CN116236609B - 一种抑菌消炎绷带及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑菌消炎绷带及其制备方法和应用，所述绷带由纱布浸润于EuNPs@CS‑OHA混合溶液中后制得，所述EuNPs@CS‑OHA混合溶液包括含稀土Eu纳米颗粒、壳聚糖、醛基化透明质酸，三者的摩尔浓度比为1：（2~2.5）：（1~2）。本发明的抑菌消炎绷带将Na_x[EuW₁₀O₃₆]•yH₂O与壳聚糖和醛基化透明质酸复合后，对大肠杆菌具有高效抗菌功能。

Description

一种抑菌消炎绷带及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用外科用品领域，尤其是涉及一种抑菌消炎绷带及其制备方法和应用。

背景技术

伤口愈合是损伤组织完整再生的一系列复杂的细胞和分子过程，它通过止血、炎症、增殖和重塑四个连续阶段来完成。创面材料的选择是创面愈合的重要途径，需要综合考虑多种因素的作用。伤口敷料通过使伤口与外部环境绝缘和维持伤口周围的湿润环境来加速恢复。此外，它们应该是无毒的，允许气体交换进入伤口，并吸收多余的伤口渗出物，以避免组织浸渍导致伤口被微生物入侵。

在伤口愈合过程的炎症阶段，中性粒细胞和巨噬细胞分泌大量活性氧(ROS)。还有细胞因子和基质金属蛋白酶。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX₂)在炎症细胞的细胞质膜中被高浓度合成，在吞噬过程中受到刺激，进而产生高水平的超氧自由基阴离子。产生的ROS杀死微生物病原体，协助吞噬。相反，过度释放超氧化物会导致氧化应激，损伤邻近组织。并可通过蛋白水解活化水解细胞外基质蛋白(ECM)，损害真皮成纤维细胞和角质形成细胞功能。

含有稀土铕（Eu）的化合物具有多种促进伤口愈合的生化特性，包括对哺乳动物细胞的生物相容性和无毒性、生物降解性、抗菌活性、止血活性和抗炎活性。而壳聚糖中的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)是真皮组织的主要成分，除了作为消炎药的作用外，它对修复疤痕组织至关重要。将含Eu的纳米颗粒与NAG复合后的材料具有促进成纤维细胞增殖和胶原合成的特性。此外，壳聚糖在血栓形成和凝血过程中发挥着重要作用，还能刺激血管生成的细胞因子和生长因子的表达，对加速组织恢复至关重要。新材料的研发有望抑制创面微生物的感染和进一步阻碍创面愈合的并发症。

透明质酸（HA）是一种高摩尔质量生物聚合物，由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸的重复双糖单元组成，完全由β-键连接。透明质酸是皮肤表皮和真皮层的主要成分(50%)，在美容皮肤和护肤产品中是一种很好的保湿剂。在伤口愈合过程中，HA在增加角化细胞的迁移和增殖过程中为帮助营养物质的运输提供临时支持。此外，HA还调节重构步骤的成纤维细胞基因的表达，主导血管生成。

众所周知，HA 可以与细胞表面受体作用，介导细胞信号，促进细胞的增殖、迁移，加快组织再生。但单一的HA机械强度、粘附强度、基团反应活性不佳，想要利用HA的促愈合效果制备伤口敷料需要对HA进行一定的改性。通过高碘酸钠氧化HA糖环上的邻羟基形成反应活性更高的醛基，由于制备简单，反应方便，OHA被广泛应用于伤口敷料的研究领域。醛化后的HA仍具备HA的促愈合效果及良好的生物相容性。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抑菌消炎绷带及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种抑菌消炎绷带，由纱布浸润于EuNPs@CS-OHA混合溶液中后制得，所述EuNPs@CS-OHA混合溶液包括含稀土Eu纳米颗粒、壳聚糖（chitosan，CS）、醛基化透明质酸，三者的摩尔浓度比为1：（2 ~ 2.5）：（1 ~ 2）。

优选地，所述EuNPs@CS-OHA混合溶液中含稀土Eu纳米颗粒、壳聚糖、醛基化透明质酸的摩尔浓度比为1：2：2。

优选地，所述含稀土Eu纳米颗粒为Na_x[EuW₁₀O₃₆]•yH₂O，其中x取自8、9、10，y取自30、31、32、33、34、35。

优选地，所述含稀土Eu纳米颗粒为Na₉[EuW₁₀O₃₆]•32H₂O。

优选地，所述EuNPs@CS-OHA混合溶液的制备方法包括如下步骤：

S1：构建CS包覆的含稀土Eu纳米颗粒

向含稀土Eu纳米颗粒溶液中加入壳聚糖溶液，混合后得到CS包覆含稀土Eu纳米颗粒的溶液，记为EuNPs@CS溶液；

S2：构建EuNPs@CS-OHA复合材料

向步骤S1制备得到的EuNPs@CS溶液中滴加醛基化透明质酸溶液，室温过夜搅拌后得到EuNPs@CS-OHA混合溶液。

第二方面，本发明还提供上述抑菌消炎绷带的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

将裁减好的纱布浸入EuNPs@CS-OHA混合溶液中，密封后于50 ~ 60℃加热浸渍6 ~9小时后冷却至室温，将浸渍后的纱布转入无菌托盘，在37℃恒温培养箱将纱布烘干至无水分，取出置于无菌密封袋中备用，即得抑菌消炎绷带。

优选地，所述EuNPs@CS-OHA混合溶液的制备方法包括如下步骤：

S1：构建CS包覆的含稀土Eu纳米颗粒

向含稀土Eu纳米颗粒溶液中加入壳聚糖溶液，混合后得到CS包覆含稀土Eu纳米颗粒的溶液，记为EuNPs@CS溶液；

S2：构建EuNPs@CS-OHA复合材料

向步骤S1制备得到的EuNPs@CS溶液中滴加醛基化透明质酸溶液，室温过夜搅拌后得到EuNPs@CS-OHA混合溶液。

第三方面，本发明还提供了上述抑菌消炎绷带在生物医药领域的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

（1）本发明的抑菌消炎绷带将Na_x[EuW₁₀O₃₆]•yH₂O与壳聚糖和改性透明质酸复合后，对大肠杆菌具有高效抗菌功能。

（2）在本发明使用具有生物抗菌活性的Na_x[EuW₁₀O₃₆]•yH₂O，其在复合过程中较高的荧光性能可用于绷带中药物含量的指示剂，在紫外灯下可用于判断是否需要更换绷带的依据。

（3）本发明制备的抑菌消炎绷带能够保持持续释放功能，在与潮湿或湿润伤口接触后3天内仍持续释放抗菌成份。

附图说明

图1为实施例5制备的绷带，裁剪1×1 cm²后，浸渍后与大肠杆菌溶液孵育不同时间的涂板效果图；

图2为实施例5制备的绷带，裁剪1×1 cm²后，浸渍后与金黄色葡萄球菌溶液孵育不同时间的涂板效果图；

图3为实施例5大肠杆菌的琼脂涂板数据统计图；

图4为实施例7新型绷带中使用单一材料和复合材料对革兰氏阴性菌大肠杆菌（E.coli）和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus）的抑菌消炎功能验证效果图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

其中，壳聚糖（CS）、透明质酸（HA）、高碘酸钠（NaIO₄）、冰乙酸（CH₃COOH）和乙二醇（(CH₂OH)₂）购自阿拉丁化学有限公司，所有的化学物质都未经进一步处理使用，蒸馏水(ρ=18.2 MΩ·cm, 25℃)来自Millipore milli-Q净水系统。

大肠杆菌E.coli来自北京四环生物制药有限公司。金黄色葡萄球菌S.aureus来自北京四环生物制药有限公司。

其他试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1醛基化透明质酸的制备

称量10 g的透明质酸（HA）于1 L四口瓶中，每克透明质酸添加40 mL纯化水，共计添加400 mL，搅拌温度为60℃、转速为800 rpm/min，搅拌6 h。高碘酸钠（NaIO₄）与透明质酸（HA）摩尔比0.535，称量2.8 g的NaIO₄，加入纯化水50 mL，避光搅拌使NaIO₄溶解。对四口瓶粘贴锡纸避光处理，将NaIO₄溶液加入其中，再避光反应4 h。量取2.8 mL的乙二醇加入反应体系中，反应温度降为室温、600 rmp再反应1 h，结束反应。

实施例2 醛基化透明质酸（OHA）的后处理

对实施例1制得的体系原液OHA 使用60℃旋蒸减压浓缩，用7000 MWCO透析袋进行为期4天的透析，每8个小时进行一次换水。反应完成后进一步进行低温冷冻干燥，产物状态为白色絮状物，使用球磨机将OHA进行充分研磨，制成细粉备用。

实施例3 配制CS、含稀土Eu纳米颗粒、OHA的储备液

配制4 mM的CS溶液：取1.0 ~ 1.1 mL冰乙酸加入99.0 ~ 100 mL二次蒸馏水中制备1%（w/v）乙酸溶液，称取0.4 g CS，将CS溶于1%乙酸溶液中，搅拌均匀直至澄清，即得到4mM的CS溶液。

配制1 mM的含稀土Eu纳米颗粒储备液：称取6.702 mg Na₉[EuW₁₀O₃₆]•32H₂O溶于2.0 mL去离子水中，旋涡震荡仪混合均匀得到浓度为1 mM的含稀土Eu纳米颗粒储备液。

配制浓度为4 mM的OHA溶液：称取0.4 g醛基化透明质酸（OHA）固体药品，将OHA溶于99.0 ~ 100 mL二次蒸馏水中，搅拌均匀直至澄清，即得到4 mM的OHA溶液。

实施例4 制备EuNPs@CS-OHA复合材料

首先，构建CS包覆的含稀土Eu纳米颗粒：取10.0 mL 实施例3配制的含Eu的纳米颗粒储备液转入15 mL离心管中，向其中加入4.0 ~ 5.0 mL 实施例3配制的4 mM的CS溶液，得到CS包覆的含稀土Eu纳米颗粒的溶液，即EuNPs@CS溶液。

其次，构建EuNPs@CS-OHA复合材料：在50 mL带有磁子的烧杯中，加入15 mLEuNPs@CS溶液，在磁力搅拌器搅拌过程中，向其中慢慢滴加实施例3配制的OHA溶液，使得终体积为20 mL，封口膜封紧后室温过夜搅拌得到EuNPs@CS-OHA混合溶液。

实施例5制备抑菌消炎绷带

将裁剪好的普通纱布浸入实施例4制备得到的EuNPs@CS-OHA混合溶液中，封口后于50℃加热浸渍6小时后冷却至室温，将绷带转入无菌托盘，在37℃恒温培养箱将绷带烘干至无水分，取出置于无菌密封袋中备用。

实施例6 抑菌消炎绷带的抑菌性能测试

将实施例5制备得到的绷带裁剪1×1 cm²后，在紫外线照射30 min的超净台中，用镊子将其转移至一次性无菌培养皿中，以上操作均在超净台中进行，所用到的剪刀、镊子均利用75%酒精棉擦拭后使用。

将10 mL灭菌水注入无菌培养皿中，用镊子将裁剪的绷带完全浸渍在无菌水中，向其中加入10 mL含有大肠杆菌的LB溶液，其中大肠杆菌的密度为OD600 = 0.1 ~ 0.2，轻晃摇匀培养皿后，密封盖上盖子，在酒精灯点燃，通风1级的超净台进行培养。

在操作前要充分对工作台进行灭菌处理，避免细菌的交叉感染。将10 mL灭菌水注入无菌培养皿中，用镊子将裁剪的绷带完全浸渍在无菌水中，向其中加入10 mL含有金黄色葡萄球菌的LB溶液，其中金黄色葡萄球菌的密度为OD 600 = 0.1 ~ 0.2，轻晃摇匀培养皿后，盖上密封盖，在酒精灯点燃，通风1级的超净台进行培养。对大肠杆菌的培养方法与金黄色葡萄球菌培养方法相同。

待1 h后取出100 μL浸渍液，将两种菌分别均匀涂板在琼脂培养皿上，正置在37℃恒温培养箱孵育半小时后，待溶液晾干，无液体状后，将其倒置并于37℃恒温培养箱过夜孵育后，拍摄照片；同样地，分别取绷带浸渍1 h、5 h、10 h、24 h的浸渍液涂布在琼脂板上，观察不同时间的涂板效果图，每个浸渍时间做三组平行实验。

同样地，选择含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的密度为OD600 = 0.1 ~ 0.2的LB液体培养基作为空白对照。吸取100 μL溶液转移到空白培养皿中，按照以上操作流程置于恒温培养箱进行孵育，平行实验进行三组。

如实施例6所描述得到的不同浸渍时间得到的琼脂涂板效果，对同一孵育时间的涂板结果进行筛选，选择分布均一的图像进行展示。如图1所示，可以看出，空白对照组的大肠杆菌长势较好，均匀分布在琼脂板上，通过统计三组平行实验的菌落数量，得到三组平板的菌落平均值为728；当大肠杆菌与绷带浸渍液孵育1 h后，可以看到，菌落数量明显降低，经过菌落统计后得出这三组平行实验的平均值为324；当孵育时间提升到5 h后，菌落的数量降至90；孵育时间分别为10 h和24 h时，菌落数量分别降至11、0。

如图2所示，空白对照组的金黄色葡萄球菌长势较好，均匀分布在LB琼脂板上，通过统计三组平行实验的菌落数量，得到三组平板的菌落平均值为1520；当金黄色葡萄球菌与绷带浸渍液孵育1 h后，我们可以看到，菌落数量与空白组对比，两者变化不明显，略有降低，经过菌落统计后得出这三组平行实验的平均值为1224；当孵育时间提升到5 h后，菌落的数量降至1104；孵育时间分别为10 h和24 h时，菌落数量分别降至1060、936。

如图3所示，对三组平行实验的细菌存活率进行统计，以空白组作为对照，空白组的大肠杆菌生存率为100%，随着与浸渍液孵育1 h后，大肠杆菌的存活率分别降低至44.5%，此时三组平行实验的方差较大，这主要是由于孵育时间较短，浸渍液不能完全包覆细菌的生长范围，使得结果偏差较大；当与浸渍液孵育5 h后，大肠杆菌的存活率仅剩12.4%，而此时三组平行实验的方差相比较前者有所降低，但数值仍然较大，这可能是由于细菌在孵育过程中产生了不同程度的生物膜，在一定程度上阻止了抗菌剂的入侵，但由于每组平行实验中生物膜的生长速度不同，导致实验偏差较大；当与浸渍液分别孵育10 h、24 h后取样涂板的结果显示，大肠杆菌的生存率分别降至1.5%和0%，这说明抗菌绷带能够持续长时间的释放，使得大肠杆菌最终全部死亡。在金黄色葡萄球菌中，通过对不同时间菌落的统计，发现与空白对照组中金黄色葡萄球菌菌落的数量没有明显的差异，金黄色葡萄球菌的存活率较高，没有明显的抑制效果。

实施例7单一材料绷带和复合材料绷带的抑菌性能对比

为了研究绷带中使用单一化合物和复合材料的抑菌消炎功能，本实施例使用涂板实验对三组平行实验的细菌存活率进行统计，以第一列空白组作为对照，空白组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生存率为100%，在第二组实验中按照实施例中原有配方基础条件不变，添加含稀土Eu纳米颗粒，不添加HA或OHA，验证其抗菌性能。在第三组实验中按照实施例中原有配方基础条件不变，添加含稀土Eu纳米颗粒和没有经过改性的HA。在第四组实验中按照实施例中原有配方基础条件不变，添加含稀土Eu纳米颗粒，由透明质酸由原有的HA改变为改性透明质酸OHA。

由图4中菌落可以看出，通过对第一组空白对照实验的细菌存活率与第二组进行比较，发现单独加入含稀土Eu纳米颗粒后的抗菌材料对两种菌的抑菌效果与空白对照中细菌的数量相比有略微的减少，没有明显的区别。对第三组平行实验的细菌存活率进行统计，改变量为加入了含稀土Eu纳米颗粒和改性前的HA，发现抑菌材料的抑菌效果与空白对照中细菌的数量有减少，两种细菌减少量为30%-40%之间。对第四组平行实验的细菌存活率进行统计，改变量为加入含稀土Eu纳米颗粒和改性后的透明质酸OHA，发现抑菌材料的抑菌效果与空白对照中细菌的数量相比有很大的区别，对E.coli的抑菌率达到100%，对S.aureus的抑菌率达到50%，与实施例7中的结果也相符合。

对比例1 改变原料配比的EuNPs@CS复合材料的抑菌性能测试

a、配制8%（w/v）CS溶液：取1.0 ~ 1.1 mL冰乙酸加入92.0 ~ 98.0 mL二次蒸馏水中制备1%（w/v）乙酸溶液，称取8.0 g CS，将CS溶于1%乙酸溶液中，搅拌均匀直至澄清，即得到8%（w/v）CS溶液。

b、配制10%（w/v）CS溶液：取1.0 ~ 1.1 mL冰乙酸加入90.0 ~ 95.0 mL二次蒸馏水中制备1%（w/v）乙酸溶液，称取10 g CS，将CS溶于1%乙酸溶液中，搅拌均匀直至澄清，即得到10%（w/v）CS溶液。

c、配制20%（w/v）CS溶液：取1.0 ~ 1.1 mL冰乙酸加入80.0 ~ 90.0mL二次蒸馏水中制备1%（w/v）乙酸溶液，称取20 g CS，将CS溶于1%乙酸溶液中，搅拌均匀直至澄清，即得到20%（w/v）CS溶液。按照实施例3过程得到不同CS溶液浓度配方的绷带。

在50 mL带有磁子的烧杯中，分别加入以上不同浓度CS溶液制备而得的EuNPs@CS溶液各10 mL，在磁力搅拌器搅拌过程中，向其中慢慢滴加配制的OHA溶液，使得终体积为20mL，封口膜封紧后室温过夜搅拌，即得到不同比例掺杂的配方。按照实施例4重复以上配方制备的绷带的抑菌性能测试过程，发现其抑制大肠杆菌生长的能力均低于4%（w/v）CS溶液配制的EuNPs@CS-OHA。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抑菌消炎绷带，其特征在于：所述绷带由纱布浸润于EuNPs@CS-OHA混合溶液中后制得，所述EuNPs@CS-OHA混合溶液包括含稀土Eu纳米颗粒、壳聚糖、醛基化透明质酸，三者的摩尔浓度比为1：（2 ~ 2.5）：（1 ~ 2），所述含稀土Eu纳米颗粒为Na_x[EuW₁₀O₃₆]•yH₂O，其中x取自8、9、10，y取自30、31、32、33、34、35。

2.根据权利要求1所述的抑菌消炎绷带，其特征在于：所述EuNPs@CS-OHA混合溶液中含稀土Eu纳米颗粒、壳聚糖、醛基化透明质酸的摩尔浓度比为1：2：2。

3.根据权利要求1所述的抑菌消炎绷带，其特征在于：所述含稀土Eu纳米颗粒为Na₉[EuW₁₀O₃₆]•32H₂O。

4.根据权利要求1所述的抑菌消炎绷带，其特征在于：所述EuNPs@CS-OHA混合溶液的制备方法包括如下步骤：

S1：构建CS包覆的含稀土Eu纳米颗粒

向含稀土Eu纳米颗粒溶液中加入壳聚糖溶液，混合后得到CS包覆含稀土Eu纳米颗粒的溶液，记为EuNPs@CS溶液；

S2：构建EuNPs@CS-OHA复合材料

向步骤S1制备得到的EuNPs@CS溶液中滴加醛基化透明质酸溶液，室温过夜搅拌后得到EuNPs@CS-OHA混合溶液。

5.权利要求1-4任一所述的抑菌消炎绷带的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

将裁减好的纱布浸入EuNPs@CS-OHA混合溶液中，密封后于50 ~ 60℃加热浸渍6 ~ 9小时后冷却至室温，将浸渍后的纱布转入无菌托盘，在37℃恒温培养箱将纱布烘干至无水分，取出置于无菌密封袋中备用，即得抑菌消炎绷带。

6.根据权利要求5所述的抑菌消炎绷带的制备方法，其特征在于：所述EuNPs@CS-OHA混合溶液的制备方法包括如下步骤：

S1：构建CS包覆的含稀土Eu纳米颗粒

向含稀土Eu纳米颗粒溶液中加入壳聚糖溶液，混合后得到CS包覆含稀土Eu纳米颗粒的溶液，记为EuNPs@CS溶液；

S2：构建EuNPs@CS-OHA复合材料

向步骤S1制备得到的EuNPs@CS溶液中滴加醛基化透明质酸溶液，室温过夜搅拌后得到EuNPs@CS-OHA混合溶液。

7.权利要求1-4任一所述的抑菌消炎绷带在生物医药领域的应用。