CN113583673B - 基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针及其在检测精胺中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针及其在检测精胺中的应用,属于荧光探针技术领域。本发明利用超分子组装策略,以环境敏感的多金属氧酸盐EuW10作为荧光团,通过引入HPV E6的一个肽段GL‑22构建组装体,实现了特异性识别检测精胺(Spm)。EuW10/GL‑22组装体可有效地区分精胺(Spm)和亚精胺(Spd),从而实现对Spm的特异性响应。EuW10/GL‑22组装体对精胺的线性响应范围为0.05~0.6μmol/L,检出限为2.2nmol/L。该方法在检测微量精胺生物标志物方面响应快速、灵敏度高、特异性强。因此,通过超分子组装策略能够有效改善探针的检测性能,实现生物源多胺的高灵敏性检测。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域,具体涉及一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针及其在检测精胺中的应用。
背景技术
精胺(Spermine,Spm)是一种典型的多胺,存在于所有生物的真核细胞中,在细胞生长、增殖甚至蛋白质合成中发挥着重要作用。尿液中Spm含量的增加与恶性肿瘤有直接关系,这使其成为肿瘤发生的标志和化疗的重要指标。此外,精胺也是食品毒性的关键因素,它在较高浓度下会导致食品变质从而引起食物中毒。鉴于Spm水平是判断人类健康和临床诊断的重要指标,因此开发高效检测精胺策略具有重要的意义。然而,生物多胺的相似结构和性质给鉴别带来了巨大的挑战。因此,开发一种简便、有选择性、高灵敏性检测Spm的荧光探针一直是人们关注的问题。
多金属氧酸盐(POMs)是一类无机金属氧簇,具有独特的电子、光学、磁性和催化性能,在化学工业、杂化材料、纳米技术等领域显示出潜在的应用前景。近年来,POMs在抗菌、抗癌、抗病毒和抗肿瘤等方面表现出较高的生物活性。因此,POMs与多肽等生物分子相互作用的研究受到了广泛的关注。研究表明,在POMs体系结构中嵌入金属离子的大小、形状和性质等因素是控制其作用的关键因素。特别含铕(Eu(III))的POMs对微环境非常敏感,可以与HPV16衣壳蛋白的阳离子多肽通过静电相互作用和氢键形成自组装球体,导致含Eu(III)的POMs发光显著增强。基于此,可构建一个POMs和多肽的二元体系,通过它们之间的竞争作用来特异性识别受体生物多胺。通过荧光光谱便捷、高效地监测其响应灵敏度,为小分子识别搭建了良好的平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针及其在检测精胺中的应用。
本发明通过无机含Eu(III)的多金属盐酸盐与多胺的自组装诱导产生大幅度荧光增强,实现了对多胺的特异性识别,但它不能区分Spm和Spd。进一步引入GL-22,EuW10和GL-22在水中自发组装形成组装体EuW10/GL-22,该组装体探针实现了特异性识别Spm,该方法在临床检测微量精胺生物标志物方面适用性强。因此,本发明构建的超分子组装策略能够高灵敏特异性检测生物源多胺,这是一种低成本、简便的传感策略,可满足生物和临床需求。
本发明主要基于多金属氧酸盐(分子式:Na9[EuW10O36]·32H2O,简称EuW10)荧光探针在吗啉乙磺酸-氢氧化钠(MES-NaOH)缓冲溶液中对精胺(Spm)进行检测。在含有EuW10荧光探针的MES-NaOH缓冲溶液中,我们分别引入不同类型的多胺(如精胺(Spermine,简称Spm),亚精胺(Spermidine,简称Spd),腐胺(Putrescine,简称Put)),荧光光谱图结果表明,不同类型多胺的荧光响应程度不同(其中对Spm的响应尤为强烈,而对Put基本无响应)。鉴于EuW10荧光探针对Spd的荧光也有部分增强,不易区分,我们进一步引入HPV小肽(GL-22)作为辅助剂,构筑的EuW10/GL-22荧光探针对Spm表现出荧光大幅度增强,而对Spd和Put基本无响应,从而实现对Spm的高选择性识别。与EuW10相比,采用EuW10/GL-22组装的新策略显著提高了对Spm与Spd的区分性,从而实现了灵敏特异性检测Spm。本发明进一步阐明EuW10与多肽在分子水平上的结合机制,有助于了解无机化学物质的生物活性,从而促进多功能靶向剂的设计,用于疾病的诊断与治疗。
与传统方法相比,本发明所述的一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针(EuW10/GL-22)检测Spm的响应速度快、操作简便、灵敏度高、无需预处理、无需复杂的检测仪器,在医疗诊断和生物样品分析等领域具有非常重要的意义,尤其是在肿瘤发生的标志和化疗的指标评估方面有着非常广阔的应用前景。
本发明所述的一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针(EuW10/GL-22),其是由如下方法制备得到:将多金属氧酸盐(EuW10)用MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)配制得到浓度为2mmol/L的多金属氧酸盐母液,再用MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)稀释至40倍体积,得到浓度为50.0μmol/L的EuW10荧光探针溶液;取1mL浓度为50.0μmol/L的EuW10荧光探针溶液,向其中加入终浓度为0.5~50.0μmol/L的HPV小肽(GL-22),从而制备得到组装体EuW10/GL-22荧光探针溶液。
本发明所述的一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针(EuW10/GL-22)可以用于检测精胺。
附图说明
图1:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同浓度腐胺(Put)(0.25~250μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。(由下及上,随着Put浓度的增加,591nm处谱峰强度增加,以下图都同。)
图2:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同浓度亚精胺(Spd)(0.25~250μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图3:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同浓度精胺(Spm)(0.25~250μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图4:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同浓度(0.25~250μmol/L)多胺(Put,Spd,Spm)相互作用的荧光发射强度与浓度的响应关系曲线图;其横坐标为多胺浓度,纵坐标为其在591nm处荧光发射强度。
图5:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同类型多胺(50.0μmol/L)相互作用的荧光发射强度变化柱状图;其横坐标为多胺类型(Put,Spd,Spm),纵坐标为其在591nm处荧光发射强度。
图6:低浓度的EuW10荧光探针溶液(10.0μmol/L)与不同浓度精胺(Spm)(0.05~0.60μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图7:低浓度的EuW10荧光探针溶液(10.0μmol/L)与不同浓度精胺(Spm)(0.05~0.60μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系图;其横坐标为Spm浓度,纵坐标为其在591nm处荧光发射强度变化。绘制Spm在591nm处的浓度依赖性荧光强度变化曲线并进行线性拟合,根据3σ/k方程,对Spm的最低检出限为0.56nmol/L。
图8:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同浓度HPV小肽(GL-22)(0.50~50.0μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图9:EuW10荧光探针溶液(50.0μmol/L)与不同浓度HPV小肽(GL-22)(0.50~50.0μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射强度与浓度的响应关系曲线图;其横坐标为GL-22浓度,纵坐标为其在591nm处荧光发射强度。
图10:EuW10/GL-22荧光探针溶液(50.0μmol/25.0μmol)与不同浓度腐胺(Put)(0.25~250μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图11:EuW10/GL-22荧光探针溶液(50.0μmol/25.0μmol)与不同浓度亚精胺(Spd)(0.25~250μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图12:EuW10/GL-22荧光探针溶液(50.0μmol/25.0μmol)与不同浓度精胺(Spm)(0.25~250μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图13:EuW10/GL-22荧光探针溶液(50.0μmol/25.0μmol)与不同浓度(0.25~250μmol/L)多胺(Put,Spd,Spm)相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系曲线图;其横坐标为多胺浓度,纵坐标为其在591nm处荧光发射强度。
图14:EuW10/GL-22荧光探针溶液(50.0μmol/25.0μmol)与不同浓度精胺(Spm)(0.05~35.0μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射强度与浓度的线性拟合关系图;其横坐标为Spm浓度,纵坐标为其在591nm处荧光发射强度。
图15:EuW10/GL-22荧光探针溶液(50.0μmol/25.0μmol)与不同类型多胺(35.0μmol/L)相互作用的荧光发射强度柱状图;其横坐标为多胺类型(Put,Spd,Spm),纵坐标为其在591nm处荧光发射强度。
图16:低浓度的EuW10/GL-22荧光探针溶液(10.0μmol/5.0μmol)与不同浓度精胺(Spm)(0.05~0.50μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射光谱图。
图17:低浓度的EuW10/GL-22荧光探针溶液(10.0μmol/5.0μmol)与不同浓度精胺(Spm)(0.05~0.50μmol/L)在MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH 6.5)中相互作用的荧光发射强度与浓度的线性响应关系图;其横坐标为Spm浓度,纵坐标为其在591nm处荧光发射强度变化。绘制Spm在591nm处的浓度依赖性荧光强度变化并进行线性拟合,根据3σ/k方程,对Spm的最低检出限为2.2nmol/L。
具体实施方式
本发明中使用的腐胺(Putrescine,简称Put),亚精胺(Spermidine,简称Spd),精胺(Spermine,简称Spm)等化学试剂都购自美国Aladdin Chemical公司;HPV小肽GL-22(序列为:GRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL)购自上海楚肽生物科技有限公司。另外,EuW10是参照文献(J.Chem.Soc.A 1971,1836-1839.)方法合成,并利用所配MES-NaOH缓冲液(10.0mmol/L,pH6.5,配置方法:将吗啉乙磺酸固体溶剂溶于超纯水中得到浓度为10.0mmol/L的溶液,用氢氧化钠调节pH为6.5。)稀释获得浓度为2.0mmol/L的多金属氧酸盐母液。Put、Spd、Spm等分别称量后,加入二次蒸馏水获得浓度为10.0mmol/L的母液。
实施例1
多金属氧酸盐(EuW10)荧光探针检测溶液中精胺(Spm)的方法:将浓度为2.0mmol/L的EuW10母液用已配置的pH=6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释至40倍体积,配制成EuW10浓度为50.0μmol/L的溶液。分别取1mL该荧光探针溶液,向每1mL荧光探针溶液中分别加入不同类型的多胺的母液,使其终浓度分别为0~250μmol/L(0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、5.00、10.0、15.0、25.0、35.0、50.0、100、150、200、250μmol/L),并利用荧光光谱仪记录荧光探针溶液对不同浓度的多胺响应的荧光发射光谱(激发波长为500nm)。如图1(Put)、图2(Spd)和图3(Spm)所示,随着不同类型多胺浓度的增加,其在591nm处的荧光发射峰强度变化幅度不同。同时,通过绘制该体系荧光发射强度(591nm)与多胺(Put,Spd,Spm)浓度的关系曲线图(如图4所示),进而利用该线性关系可实现EuW10荧光探针对多胺的检测,当多胺浓度为50.0μmol/L时,荧光增强达到饱和,其中对于精胺的响应较灵敏(相比于无Spm时荧光增强21.92倍),对于亚精胺有小范围荧光增强响应(增强2.73倍),而对于腐胺基本无响应(如图5)。因此EuW10荧光探针能够用来检测精胺。
实施例2
将浓度为2.0mmol/L的EuW10母液用已配置的pH=6.5MES-NaOH缓冲溶液稀释至200倍体积,配制成10.0μmol/L低浓度的溶液,分别取1mL作为荧光探针溶液。向每1mL荧光探针溶液中分别加入浓度为10.0mmol/L的精胺(Spm)母液,使其终浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60μmol/L,并利用荧光光谱仪记录该荧光探针溶液对不同浓度的Spm响应的荧光发射光谱(激发波长为500nm)(如图6所示)。并绘制该体系的荧光发射强度(591nm)与Spm浓度的关系曲线图,进一步通过线性拟合即可获得该EuW10对Spm的荧光检测线性关系(如图7所示),发现其对Spm浓度具有较好的线性依赖关系。进而计算出该EuW10荧光探针对Spm的检测限为0.56nmol/L。因此本发明EuW10荧光探针可以高灵敏度地检测Spm。
实施例3
构筑EuW10/GL-22荧光探针组装体:取1mL实施例1配制的浓度为50.0μmol/L的EuW10荧光探针溶液,向每1mL荧光探针溶液中分别加入不同浓度的GL-22(固体GL-22溶于超纯水制备得到2.0mmol//L的储备液),GL-22的最终浓度分别为0~50.0μmol/L(0、0.5、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0μmol/L),并利用荧光光谱仪记录荧光探针溶液对不同浓度的GL-22响应的荧光发射光谱(激发波长为500nm)。如图8所示,随着GL-22浓度的增加,其在591nm处的荧光发射峰强度逐渐增强。同时,通过绘制该体系荧光发射强度(591nm)与GL-22浓度的关系曲线图(如图9所示),我们发现其对Spm浓度具有较好的线性依赖关系,当GL-22浓度为25.0μmol/L时,荧光增强达到饱和(增强11.48倍),该结果证明,我们成功构筑了EuW10/GL-22(50.0μmol/25.0μmol)荧光探针溶液。
实施例4
分别取1mL实施例3构筑的EuW10/GL-22(50.0μmol/25.0μmol)荧光探针溶液,向每1mL该荧光探针溶液中分别加入不同类型的多胺的母液,使其终浓度分别为0~250μmol/L(0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、5.00、10.0、15.0、25.0、35.0、50.0、100、150、200、250μmol/L),其中Put(图10)、Spd(图11)、Spm(图12)。利用荧光光谱仪检测该荧光探针溶液对不同类型待测多胺响应的荧光发射光谱(激发波长为500nm),并绘制该体系的荧光发射强度(591nm)与不同类型待测多胺响应的浓度关系曲线图(图13),其中0.05~35.0μmol/L可以拟合得到线性关系(图14)。不同类型的多胺浓度的增加其诱导EuW10/GL-22的荧光发射具有较大差异(如图15所示,当多胺浓度为35.0μmol/L,组装体EuW10/GL-22荧光探针对Spm荧光增强约2.84倍,而对Spd和Put基本无变化)。结果证明,该EuW10/GL-22荧光探针实现了对Spm的特异性识别。因而本发明构筑的EuW10/GL-22荧光探针可以用来特异性检测Spm。
实施例5
分别取1mL实施例3构筑的EuW10/GL-22(50.0μmol/25.0μmol)荧光探针溶液并用MES-NaOH缓冲溶液稀释浓度为(10.0μmol/5.0μmol)荧光探针溶液,得到稀释后的荧光探针溶液。向每1mL稀释后的荧光探针溶液中分别加入浓度为10.0mmol/L的精胺(Spm)母液,使其终浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50μmol/L,并利用荧光光谱仪记录稀释后的荧光探针溶液对不同浓度的Spm响应的荧光发射光谱(激发波长为500nm)(如图16所示)。并绘制该体系的荧光发射强度(591nm)与Spm浓度的关系曲线图,进一步通过线性拟合即可获得该EuW10/GL-22对Spm的荧光检测线性关系(如图17所示),其对Spm浓度具有较好的线性依赖关系。进而计算出该EuW10荧光探针对Spm的检测限为2.2nmol/L。
因此本发明构筑的EuW10/GL-22荧光探针可以高灵敏度特异性检测Spm:即向1mL实施例3构筑的EuW10/GL-22(50.0μmol/25.0μmol)荧光探针溶液中加入未知浓度(浓度范围为0.05~35.0μmol/L)的精胺(Spm),利用荧光光谱仪记录该荧光探针溶液对未知浓度Spm响应的荧光发射光谱(激发波长为500nm),将591nm荧光发射强度代入图14所示的荧光检测线性关系曲线,从而计算得到精胺的浓度。
还需要说明的是,本发明的具体实施例只是用来示例性说明,并不以任何方式限定本发明的保护范围,本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化,但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针,是由如下方法制备得到:将多金属氧酸盐EuW10用MES-NaOH缓冲液稀释后得到浓度为2 mmol/L的多金属氧酸盐母液,再用MES-NaOH缓冲液稀释至40倍体积,得到浓度为50 μmol/L的EuW10荧光探针溶液;取1 mL浓度为50μmol/L的EuW10荧光探针溶液,向其中加入终浓度为0.5~50.0 μmol/L的HPV小肽GL-22,从而制备得到基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针EuW10/GL-22;其中,EuW10为Na9[EuW10O36]•32H2O,HPV小肽GL-22的序列为GRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL。
2.如权利要求1所述的一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针,其特征在于:GL-22的终浓度为25.0 μmol/L。
3.如权利要求1所述的一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针,其特征在于:MES-NaOH缓冲液的配置是将吗啉乙磺酸溶剂溶于超纯水中得到浓度为10.0 mmol/L的溶液,再用氢氧化钠调节pH为6.5。
4.权利要求1~3任何一项所述的一种基于多金属氧酸盐及其组装体的荧光探针在检测精胺中的应用。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN107271673A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-10-20 | 吉林大学 | 一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用 |
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2021
- 2021-08-03 CN CN202110884297.2A patent/CN113583673B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107271673A (zh) * | 2017-06-30 | 2017-10-20 | 吉林大学 | 一种含Eu的多金属氧簇在体外检测人乳头瘤病毒早期致癌蛋白E6中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
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High-affinity binding with specific peptides endows EuW10 a good luminescence probe for HPV E6 detection;Liu Yuxue;《New Journal of Chemistry》;20180922;第42卷(第21期);全文 * |
Self-Assembly of an Europium-Containing Polyoxometalate and the Arginine/Lysine-Rich Peptides from Human Papillomavirus Capsid Protein L1 in Forming Luminescence-Enhanced Hybrid Nanoparticles;Zhang Teng;《The Journal of Physical Chemistry》;20150326;第119卷(第15期);全文 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN113583673A (zh) | 2021-11-02 |
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