CN113234125B - 自组装多肽、多肽水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种自组装多肽，所述的多肽的序列结构为：Fmoc‑LFKFFK‑NH2。本发明还涉及一种多肽水凝胶及其制备方法和应用。本发明的有益效果在于：本发明制备得到的多肽水凝胶，具有较好的细胞相容性和血液相容性，并能够促进L‑929细胞的增殖与黏附伸展；能够有效促进HUVEC细胞的迁移，并通过VEGFA与HIF‑1α信号通路促进新血管的形成；能够通过细胞膜破坏的方式杀灭革兰氏阳性菌(MRSA)与革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌)；在注入糖尿病小鼠MRSA感染的伤口处后，能够有效杀灭伤口感染处的MRSA，显著促进伤口的愈合和伤口处新血管的形成，并且不会对小鼠的其他组织产生毒性。

Description

自组装多肽、多肽水凝胶及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种多肽水凝胶的制备方法及其应用，具体涉及一种用于促进糖尿病慢性伤口愈合的多肽水凝胶的制备方法及其应用。
背景技术
慢性伤口已成为公共医疗的严重威胁，给全世界带来了巨大的医疗和财政负担。慢性伤口，尤其是糖尿病性溃疡，通常会伴有持续的微生物感染，约41％的糖尿病足溃疡患者最终不得不截肢。更可怕的是，慢性伤口表面更易形成生物被膜，从而保护内部微生物免受抗生素的渗透和侵袭，以产生更多的耐药细菌。事实证明，这种生物被膜存在于90％以上的慢性伤口中。除此之外，慢性伤口中的过度炎症引起的细胞外基质(ECM)损伤使内皮细胞难以粘附，迁移和增殖，同样也推迟伤口愈合。因此，临床上迫切需要具有协同抗菌甚至抗生物被膜活性和ECM功能以促进细胞粘附和增殖的有效伤口敷料。
由于具有较好的可设计性，生物活性和多功能性，自组装肽(SAP)已被证明是制造水凝胶的理想基元，尤其是用于克服慢性伤口的原位注射式水凝胶。淀粉样蛋白作为一种自组装肽的典型，倾向于形成具有丰富的β-折叠的纳米纤维结构，这种结构早先被证实与神经退行性疾病有关，后来在材料和生物医学的交叉学科中迅速发展。得益于其强大的自组装特性，淀粉样蛋白易于构建具有纳米纤维基质的水凝胶。这些具有典型交叉β结构的纳米纤维形成了独特且高度有序的纳米拓扑结构。纳米纤维表面富含带电和疏水性侧链，赋予了淀粉样蛋白水凝胶固有的粘附能力，这对于伤口愈合中的细胞粘附，增殖和迁移至关重要。同时，许多研究报道，淀粉样蛋白组装体的交叉-β结构也带来了独特的抗菌活性，这很可能源自人体对微生物感染的保护机制。总之，淀粉样蛋白是一类兼具抗菌性能与细胞粘附性能的典型的多功能自组装多肽。
苯酚可溶调节蛋白α3(PSMα3)在的金黄色葡萄球菌感染人类细胞中起着重要的毒性作用，而源自PSMα3的截断多肽LFKFFK(LK6)保留了淀粉样蛋白的粘附特性并获得了额外的抗菌能力。与PSMα3不同，LK6在其纤维化中采用交叉β-折叠结构而不是交叉α-折叠结构，并且构象的转变有助于其抗菌活性并避免了过度的细胞毒性。
基于以上陈述，本发明旨在提出一种基于淀粉样蛋白截断型多肽的水凝胶及其在促进糖尿病慢性伤口愈合中的应用。
发明内容
因此，本发明的目的即在提供一种自组装多肽、多肽水凝胶及其制备方法和用途。
为解决现有技术的问题，本发明提供一种自组装多肽，所述的多肽的序列结构为：Fmoc-LFKFFK-NH2。
本发明提供一种多肽水凝胶，所述的多肽水凝胶包括所述的自组装多肽。
本发明提供一种所述的多肽水凝胶的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
S1、称量所述的自组装多肽冻干粉末于容器内；
S2、加入二甲基亚砜，使多肽完全溶解；
S3、加入PBS缓冲液，使多肽在溶液中分布均匀；
S4、将混匀后的多肽溶液静置10分钟以上，即可获得稳定的多肽水凝胶。
较佳地，在所述的步骤S1中，多肽冻干粉末的纯度≥95％。
较佳地，在所述的步骤S2中，二甲基亚砜的用量不高于0.3％。
较佳地，在所述的步骤S3中，PBS缓冲液的pH小于7。
较佳地，在所述的步骤S3中，PBS缓冲液的pH为6。
较佳地，在所述的步骤S5中，混匀后的多肽溶液的终浓度大于等于0.1wt.％。
本发明提供一种所述的多肽水凝胶在制备治疗伤口愈合药物的用途。
较佳地，所述的伤口为糖尿病慢性伤口。
通过本发明制备得到的一种用于促进糖尿病慢性伤口愈合的多肽水凝胶的制备方法，应用于体外抗菌与细胞增殖及促进糖尿病小鼠的慢性伤口愈合中，具体应用方法如下：
(1)体外细胞培养方法：首先，将制备好的FLN凝胶预铺在96孔板的底部，在UV照射下放置过夜。其次，分别消化培养的L-929细胞和HUVEC细胞，离心后无菌条件下，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释至10000细胞/mL的密度并分别进行接种，均匀铺于预先形成的水凝胶表面，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞。
(2)体外抗菌方法：首先，将制备好的FLN凝胶预铺在24孔板的底部，在UV照射下放置过夜。其次，将甘油冻存的铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分别涂布于不同的绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。分别收集两种菌的单菌落接种于4mLTSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至106CFU/mL的细菌浓度。最后，每孔加入500μL之前准备的1×106CFU/mL的菌悬液，37℃共培育6个小时。抗菌效果采用CAM/PI活死菌染色法和平板法(SPM)进行定性与定量的评估。
(3)体外抗生物被膜方法：首先，将制备好的FLN凝胶预铺在24孔板的底部，在UV照射下放置过夜。其次，将(2)中的106CFU/mL的MRSA悬液以每孔500μL加入，并在37℃条件下静置培养2天。用PBS轻轻地清洗掉浮游的MRSA，然后每孔添加500μL甲醇，固定15分钟。最后每孔加入500μL 0.4％结晶紫溶液(乙醇溶解)，共孵育15分钟。检测其在590nm处的吸光度值，证明水凝胶体外抑制生物被膜形成的能力。
(4)促进糖尿病小鼠的慢性伤口愈合方法：首先，将6周龄的C57健康小鼠禁食1天，然后腹腔注射新鲜制备的链脲佐菌素(STZ)溶液(10mg/m，柠檬酸钠缓冲液溶解)，注射剂量为120mg/kg。观测1周后，非空腹血糖水平高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型备用。其次，用1％戊巴比妥钠麻醉糖尿病小鼠，使用一次性活检穿刺机在小鼠背部上部创建一个椭圆形全厚度创面(直径10mm)。接着，将按照(2)中方法制备的1×108CFU/mL耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)悬液以50μL/只接种于创面，并共培育1天使其形成创面感染。最后，将新鲜制备的水凝胶注射于糖尿病小鼠的感染创面上，并在接下来的14天内观察和取样以表征伤口的感染情况和愈合情况。
本发明的有益效果在于：本发明制备得到的多肽水凝胶经过各项指标检测，水凝胶由多肽组装形成的纳米纤维相互缠绕形成，富含丰富的beta-sheet的结构。体外实验表明，所述多肽水凝胶具有较好的细胞相容性和血液相容性，并能够促进L-929细胞的增殖与黏附伸展；同时，该多肽水凝胶能够有效促进HUVEC细胞的迁移，并通过VEGFA与HIF-1α信号通路促进新血管的形成。除此之外，该水凝胶能够通过细胞膜破坏的方式杀灭革兰氏阳性菌(MRSA)与革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌)。体内实验显示，该水凝胶在注入糖尿病小鼠MRSA感染的伤口处后，能够有效杀灭伤口感染处的MRSA，显著促进伤口的愈合和伤口处新血管的形成，并且不会对小鼠的其他组织产生毒性。该水凝胶具有抗菌，促进细胞增殖，黏附以及成血管的能力，使其作为糖尿病慢性伤口的敷料具有很大的临床转化前景。
附图说明
图1为实施例1中制备的多肽水凝胶的小瓶倒置实验照片。
图2为实施例1中制备的多肽水凝胶的实物照片。
图3为实施例1中制备的多肽水凝胶的透射电镜图。
图4为实施例1中制备的多肽水凝胶的圆二色谱(CD)图。
图5为实施例2中水凝胶表面接种L-929细胞的CCK-8检测数据图。
图6为实施例2中水凝胶表面接种HUVEC细胞的CCK-8检测数据图。
图7为实施例2中水凝胶的溶血测试数据图。
图8为实施例2中水凝胶表面接种L-929细胞培养1天的形貌图(DAPI/鬼笔环肽染色)。
图9为实施例2中水凝胶表面接种HUVEC细胞的细胞迁移显微镜图。
图10为实施例2中水凝胶表面接种的HUVEC细胞培养3天后血管形成相关基因表达的qPCR数据图。
图11为实施例2中水凝胶表面接种的HUVEC细胞培养3天后血管形成相关蛋白表达的West Blotting数据图。
图12为实施例3中水凝胶杀伤MRSA和铜绿假单胞菌的平板涂布结果图。
图13为实施例3中水凝胶的杀伤MRSA和铜绿假单胞菌的活死细胞共聚焦图(钙黄绿素/碘化丙啶染色)。
图14为实施例3中水凝胶杀伤MRSA和铜绿假单胞菌的扫描电镜图片。
图15为实施例3中水凝胶抵抗MRSA生物被膜形成的结晶紫定量数据图。
图16为实施例3中水凝胶的抵抗MRSA生物被膜形成的3D共聚焦图(钙黄绿素/碘化丙啶染色)。
图17为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的伤口愈合照片。
图18为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的伤口尺寸统计图。
图19为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的组织切片苏木精伊红染色(H&E)染色图。
图20为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的MRSA平板涂布结果。
图21为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的抗MRSA效率结果。
图22为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的CD31染色的组织切片照片。
图23为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的CD31阳性细胞的数量统计图。
图24a和图24b分别为实施例4中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理4天、7天、14天的VEGFA和HIF-1α的免疫荧光染色图。
图25为实施例5中糖尿病小鼠MRSA感染伤口在水凝胶处理14天的心、肝、脾、肺、肾的HE染色组织切片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规条件或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合技术方案和附图详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1
多肽水凝胶的制备及形貌结构表征
多肽水凝胶的制备：称量1mg的多肽冻干粉末(Fmoc-LFKFFK-NH2)于容器内，加入3μL的二甲基亚砜(DMSO)，使多肽完全溶解，然后加入1mL pH＝6的PBS缓冲液，再利用移液枪将多肽溶液充分吸打混匀，使多肽在溶液中分布均匀，最后将混匀后的多肽溶液静置10分钟以上，即可获得稳定的质量分数为0.1wt.％的多肽水凝胶。如图1，倒置小瓶实验证明多肽水凝胶的形成。如图2，该方法制备得到的多肽水凝胶为透明且较为稳定。
多肽水凝胶的形貌(TEM)表征：按照上述方法制备0.1wt.％的多肽水凝胶，摇溶后，取出10μL滴于200目的碳支持膜上，待干燥后用1％磷钨酸溶液染色约30s，用超纯水清洗3次，干燥后用于TEM测试。如图3，该多肽水凝胶由致密的纳米纤维相互缠绕形成。
多肽水凝胶的二级结构(CD)表征：按照上述方法制备0.1wt.％的多肽水凝胶，摇溶后，转移至1mm内径的石英比色皿内，用于圆二色谱的测定(扫描范围190nm-260nm，扫描速度12nm/min)。如图4，195nm处的正峰与220nm处的负峰为beta-sheet结构的典型特征峰，这说明该多肽水凝胶的主要结构为beta-sheet。
实施例2
水凝胶对细胞生长行为的影响
按照实施例1中的水凝胶配制方法制备质量分数为0.15wt.％，0.2wt.％，0.3wt.％的多肽水凝胶，即分别称量1.5mg，2mg，3mg的多肽冻干粉末(Fmoc-LFKFFK-NH2)于EP管内，加入3μL的二甲基亚砜(DMSO)，使多肽完全溶解，然后加入1mL pH＝6的PBS缓冲液，再利用移液枪将多肽溶液充分吸打混匀，使多肽在溶液中分布均匀，即可分别获得灭菌好的稳定的质量分数为0.15wt.％，0.2wt.％，0.3wt.％的多肽水凝胶。最后以每孔10μL的量分别加入到96孔板内，最后将该96孔板在UV照射下静置过夜除菌。
水凝胶的细胞相容性分析：分别消化培养的L-929细胞和HUVEC细胞，离心后无菌条件下，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释至10000细胞/mL的密度并分别接种到上述已备的预先形成的水凝胶表面(共四个组，分别为control组，0.15wt.％凝胶组，0.2wt.％凝胶组，0.3wt.％凝胶组)，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞。在培养1天与2天后，移去原有培养基，以每孔100μL的含有10％的CCK-8的新鲜DMEM培养基分别加入到各个96孔板内，并共孵育2h。最后将这100μL的培养液转移至新的96孔板内，并用酶标仪测定其在450nm处的吸光值。如图5与图6，在共培育24h后，不同质量分数的水凝胶的L-929细胞和HUVEC细胞存活率均超过80％，这表明该水凝胶具有良好的细胞相容性。共温育48h后，所有组的细胞存活率均有所增加，组间的差距减小，这说明水凝胶同时具有促进细胞增殖的能力。
水凝胶的血液相容性分析：经眶后静脉丛采集兔的新鲜血液1ml，加入抗凝管中。2500rpm/min，4℃离心15min。弃上清，剩余的红细胞用10ml PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)重新悬浮，离心5次。取1mL红细胞悬液，分成5份，分别加入250μL PBS，0.15wt.％凝胶，0.2wt.％凝胶，0.3wt.％凝胶和0.1％TrixonX-100，室温孵育4h。其中以PBS为阴性对照，0.1％TrixonX-100为阳性对照。最后，将孵育完成后的悬液室温下离心10min,10000rpm/min。取上清液，用酶标仪测定其在541nm波长下的吸光度。溶血百分比＝(ODSample-ODPBS)/(ODTrixonX-100–ODPBS)。如图7，0.15wt.％，0.20wt.％，0.30wt.％水凝胶处理后的RBC形态与生理盐水处理组相似，并且未观察到明显的溶血现象，而0.1％Triton-100作为阳性对照展示出明显的溶血现象。具体而言，水凝胶处理组的溶血率分别为1.5％(0.15wt.％)，2.1％(0.20wt.％)，3.5％(0.30wt.％)，所有溶血率均低于5％，这处于血液相容性的正常范围内，这证明该多肽水凝胶显示出良好的血液相容性，有利于伤口愈合。
水凝胶促进细胞伸展表征：消化培养的L-929细胞，离心后无菌条件下，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释至10000细胞/mL的密度并分别接种到上述已备的预先形成的水凝胶表面(共四个组，分别为control组，0.15wt.％凝胶组，0.2wt.％凝胶组，0.3wt.％凝胶组)，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞。在培养1天后，移去原有培养基，用PBS洗涤3次，然后用4％的多聚甲醛固定15min，0.5％Triton-100处理5min。最后，分别用DAPI和TRITCPhalloidin染细胞的细胞核和细胞骨架，用激光共聚焦显微镜进行观察和拍照。如图8，与对照组相比，与水凝胶接触的细胞比对照组更加伸展，这可以归因于淀粉样蛋白的天然的来源于β折叠结构的细胞粘附特性。
水凝胶促进细胞迁移表征：消化培养的HUVEC细胞，离心后无菌条件下，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释至100000细胞/mL的密度并分别接种到上述已备的预先形成的水凝胶表面(共四个组，分别为control组，0.15wt.％凝胶组，0.2wt.％凝胶组，0.3wt.％凝胶组)，在37℃、5％CO2的条件下培养细胞。到细胞基本铺满时，用枪头划一条直线，然后用PBS洗涤2次，加入相同量的无血清培养基，共孵育12h。然后细胞用4％的多聚甲醛固定10min，再用0.4％的结晶紫染色5min，在显微镜下观察并拍照。如图9，与对照组相比，水凝胶处理组显示出更高的细胞迁移率，并且这种细胞迁移为多肽浓度依赖的。值得注意的是，0.3wt.％水凝胶的细胞迁移率约为对照组的6倍。这证明该多肽水凝胶具有良好的促进细胞迁移的能力。
水凝胶促进新血管形成的表征：消化培养的HUVEC细胞，离心后无菌条件下，用DMEM培养基(含10％胎牛血清)稀释至100000细胞/mL的密度并分别接种到上述已备的预先形成的水凝胶表面(共四个组，分别为control组，0.15wt.％凝胶组，0.2wt.％凝胶组，0.3wt.％凝胶组)，在37℃、5％CO2的条件下培养3天。使用Ezscript反转录试剂盒提取总RNA，然后使用SYBR PrimerScript RT-PCR试剂盒反转录成cDNA。合成的cDNA保存在-80℃。采用实时荧光定量PCR法检测每个样品中VEGFA、bFGFR、eNOS和HIF-1α的mRNA水平，检测方法如下:95℃5min,1个循环，95℃10s,60℃30s,40个循环。相关引物见表1，以GADPH为内参基因，采用2-△△Ct法计算各基因相对mRNA水平，每个反应进行三次。用RIPA提取细胞蛋白，用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。然后，用10％SDS-PAGE凝胶分离30μg蛋白样品，转染PVDF膜。用无蛋白快速阻断缓冲液阻断膜，然后与一抗在4℃孵育过夜。第二天，清洗膜并和二抗共孵育。所有抗体均购自美国Abcam公司，清单如下:HIF-1a(1:50 00)，VEGFA(1:1000)，β-actin(1:20 00)。使用增强的Pico光化学发光试剂盒(EpiZyme,Shanghai,China)对蛋白质进行可视化。在伤口愈合过程中，血管生长受某些生长因子如血管内皮生长因子(VEGFA)和内皮细胞表达的包含bFGFR，eNOS和HIF-1α的血管生成分子的调控。如图10所示，在含水凝胶的组中VEGFA的表达明显高于对照组，并且随着水凝胶浓度的增加，VEGFA的表达水平明显增加。在bFGFR，eNOS和HIF-1α的表达中也可以观察到类似的结果。WB结果证实了VEGFA和HIF-1α的蛋白表达水平。如图11所示，水凝胶组中VEGFA和HIF-1α蛋白的表达明显超过了对照组，并显示出与qPCR结果相同的肽浓度依赖性方式。这些数据表明，水凝胶可以通过促进血管生成相关信号(如VEGFA，FGFR，e-NOS和HIF-1α)的高表达来加速血管生成。
实施例3
水凝胶的抗菌及抗生物被膜性能表征
按照实施例1中的水凝胶配制方法制备质量分数为0.15wt.％，0.2wt.％，0.3wt.％的多肽水凝胶，即分别称量1.5mg，2mg，3mg的多肽冻干粉末(Fmoc-LFKFFK-NH2)于EP管内，加入3μL的二甲基亚砜(DMSO)，使多肽完全溶解，然后加入1mL pH＝6的PBS缓冲液，再利用移液枪将多肽溶液充分吸打混匀，使多肽在溶液中分布均匀，即可分别获得灭菌好的稳定的质量分数为0.15wt.％，0.2wt.％，0.3wt.％的多肽水凝胶。最后以每孔250μL的量分别加入到24孔板内，最后将该24孔板在UV照射下静置过夜除菌。
水凝胶抗菌性能平板计数表征：首先，将甘油冻存的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa 96272)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 43300)分别涂布于不同的绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。分别收集两种菌的单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至106CFU/mL的细菌浓度。最后，在已备的预铺好水凝胶的24孔板中每孔加入500μL上述1×106CFU/mL的菌悬液，37℃共培育6个小时。之后每孔取10μL样品进行梯度稀释和平板涂布，每种样品三个平行，涂布好的平板放置在37℃培养箱内过夜培养后进行计数和拍照。如图12，在0.15wt.％的低浓度下，这些水凝胶对MRSA均显示超过99％(99.12％)的抗菌效率，以及0.20wt.％和0.30wt.％水凝胶的抗MRSA效率分别达到99.36％和99.59％，水凝胶也显示出对革兰氏阴性菌–铜绿假单胞菌的强大杀菌活性，其中0.15wt.％，0.20wt.％，0.30wt.％的水凝胶抗铜绿假单胞菌效率分别达到99.61％，99.62％，和99.96％。这些结果证明，该多肽水凝胶在显示出较强的广谱抗菌活性，既能杀伤革兰氏阳性菌又能杀伤革兰氏阴性菌。
水凝胶抗菌性能活死菌染色表征：首先，将甘油冻存的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa 96272)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA43300)分别涂布于不同的绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。分别收集两种菌的单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至106CFU/mL的细菌浓度。最后，在已备的预铺好水凝胶的24孔板中每孔加入500μL上述1×106CFU/mL的菌悬液，37℃共培育6个小时。上述样品利用活/死细菌生存试剂盒(L13152,Invitrogen)进行检测。将水凝胶处理6h后的菌悬液用PBS轻轻冲洗3次，然后加入500μL染色试剂混合物，避光染色30min。最后，用荧光显微镜观察菌细菌的死活状态。绿色荧光代表活的细菌，而红色荧光代表死的细菌。如图13，与平板计数结果相类似，对照组基本无死亡的细菌，，而0.15wt.％，0.20wt.％，0.30wt.％的水凝胶处理组则几乎没有发现活的细菌。
水凝胶抗菌性能扫描电镜表征：首先，将甘油冻存的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa 96272)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA43300)分别涂布于不同的绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。分别收集两种菌的单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至106CFU/mL的细菌浓度。最后，在已备的预铺好水凝胶的24孔板中每孔加入500μL上述1×106CFU/mL的菌悬液，37℃共培育6个小时。将上述样品用PBS微洗三次，2.5％戊二醛固定后放置在4℃过夜。第二天，将上述固定样品在50、70、80、90、95、99和100v/v％的梯度乙醇水溶液中脱水10min，然后冷冻干燥，用SEM检测。如图14，扫描电子显微镜(SEM)结果显示，对照组中的MRSA和铜绿假单胞菌均具有清晰的结构和光滑的细胞表面，而水凝胶处理组中的细菌的表面则变得起皱和塌陷。这些结果表明，该多肽水凝胶杀灭微生物可能通过破坏细菌的细胞膜来实现的。
体外抗生物被膜结晶紫染色定量表征：首先，将甘油冻存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 43300)涂布于绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。收集单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至106CFU/mL的细菌浓度。最后，在已备的预铺好水凝胶的24孔板中每孔加入500μL上述1×106CFU/mL的菌悬液，37℃共培育2天。将培育后的样品用PBS轻轻地清洗掉浮游的MRSA，然后每孔添加500μL甲醇固定15min。最后每孔加入500μL 0.4％结晶紫溶液(乙醇溶解)，共孵育15min。检测其在590nm处的吸光度值。如图15，与对照组相比，在水凝胶处理组中几乎没有观察到连续且致密的生物膜。此外，生物被膜的数量随着多肽浓度的增加而减少，最大的生物被膜抑制率可达到91.57％。上述结果证明，该多肽水凝胶具有一定的抵抗生物被膜形成的能力。
体外抗生物被膜3D激光共聚焦表征：首先，将甘油冻存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 43300)涂布于绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。收集单菌落接种于4mLTSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至106CFU/mL的细菌浓度。最后，在已备的预铺好水凝胶的24孔板中每孔加入500μL上述1×106CFU/mL的菌悬液，37℃共培育2天。将培育后的样品用PBS轻轻地清洗掉浮游的MRSA。上述样品利用活/死细菌生存试剂盒(L13152,Invitrogen)进行检测。加入500μL染色试剂混合物，避光染色30min。最后，用荧光显微镜的3D成像模式观察和记录MRSA生物被膜的状态。绿色荧光代表活的细菌，而红色荧光代表死的细菌。如图16所示的共聚焦显微镜的三维扫描模式下，对照组中观察到活的和密集的生物被膜，而在水凝胶处理的组中仅发现稀疏和受损的具有完全死亡细菌的生物被膜，其中生物被膜的缺陷程度与水凝胶浓度密切相关。这些数据证明，该多肽水凝胶具有抑制生物被膜形成的能力，用作伤口敷料可以避免过度发炎并能加速伤口的愈合。
实施例4
水凝胶对糖尿病小鼠MRSA感染伤口的治疗效果表征
水凝胶样品制备：按照实施例1中的水凝胶配制方法制备质量分数为0.15wt.％，0.3wt.％的多肽水凝胶，即分别称量1.5mg，3mg的多肽冻干粉末(Fmoc-LFKFFK-NH2)于EP管内，加入3μL的二甲基亚砜(DMSO)，使多肽完全溶解，然后加入1mL pH＝6的PBS缓冲液，再利用移液枪将多肽溶液充分吸打混匀，使多肽在溶液中分布均匀，即可分别获得灭菌好的稳定的质量分数为0.15wt.％，0.3wt.％的多肽水凝胶，UV照射下静置过夜除菌。PBS处理作为阴性对照，商业化的Prontonsan水凝胶作为阳性对照。
糖尿病小鼠伤口模型构建：将6周龄的C57健康小鼠禁食1天，然后腹腔注射新鲜制备的链脲佐菌素(STZ)溶液(10mg/mL，柠檬酸钠缓冲液溶解)，注射剂量为120mg/kg。观测1周后，非空腹血糖水平高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型备用。其次，用1％戊巴比妥钠麻醉糖尿病小鼠，使用一次性活检穿刺机在小鼠背部上部创建一个椭圆形全厚度创面(直径10mm)。
促进糖尿病小鼠的MRSA感染伤口的促愈合能力表征：首先，将甘油冻存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 43300)涂布于绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。收集单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至1×108CFU/mL的细菌浓度。以50μL/只接种于糖尿病小鼠的创面，并共培育1天使其形成创面感染。接着，将新鲜制备的水凝胶(0.15wt.％和0.3wt.％)以及阳性对照(Prontonsan水凝胶)和阴性对照(PBS缓冲液)分别注射于糖尿病小鼠的感染创面上。在接下来的第4天，第7天和第14天内分别观察伤口愈合情况并拍照，并对伤口的尺寸进行统计分析。同时，在上述时间内取样做组织切片的苏木精伊红染色(H&E)染色观察。如图17和图18，与PBS处理组相比，其他三组在糖尿病伤口的愈合方面显示出更好的效果，并且在0.3wt.％的的水凝胶治疗组中观察到最快的愈合速度。另外，两个不同浓度的水凝胶治疗组均比商业化的Prontosan水凝胶具有更好的糖尿病伤口愈合能力，这表明该多肽水凝胶具有很大的临床潜力。对以上四个治疗组的MRSA感染的糖尿病小鼠伤口的皮肤组织进行组织学分析如图19，分别在第4天和第7天在所有组中观察到肉芽组织和新形成的真皮，并且最完整的肉芽组织和真皮形成只在0.3wt.％水凝胶处理组被观察到。类似地，在0.3wt.％的水凝胶处理后第14天，新形成的表皮完好无损，而在Prontosan水凝胶和0.15wt.％的水凝胶中仍然观察到一些缺损。在PBS处理的组中几乎没有发现新形成的表皮。上述结果表明，该多肽水凝胶在糖尿病小鼠的MRSA感染伤口模型中具有良好的促进伤口愈合的能力，且展现出比商业化的Prontosan水凝胶更好的效果，具有很好的临床转化潜力。
促进糖尿病小鼠的MRSA感染伤口的抗菌能力表征：首先，将甘油冻存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 43300)涂布于绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。收集单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH7.4)离心洗涤两次，并稀释至1×108CFU/mL的细菌浓度。以50μL/只接种于糖尿病小鼠的创面，并共培育1天使其形成创面感染。接着，将新鲜制备的水凝胶(0.15wt.％和0.3wt.％)以及阳性对照(Prontonsan水凝胶)和阴性对照(PBS缓冲液)分别注射于糖尿病小鼠的感染创面上。在接下来的第4天，第7天和第14天内分别伤口处的组织液，并将组织液进行平板涂布以表征水凝胶的体内抗菌能力。图20和图21显示了不同组别处理后的平板涂布照片和相应的细菌杀灭率，可以发现在PBS处理的组中细菌的数目几乎没有变化，而在其他三个组中观察到了不同程度的减少。处理10天后，MRSA在0.3wt.％的水凝胶组被完全杀死，而在10天后的Prontonsan水凝胶和0.15wt.％水凝胶中仍发现约1.4％和0.1％的存活细菌，还可发现该多肽水凝胶的抗菌活性与多肽浓度呈正相关，并且该水凝胶的抗菌能力要优于Prontonsan水凝胶。
促进糖尿病小鼠的MRSA感染伤口的促新血管形成能力表征：首先，将甘油冻存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 43300)涂布于绵羊血琼脂(SBA)平板上，37℃培养过夜。收集单菌落接种于4mL TSB培养基中，37℃震荡培养过夜。之后用无菌的PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)离心洗涤两次，并稀释至1×108CFU/mL的细菌浓度。以50μL/只接种于糖尿病小鼠的创面，并共培育1天使其形成创面感染。接着，将新鲜制备的水凝胶(0.15wt.％和0.3wt.％)以及阳性对照(Prontonsan水凝胶)和阴性对照(PBS缓冲液)分别注射于糖尿病小鼠的感染创面上。在接下来的第4天，第7天和第14天内分别取伤口处的组织进行CD31免疫组化染色和VEGF-HIF1α的免疫荧光染色，以表征该水凝胶的促新血管形成的能力。如图22和图23所示，与PBS处理组相比，其他各组均具有促进血管生成的能力，并且随着治疗时间的增加，新形成的血管数量明显增加。其中，治疗14天后，0.3wt.％水凝胶中的新血管数目约为对照组的3.5倍。如图24a和24b所示，相较于PBS处理组，水凝胶处理组的VEGFA和HIF1α拥有更高的免疫荧光强度，这证明了该多肽水凝胶具有促进新血管形成的能力。
实施例5
水凝胶对糖尿病小鼠的生物安全性
水凝胶对糖尿病小鼠的生物安全性表征：取实施例4中处理后的糖尿病小鼠的心、肺、肝、脾、肾进行组织切片苏木精伊红染色(H&E)染色观察。如图25所示，该多肽水凝胶未对小鼠的各个组织脏器有明显的毒性，证明该多肽水凝胶在体内有一定的生物安全性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种多肽水凝胶，其特征在于，所述的多肽水凝胶包括自组装多肽，所述的多肽的序列结构为：Fmoc-LFKFFK-NH2。
2.一种权利要求1所述的多肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
S1、称量所述的自组装多肽冻干粉末于容器内；
S2、加入二甲基亚砜，使多肽完全溶解；
S3、加入PBS缓冲液，使多肽在溶液中分布均匀；
S4、将混匀后的多肽溶液静置10分钟以上，即可获得稳定的多肽水凝胶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤S1中，多肽冻干粉末的纯度≥95%。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤S2中，二甲基亚砜的用量不高于0.3%。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤S3中，PBS缓冲液的pH小于7。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤S3中，PBS缓冲液的pH为6。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤S4中，混匀后的多肽溶液的终浓度大于等于0.1 wt.%。
8.一种权利要求1所述的多肽水凝胶在制备治疗伤口愈合药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的伤口为糖尿病慢性伤口。
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基于Fmoc修饰的氨基酸、短肽组装体系结构调控及生物医药应用;宋静文;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》;20190515(第5期);摘要、第3页第1.3.1 *
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