CN116212090B - 一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带及其制备方法，绷带由包括含Eu的多金属氧酸盐、亚精胺和TG‑14多肽为原料制备而得。该绷带将含Eu的多金属氧酸盐、亚精胺和TG‑14多肽孵育复合后，对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)具有高效抗菌功能，通过SEM扫描电镜显示在抗菌绷带与E.coli和S.aureus孵育后，E.coli和S.aureus的生物膜系统均已遭到破坏，并通过涂板法抗菌实验得出该绷带所含的抗菌剂对E.coli和S.aureus的抗菌率均能达到100%，能够清洁伤口组织周围卫生，有效抑制微生物生长和优良的组织整合能力。

Description

一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗器械领域，尤其是涉及一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带及其制备方法。
背景技术
大肠杆菌(E.coli)是动物肠道中的正常寄居菌，在一定条件下会引起人类或动物产生疾病。轻则会引发胃肠道感染，严重的还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种会引发炎症的细菌，人一旦感染上就会引起多种病症。E.coli和S.aureus大部分的细菌一般情况下会依附在人的皮肤表面，如果人的皮肤一旦收到外部原因影响而受到损伤，就会造成皮肤组织和功能的中断，而此时则为病原细菌的侵入提供了有利条件。E.coli和S.aureus如果侵入人体后，首先会加重伤口，引起伤口的化脓性感染，延缓伤口愈合速度，并且随着血液的流动，会使人出现恶心、呕吐、腹痛、身体虚弱和全身疼痛等不良反应，再严重者将会引发多器官感染等炎症。
组织创伤后的大出血和伤口感染是造成伤员伤口进一步恶化的主要危险因素；因此，迫切需要能够极大地实现伤口闭合，有效控制出血和感染的急救用品。现有的包扎型绷带虽然能够包覆在组织表面，提供结构支持，防止环境中的污垢和传染性微生物进入，以及在受影响的部位确保敷料和局部治疗，但其止血抑菌能力有限，不适合单纯用作急救性伤口处理。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带及其制备方法，以解决上述问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带，所述绷带由稀土金属基三元复合抗菌剂负载到PP弹性非织造布制备而得，其中，稀土金属基三元复合抗菌剂由包括含Eu的多金属氧酸盐、亚精胺和TG-14多肽制备得到；
稀土金属基三元复合抗菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
1）合成二元复合抗菌剂：
将含Eu的多金属氧酸盐与亚精胺在pH值为6-7的MES-NaOH缓冲液中混合均匀，室温搅拌10-30 min后得到；
2）合成三元复合抗菌剂：
向含有步骤1）得到的二元复合抗菌剂的MES-NaOH缓冲液中加入TG-14多肽，室温搅拌10-30min后得到。进一步，所述含Eu的多金属氧酸盐为EuW10，分子式为Na9[EuW10O36]•32H2O。
进一步，所述EuW10的制备方法包括如下步骤：
将Na2WO4•2H2O溶解在蒸馏水中后调节pH值至7.0-7.5，将包含Eu(NO3)3•6H2O的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80-90℃搅拌均匀，冷却至室温，得到结晶的Na9[EuW10O36]•32H2O。
进一步，所述EuW10、亚精胺、TG-14多肽的摩尔比为1：（5-10）：1。
进一步，所述EuW10、亚精胺、TG-14多肽的摩尔比为1：5：1。
本发明还提供了一种如上述所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带的制备方法，该方法包括如下步骤：
将PP弹性非织造布作为载体，通过原位沉积法将PP弹性非织造布放置于稀土金属基三元复合抗菌剂分散液中，40℃条件下保持12h后取出烘干，得到新型稀土金属基抗菌消炎绷带。
进一步，所述稀土金属基三元复合抗菌剂分散液的浓度为100μM。
相对于现有技术，本发明所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带及其制备方法具有以下优势：
（1）在本发明采用的EuW10和一种来源于HPV的早期致癌基因E6的早期蛋白多肽TG-14为原料制备三元复合型抗菌剂，EuW10是一种含有稀土金属铕的多金属氧酸盐，自身具有较强的抗菌效果； Spd又称亚精胺或三盐酸亚精胺，是一种广泛分布在生物体内的生物多胺，对于炎症、氧化应激以及缺血引起的神经元损伤具有很好的保护作用，对伤口能够起到止血作用，TG-14也具有抗菌抗炎功效。本发明将三种材料进行优势结合，从而产生协同增强的作用，使其抗菌和创口治愈性能进一步提高。
（2）本发明制备的稀土金属基抗菌消炎绷带与传统绷带的区别在于，传统绷带只是起到包覆在组织表面，防止环境中的污垢和传染性微生物进入；而本发明的稀土金属基抗菌消炎绷带在保护伤口的同时还具有抗菌功效，通过SEM扫描电镜显示在抗菌消炎绷带与E.coli和S.aureus孵育2 h后，E.coli和S.aureus的生物膜系统已遭到破坏，细菌已处于凋亡状态，能够有效杀死细菌，清洁创口周围卫生。
（3）本发明中制备的抗菌消炎绷带在保护伤口组织表面的同时能够解决伤口细菌感染问题，并且达到了优异的抗菌效果。本发明构建一种新型生物无机复合抗菌材料的概念，并将有助于促进稀土金属与生物多胺的复合材料来开发新型抗菌医疗材料。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为多种抗菌剂对E.coli的抗菌性能对比测试图；
图2为多种抗菌剂对S.aureus的抗菌性能对比测试图；
图3为不同抗菌剂分散液浓度制备的绷带产品对E.coli抗菌性能测试图；
图4为不同抗菌剂分散液浓度制备的绷带产品对S.aureus抗菌性能测试图；
图5为EuW10@Spd-TG-14复合抗菌剂与E.coli孵育2h后的电镜扫描图；
图6为EuW10@Spd-TG-14复合抗菌剂与S.aureus孵育2h后的电镜扫描图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
亚精胺、精胺、酵母提取物、蛋白胨、琼脂购自阿拉丁化学有限公司。
氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH)购自天津大茂化学试剂有限公司。
TG-14肽为HPV L1蛋白中的354-367序列，HPV L1蛋白获得自网站：https://thebiogrid.org/4263561/summary/human-papillomavirus/l1.html，ID号为:4263561。
VA-23肽为HPV 16 L2蛋白中的95-117序列，HPV 16 L2蛋白获得自网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi，ID号为：333760。
LT-15肽为HPV L1 蛋白中的474-488序列，HPV L1 蛋白获得自网站：https://thebiogrid.org/4263561/summary/human-papillomavirus/l1.html，ID号为：4263561。
Na9[EuW10O36]·32H2O，以下简称EuW10。
(N-Morpholino)乙磺酸(MES)购自北京化工厂，所有的化学物质都未经进一步处理使用，蒸馏水为实验室自制。
此外，以MES和NaOH为原料，用蒸馏水制备了10.0 mM、pH = 6.0的MES-NaOH缓冲液。使用蒸馏水配制浓度为6.0 mM的EuW10水溶液、浓度为2.0 mM的Spd水溶液和浓度为6.0mM的TG-14水溶液。并置于黑暗条件下(4 ℃)储存，然后根据不同的实验要求稀释到所需浓度。
金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌（E.coli）采购自北京四环生物制药有限公司。
如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 EuW10水溶液的配制
将Na2WO4•2H2O溶解在蒸馏水中后调节pH值至7.0-7.5，将包含Eu(NO3)3•6H2O的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80-90℃搅拌均匀，冷却至室温，得到结晶的Na9[EuW10O36]•32H2O。
取0.6 mmol经过干燥的并已经纯化的Na9[EuW10O36]·32H2O加入100.0 mL二次蒸馏水中，搅拌均匀直至澄清后获得制备浓度为6.0 mM的EuW10水溶液。
实施例2 Spd溶液的配制
取6 mmol购买的Spd加入100.0 mL二次蒸馏水中，搅拌均匀直至澄清后获得制备浓度为6.0 mM的Spd溶液。
实施例3 合成EuW10@Spd二元复合抗菌剂
将100μL Spd (6.0 mM)添加到包含20 μL浓度为6.0 mM EuW10的MES-NaOH (10.0mM，pH=6.5)缓冲溶液中并剧烈搅拌。混合溶液的终体积固定在1.0 mL。室温搅拌20min后，构建得到EuW10@Spd二元复合抗菌剂。
实施例4 合成EuW10@Spd-TG-14三元复合抗菌剂
在含有实施例3制备的二元复合抗菌剂EuW10@Spd的MES-NaOH (10.0 mM，pH=6.5)缓冲液中加入20 μL浓度为6.0mM的TG-14。室温搅拌30min后，构建得到EuW10@Spd-TG-14三元复合抗菌剂。
实施例5 培养基的制作
液体LB培养基：在1 L纯水中加入171.1 mmol的NaCl、10 g蛋白胨和5 g酵母提取物，搅拌均匀后分装至4个锥形瓶中，放入高压蒸汽灭菌锅中121 °C灭菌25 min后备用。
固体LB培养基：在1 L纯水中加入171.1 mmol的NaCl、10 g蛋白胨、5 g酵母提取物和44.6 mmol琼脂粉，放入高压蒸汽灭菌锅中121 °C灭菌25 min，然后趁热倒入一次性培养皿中，待冷却凝固后，封口膜密封后放入4 °C冰箱中备用。
实施例6 大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的复苏和传代
将购买来的E.coli冻干粉与复苏液混合均匀后，转移至事先配制好LB培养液中，放在恒温摇床培育6 h后，在超净工作台中吸取500 μL培育好的第二代E.coli菌液，再吸取500 μL质量浓度为50%的甘油，在2 mL EP管中混合均匀，放在-80 °C冰箱中冷冻保存。第三代E.coli菌种的传代方法同第二代，S.aureus菌种的繁育和传代方法同E.coli菌种。
实施例7 稀土金属基抗菌消炎绷带的制备
采用当前市面上较为常见的PP 弹性非织造布作为载体，通过原位沉积法嵌入EuW10@Spd-TG-14三元复合抗菌剂，具体实施方案如下：将PP弹性非织造布放置于浓度为100μM的EuW10@Spd-TG-14三元复合抗菌剂分散液中，40℃条件下保持12 h后取出烘干，即得到新型稀土金属基EuW10@Spd-TG-14抗菌消炎绷带，同时未负载EuW10@Spd-TG-14复合抗菌剂的PP 弹性非织造布作为空白试样。
对比例1 精胺制备二元复合抗菌剂
将100 μL精胺Spm (6.0 mM)添加到包含20 μL浓度为6.0 mM EuW10的MES-NaOH(10.0 mM，pH=6.5)缓冲溶液中并剧烈搅拌。混合溶液的终体积固定在1.0 mL。室温搅拌20min后，构建得到EuW10@Spm二元复合抗菌剂。
对比例2 多种多肽片段制备三元复合抗菌剂
在含有实施例3和对比例1制备的两种二元复合抗菌剂EuW10@Spd和EuW10@Spm的MES-NaOH (10.0 mM，pH=6.5) 缓冲液中分别加入20 μL浓度均为6.0mM的TG-14、VA-23、LT-15多肽片段溶液。室温搅拌30min后，构建得到EuW10@Spd-（多肽）三元复合抗菌剂和EuW10@Spm-（多肽）三元复合抗菌剂。
对比例3 不同抗菌剂分散液浓度制备稀土金属基抗菌消炎绷带
分别制备浓度为10μM、50μM、100μM的EuW10@Spd-TG-14三元复合抗菌剂分散液，然后将PP弹性非织造布分别放置于上述不同浓度的分散液中，40℃条件下保持12 h后取出烘干，即得到新型稀土金属基EuW10@Spd-TG-14抗菌消炎绷带，同时未负载EuW10@Spd-TG-14复合抗菌剂的PP 弹性非织造布作为空白试样。
实验1 多种抗菌剂抗菌性能对比测试
对未引入多肽的二元复合抗菌剂EuW10@Spd、EuW10@Spm和三元复合抗菌剂进行抗菌性能检测，先将冷冻的第三代E.coli和S.aureus转移至配制好LB培养液中，放进恒温摇床培育5h后，在超净工作台中将两种菌液分别稀释104倍，然后将各系列抗菌剂分别配制成28 μM的分散液与E.coli和S.aureus分别孵育进行涂板抗菌测试，结果如图1和图2显示。
从图中能够看出，未加入任何抗菌剂的E.coli和S.aureus空白培养基中均是长满了菌落，而加入了抗菌剂的培养基中菌落均有减少，在二元复合抗菌剂EuW10@Spd存在的条件下，E.coli培养基中尚有少量个别菌落存在，呈零星分布；而三元复合抗菌剂EuW10@Spd-TG-14对E.coli和S.aureus的抗菌率均能够达到100%。而其他系列的抗菌剂对E.coli和S.aureus的抗菌率均低于EuW10@Spd-TG-14。
实验2 不同抗菌剂分散液浓度制备的绷带产品抗菌性能测试
先将冷冻的第三代E.coli和S.aureus转移至配制好LB培养液中，放进恒温摇床培育5h后，在超净工作台中将两种菌液分别稀释105倍，然后将对比例3中所制备的抗菌绷带裁剪为边长为5mm×5mm的正方形试样，然后分别放入100μL稀释后的E.coli和S.aureus菌液混合振荡后放在恒温摇床中孵育2h，同时进行空白对照实验，直接吸取100 μL稀释的菌液放在恒温摇床中孵育2 h后，通过涂板抗菌测试，结果如图3、图4所示。
从图中能够看出，空白组的E.coli和S.aureus空白培养基中均是长满了菌落，而随着EuW10@Spd-TG-14抗菌剂分散液浓度的加大，抗菌绷带的抑菌效果也随之提高，抗菌剂分散液浓度为50μM时，对S.aureus的抗菌率已经能达到99%，而抗菌剂分散液浓度提升为100 μM时，对E.coli和S.aureus的抗菌率均能够达到100%。
实验3 抗菌性能测试
先将冷冻的第三代E.coli和S.aureus转移至配制好LB培养液中，放进恒温摇床培育5h后，在超净工作台中将两种菌液分别稀释105倍，然后将本发明所制备的抗菌绷带裁剪为边长为5 mm×5 mm的正方形试样，然后分别放入100μL稀释后的E.coli和S.aureus菌液混合振荡后放在恒温摇床中孵育2h，同时进行空白对照实验，直接吸取100 μL稀释的菌液放在恒温摇床中孵育2 h后，通过扫描电镜观察。
扫描电镜结果如图5、图6所示，从图5能够观察到未与EuW10@Spd-TG-14抗菌绷带进行共同孵育的空白组E.coli生长得比较完好，细菌整体成直径大约为1 μm的棒状个体，仍具有一定活力，在没有外部影响的情况下，E.coli生长的十分完好。而加入了EuW10@Spd-TG-14抗菌绷带共同进行孵育的E.coli通过扫描电镜显示细菌的生物膜系统已遭到破坏，细菌个体呈现出粘结、破碎的凋亡状态，细菌整体的繁育已经受到抑制，说明EuW10@Spd-TG-14抗菌绷带能够有效地杀死E.coli菌，并且抑制E.coli的生长。从图6中S.aureus的扫描电镜也能够直接观察到未受到外界干扰的的空白组S.aureus仍然呈现完整的球状个体，具有一定生命活力，生长的十分完好。而在EuW10@Spd-TG-14抗菌绷带作用下的S.aureus个体已经出现解体、破碎等现象，造成细胞内物质流出，S.aureus个体已经不再具有生命活力，说明EuW10@Spd-TG-14抗菌绷带能够有效地杀死S.aureus菌。
本发明获得的稀土金属基抗菌消炎绷带与传统绷带的区别在于，传统绷带只是起到包覆在组织表面，防止环境中的污垢和传染性微生物进入；而本发明的稀土金属基抗菌消炎绷带在保护伤口的同时还具有抗菌功效，通过SEM扫描电镜显示在抗菌消炎绷带与E.coli和S.aureus孵育2 h后，E.coli和S.aureus的生物膜系统已遭到破坏，细菌已处于凋亡状态，能够有效杀死细菌，清洁创口周围卫生。
本发明采用EuW10、Spd和TG-14作为原料，并将三种材料较高的止血抑菌能力和优良的组织整合能力进行优势结合，开发了一种能够用于急诊创面处理的EuW10@Spd-TG-14抗菌消炎绷带，并且产品表现出令人满意的抗菌性能，防止细菌感染，促进伤口愈合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种新型稀土金属基抗菌消炎绷带，其特征在于：所述绷带由稀土金属基三元复合抗菌剂负载到PP弹性非织造布制备而得，其中，稀土金属基三元复合抗菌剂由包括含Eu的多金属氧酸盐、亚精胺和TG-14多肽制备得到；所述TG-14肽为HPV L1蛋白中的354-367序列；
稀土金属基三元复合抗菌剂由包括如下步骤的方法制备得到：
1）合成二元复合抗菌剂：
将含Eu的多金属氧酸盐与亚精胺在pH值为6-7的MES-NaOH缓冲液中混合均匀，室温搅拌10-30 min后得到；
2）合成三元复合抗菌剂：
向含有步骤1）得到的二元复合抗菌剂的MES-NaOH缓冲液中加入TG-14多肽，室温搅拌10-30min后得到；
所述含Eu的多金属氧酸盐为EuW10，分子式为Na9[EuW10O36]•32H2O。
2.根据权利要求1所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带，其特征在于：所述EuW10的制备方法包括如下步骤：
将Na2WO4•2H2O溶解在蒸馏水中后调节pH值至7.0-7.5，将包含Eu(NO3)3•6H2O的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80-90℃搅拌均匀，冷却至室温，得到结晶的Na9[EuW10O36]•32H2O。
3.根据权利要求1所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带，其特征在于：所述EuW10、亚精胺、TG-14多肽的摩尔比为1：（5-10）：1。
4.根据权利要求3所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带，其特征在于：所述EuW10、亚精胺、TG-14多肽的摩尔比为1：5：1。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
将PP弹性非织造布作为载体，通过原位沉积法将PP弹性非织造布放置于稀土金属基三元复合抗菌剂分散液中，40℃条件下保持12h后取出烘干，得到新型稀土金属基抗菌消炎绷带。
6.根据权利要求5所述的新型稀土金属基抗菌消炎绷带的制备方法，其特征在于：所述稀土金属基三元复合抗菌剂分散液的浓度为100 μM。
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