,E6蛋白也能够诱导EuW10组装成球形组装体,并且随着蛋白浓度的增加球形组装体越大。
还需要说明的是,本发明的具体实施例只是用来示例性说明,并不以任何方式限定本发明的保护范围,本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化,但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。
为了利用EuW10(富含负电荷)体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6,我们首先确定EuW10能否同E6蛋白上一段富含碱性氨基酸(含正电荷)能否发生相互作用,通过直接检测EuW10同E6小肽作用的荧光变化,发现E6小肽能够引起EuW10的荧光显著增强,为了进一步验证二者的相互作用,我们利用时间分辨荧光、等温量热滴定以及透射电子显微镜更确定了二者确实能够发生相互作用。在明确了EuW10能够同E6蛋白上一段小肽发生强烈的相互作用之后,我们推测EuW10也能同E6蛋白发生相互作用,因此我们首先对EuW10的荧光进行了检测,发现随着E6蛋白的加入,EuW10的荧光发生了更显著的增强。随后,我们同样利用时间分辨荧光、等温量热滴定以及透射电子显微镜对二者的相互作用进行了验证,结论同EuW10与E6小肽相互作用类似。因此,我们发现了利用 EuW10可以体外检测人乳头瘤病毒16早期致癌蛋白E6。
之后我们又换了一种亚型——HPV31 E6蛋白上相同位置的一段小肽,发现 HPV31E6小肽也能同EuW10发生类似的作用,因此我们推测EuW10也能够检测HPV31 E6蛋白。
Claims (3)
1.一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用。
2.如权利要求1所述的一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用,其特征在于:含Eu的多金属氧簇为Na9[EuW10O36]·32H2O。
3.如权利要求1所述的一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用,其特征在于:人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6为HPV16E6蛋白或HPV31E6蛋白。
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