CN112143726A - 一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大肠杆菌‑亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，利用生物淘选技术得到目标蛋白的亲和噬菌体，将所述亲和噬菌体与大肠杆菌共培养得到有大量亲和噬菌体分布的大肠杆菌生物被膜，再将含有荧光标记的目标蛋白溶液与所述生物被膜共孵育后，将目标蛋白特异性地固定化并展示到生物被膜的表面。本发明为生物材料，尤其是多肽和蛋白的固定化展示提供了一种新的方法和思路，在蛋白的分离、固定化等方面具有重要的应用价值。

Description

一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法

技术领域

本发明涉及微生物和生物材料领域，更具体地讲，涉及一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，入侵人体后可能引发一系列局部化脓性感染、脏器感染甚至致命的全身性感染，具有极强的致病性。酚溶调制肽(PSMs)为金葡球菌的主要毒力因子，其分泌出金葡球菌胞外后与宿主体内细胞的作用能够引发炎症反应、裂解破坏宿主细胞发挥细胞毒性、裂解白细胞逃避宿主免疫系统的攻击并破坏宿主的免疫系统，为金葡球菌细胞毒性的重要执行者，极具代表性。而PSMs中PSMα3的细胞裂解活性最强，因此PSMα3通常作为金葡球菌毒力因子的代表被研究。PSMα3在体外易形成纤维结构，因而其单体的分离研究以及组装规律的研究就成为热点。

噬菌体展示技术是将编码目的蛋白或多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，被展示的蛋白或多肽可保持相对的空间结构和生物活性并展示在噬菌体的表面。导入了各种各样外源基因的噬菌体则能构成一个噬菌体展示库。当用目的蛋白或多肽去筛查噬菌体展示库时，就会选择性地同与有相互作用的外源多肽相结合，然后分离出噬菌体展示库里的特定的亲和噬菌体，再通过基因组测序也能推出亲和多肽的氨基酸序列。

生物被膜(Biofilm)是微生物在界面的普遍生存形式。由于界面的存在，产生大量包裹微生物菌体并粘附于界面的胞外聚合基质(Extracellular Polymeric Substance,EPS)，对形成微生物群落和抵抗外界环境具有重要作用。生物被膜的形成包括附着、增殖、成熟及脱离过程等四个阶段。生物被膜中微生物个体的生存状态与体相悬浮状态下不同，具有群体密度大、生命周期长、生产效率高、抗逆性等显著优势。而且生物被膜与人类的生产生活关系非常密切，一方面它可直接在人体组织及器官的表面形成生物膜，引起诸如牙周病、慢性支气管炎、败血病等难治疾病；另一方面，它所形成的致密的膜结构是一个可工程化设计的优良展示载体。目前对生物被膜的工程化设计，主要集中于菌株本身的改造，而细菌与噬菌体等共生关系的挖掘对于生物被膜改造的研究还未见报道。生物淘选中所用的噬菌体一般为M13噬菌体，属于温和型噬菌体，不会造成宿主菌的裂解死亡。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，基于噬菌体与大肠杆菌两者相互依存的关系以及噬菌体的可编程性，对大肠杆菌的生物被膜进行工程化设计。

为了实现上述目的，本发明提供了一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，利用生物淘选技术得到目标蛋白的亲和噬菌体，将所述亲和噬菌体与大肠杆菌共培养得到有大量亲和噬菌体分布的大肠杆菌生物被膜，再将含有荧光标记的目标蛋白溶液与所述生物被膜共孵育后，将目标蛋白特异性地固定化并展示到生物被膜的表面。

作为一个优选方案，生物淘选中所用的噬菌体为M13噬菌体。

本发明中大肠杆菌优选为携带有性菌毛的雄性大肠杆菌，比如ER2738。生物淘选中所用的噬菌体为温和型噬菌体，因为温和型噬菌体不会导致宿主菌裂解，而是与宿主共生。目前成熟的噬菌体展示系统有四种：M13噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统，只有M13噬菌体和λ噬菌体展示系统是温和型噬菌体。利用M13噬菌体与大肠杆菌两者相互依存的关系以及M13噬菌体的可编程性，对大肠杆菌的生物被膜进行工程化设计。

作为一个优选方案，所述目标蛋白为PSMα3。

作为进一步优选方案，目标蛋白为PSMα3时，所述亲和噬菌体所包含的插入多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.4任一所示。

本发明优选实施例中，首先利用生物淘选的技术获得了特异性结合PSMα3的亲和噬菌体VN7P(SEQ ID NO.1)，AR7P(SEQ ID NO.2)，SN7P(SEQ ID NO.3)，ID7P(SEQ IDNO.4)，然后将ID7P与大肠杆菌ER2738在MM培养基的条件下共培养得到的含有均匀且大量的ID7P的大肠杆菌生物被膜。再将含有荧光标记的靶标分子FITC-PSMα3的溶液与上述生物被膜共孵育后，最终将PSMα3特异性地固定化并展示到生物被膜的表面。亲和噬菌体ID7P的加入量在10⁹pfu时所形成的生物被膜的量比单独大肠杆菌ER2738所形成的生物被膜的量减少约30％。FITC荧光检测及激光共聚焦的结果表明，与单独大肠杆菌、加入非特异性片段插入型噬菌体以及加入多肽片段空载型噬菌体(Empty or No-load Phage)等三个对照组相比，加入ID7P的大肠杆菌生物被膜对FITC-PSMα3具有更高的亲和力和更优的固定化展示效果。

本发明的优点在于，本发明提供的生物被膜固定化展示方法具有更高的亲和力和更优的固定化展示效果，生物被膜体系可依据不同的目标蛋白对亲和噬菌体进行重新筛选并设计，具有一定的可编程性，在目标蛋白的分离、固定化展示、组装等多个方面具有应用价值。本发明为生物材料，尤其是多肽和蛋白的固定化展示提供了一种新的方法和思路，在蛋白的分离、固定化等方面具有重要的应用价值。

附图说明

图1为PSMα3亲和噬菌体筛选过程中加入噬菌体量、洗脱噬菌体量及每个轮次噬菌体回收率。

图2为7个亲和噬菌体测序样品中所包含的亲和多肽的氨基酸序列及其基本性质。

图3为PSMα3亲和噬菌体ELISA验证结果。

图4为ID7P所含亲和多肽ID7与PSMα3的相互作用预测模型。

图5为结晶紫定量加入不同种类、不同数量的噬菌体对大肠杆菌生物被膜的影响。

图6为加入不同种类的噬菌体(10⁹pfu)对大肠杆菌生物被膜结晶紫定量照片。

图7为加入不同种类的噬菌体(10⁹pfu)对大肠杆菌生物被膜光学显微镜照片。

图8为加入不同种类的噬菌体(10⁹pfu)所形成的大肠杆菌生物被膜上经过梯度洗脱后固定化展示FITC-PSMα3的激光共聚焦显微镜结果。

图9为加入不同种类的噬菌体(10⁹pfu)所形成的大肠杆菌生物被膜上经过梯度洗脱后所得到的洗脱液的FITC荧光检测结果。

图10为大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法的示意图。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

本发明所用的M13噬菌体库和大肠杆菌均来源于Ph.D.-7噬菌体展示文库试剂盒(新英格兰生物学实验室公司)。

实施例1.PSMα3的亲和噬菌体的筛选

①靶标的准备及宿主菌的活化：

a.将甘油保存的菌种ER2738划线接种于LB-Tet平板，37℃倒置培养过夜。封口膜封闭后4℃避光保存。

b.准备6个小型灭菌聚苯乙烯培养皿，每个加入1.5mL的100μg/mL的链霉亲和素溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO₃)，充分旋转润湿表面。

c.增湿容器中4℃轻微震荡孵育过夜，4℃贮存备用。

d.从LB-Tet平板上挑取ER2738单克隆接种到20mL LB液体培养基中，用250mL三角瓶37℃剧烈震荡培养至对数前期。

e.取一个包被好的板，把包被液倒掉，板在干净纸巾上用力拍甩，尽量甩掉残余溶液。每板中加满封阻液，在4℃孵育1h。

f.在DMSO中配制生物素标记PSMα3的母液5mg/mL；取母液3μL和原始文库10μL混合于1.5mL的TBST中，室温作用60min。

g.倒掉封阻液，再用TBST缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以充分洗涤，倒掉缓冲液，拍掉残余溶液。

②噬菌体的初筛：

a.取一个清洗过的封阻板，加入噬菌体-靶蛋白溶液，室温温育10min。

b.加入生物素至终浓度0.1mM，继续温育5min。

c.倾倒除去未结合噬菌体，甩掉残余溶液。

d.用TBST洗板10次。

e.用1mL的0.2M Glycine-HCl缓冲液(pH 2.2)来分离已结合的分子。温和摇动大于10min，然后把洗脱液吸到另一干净离心管里，再用150μL的1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.1)中和上述洗脱液。

③洗脱物的滴度测定：

a.将ER2738单菌落接种于5-10mL LB培养基中，震荡培养至OD₆₀₀约为0.5。

b.微波炉融化上层琼脂，每一噬菌体稀释度的管加3mL上层琼脂于灭菌试管中，保存于45℃备用。

c.将LB/IPTG/Xgal平板在37℃预温。d.用LB培养基对噬菌体进行10倍系列稀释。对未扩增的淘选洗脱物进行10¹-10⁴稀释。

e.当菌体培养物达对数中期，每一噬菌体稀释度的管加200μL培养物于微量离心管中。

f.把10μL不同稀释度的噬菌体分别加到每个管中，震荡以充分混匀，室温温育1-5min。

g.把感染细胞加入上层琼脂培养管(45℃预温)中，快速而充分的混匀，立即倾倒在LB/IPTG/Xgal平板(37℃预温)上，均匀铺开。

h.平板冷却凝固后，在37℃倒置培养过夜。

i.计数蓝色噬菌斑少于100个的平板上的蓝斑数。然后乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的滴度。

④噬菌体的扩增：

a.把剩余洗脱物接种到20mL ER2738对数前期的培养物中，37℃培养4.5h，剧烈摇动培养。

b.培养物转移到一个离心管里，在4℃下10000rpm离心10min。上清液转到新离心管里，再离心。

c.使用移液器取出上清的上部80％，放到一个新管里，加入1/6体积的PEG/NaCl缓冲液，使噬菌体4℃沉淀过夜。

d.4℃10000rpm离心15min。上清液倒掉后，再短暂离心，利用移液器吸去残留上清液。

e.沉淀物用1mL TBS缓冲液重悬，转入新离心管，在4℃下离心5min，以沉淀残余细胞。

f.上清液再转移到新离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl缓冲液进行沉淀。冰上作用15-60min。然后在4℃下离心10min，倒掉上清，再短暂离心，吸去残余上清。

g.沉淀物重悬于200μL TBS中。离心溶液1min，把不溶物都沉淀。上清移到另一新离心管，得到扩增后的洗脱物，4℃贮存。

⑤扩增后噬菌体滴度的测定：

a.ER2738单菌落接于5-10mL LB培养基中，震荡培养至OD₆₀₀约为0.5。

b.微波炉融化上层琼脂，每一噬菌体稀释度的管加3mL上层琼脂于灭菌试管中，保存于45℃备用。

c.将LB/IPTG/Xgal平板在37℃预温。

d.用LB培养基对噬菌体进行10倍系列稀释。对扩增的噬菌体培养物上清进行10⁸-10¹¹稀释。

e.当菌体培养物达对数中期，每一噬菌体稀释度的管加200μL培养物于微量离心管中。

f.把10μL不同稀释度的噬菌体分别加到每个管中，震荡以充分混匀，室温温育1-5min。

g.把感染细胞加入上层琼脂培养管(45℃预温)中，快速而充分的混匀，立即倾倒在LB/IPTG/Xgal平板(37℃预温)上，均匀铺开。

h.平板冷却凝固后，在37℃倒置培养过夜。

i.计数蓝色噬菌斑数少于100个的平板上的蓝斑数量。然后乘以稀释因子即得到每10μL噬菌体的滴度。

⑥第2-3轮淘选：

a.根据上述步骤3对平板上的蓝色噬菌斑进行计数以计算滴度。并用该值来估算相应于1-2×10¹¹pfu的加入量。

b.进行第2-3轮淘选，方法同上，在清洗步骤中逐步提高吐温的浓度(0.3％-0.5％)，以提高筛选的严格性和特异性。每一轮淘选的滴度测定及回收率结果展示在图1。

⑦单克隆的扩增纯化及噬菌体DNA的提取：

a.取ER2738的LB-Tet过夜培养物，以1:100的比例稀释接种到LB培养基，分2mL到培养管中。每个要鉴定的克隆选取一管。由第三轮淘选的样品中挑取16个克隆。

b.37℃震荡培养4.5-5h。

c.培养物转到离心管中，离心30s。把上清转到一个新管，再离心。使用移液枪把80％的上清取出，转到新的离心管，得到扩增噬菌体贮液，可以4℃短期贮存。

d.500μL噬菌体上清转到另一新管。

e.加入200μL的PEG/NaCl溶液，充分混匀后室温作用10-20min。

f.14000rpm离心10min，弃上清液。

g.短暂离心后移液器吸去残余上清。

h.沉淀物彻底重悬于100μL碘化物缓冲液中，剧烈敲击试管确保沉淀溶解。加入250μL乙醇，室温温育10min。

i.14000rpm离心10min，弃上清。用0.5mL的70％的乙醇洗沉淀，离心弃上清后短暂真空干燥。

j.沉淀重悬于30μL TE缓冲液中，-20℃贮存。

⑧亲和噬菌体的DNA测序及所包含亲和多肽序列分析

经测序公司测序后，结合引物序列与M13噬菌体序列以及遗传密码表，分析得到16个测序样品中所包含的亲和多肽氨基酸序列VN7P(SEQ ID NO.1)，AR7P(SEQ ID NO.2)，SN7P(SEQ ID NO.3)，ID7P(SEQ ID NO.4)(如图2)。

实施例2.PSMα3的亲和噬菌体亲和力的预测与验证

①酶联免疫吸附试验(ELISA)

a.在5mL LB液体试管中过夜培养单克隆宿主菌ER2738，加入5μL四环素抗生素。

b.将过夜培养的ER2738菌液按1:100的比例稀释于20mL LB培养基中。

c.对每一个要鉴定的噬菌斑克隆，向每瓶ER2738培养液中加入5μL噬菌体溶液，37℃，通气培养4.5h。

d.将上述培养物转入50mL灭菌新鲜离心管中，4℃，12,000g离心10min。上清液移入新鲜离心管，再次短暂离心，去除多余细胞和碎片。

e.取80％离心后上清至新鲜离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl溶液。放入4℃冰箱中静置沉淀过夜。取出过夜沉淀的离心管，4℃，12,000g下离心15min，弃上清，再离心1min，吸去残余上清。

f.取1mL TBS缓冲液重悬沉淀，将悬液转入新鲜EP管中，4℃，14,000rpm下离心5min，除去多余的残留细胞或杂质。

g.上清转入新鲜EP管中，加1/6体积的20％PEG/NaCl沉淀噬菌体，冰浴处理15-60min。4℃，14,000rpm下离心10min，弃上清，再离心1min，吸去残余上清。

h.取50μL TBS缓冲液重悬沉淀，取其中的10μL测定噬菌体滴度，37℃过夜培养。剩余噬菌体4℃贮存。

i.靶分子PSMα3按照每孔100μL的体积(溶于0.1M pH8.6 NaHCO₃，浓度为100μg/ml)包被96孔板，每个待鉴定克隆一排包被孔。在排有湿纸巾的封口塑料盒中4℃包被过夜。

j.甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在纸巾上除去残液。每孔加满封阻液。另外，每个待鉴定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以检测所选序列对BSA包被塑料板的结合力。

k.甩出封阻液，用1×TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液，Tween浓度为0.5％。

l.在单独的封阻板中每孔预先加入200μl TBS/T，从每排第一孔加入10¹²个病毒子开始对噬菌体进行4倍系列稀释至第12孔2×10⁵个病毒子。

m.用多通道移液枪将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子PSMα3的板中。室温震荡作用1h。用1×TBS/Tween洗板6次。

n.在封阻液中以1:5000的比例稀释HRP标记的抗-M13抗体。每孔加入200μl稀释后的抗体，室温震荡作用1h。用1×TBS/Tween洗板6次。

o.按下述方法准备HRP底物溶液：将22mg ABTS溶于100ml 50mM的柠檬酸钠溶液(pH 4.0)中，过滤除菌，4℃贮存。对每个待检测板，于检测步骤前将36μl 30％的H₂O₂加入21ml ABTS贮液中。

p.每孔加200μl底物溶液，室温作用10-60min。用酶标仪测定405nm处的吸光值。

所得数据作图如图3，由此可知，含有ID7插入多肽片段的亲和噬菌体与靶标分子PSMα3之间的亲和力更强，而且与将BSA作为靶标的对照组相比，其特异性也较强。后续将选择ID7P(含有ID7插入序列的亲和噬菌体)作为实验组进行测试。

②亲和多肽与PSMα3相互作用预测

从PDB数据库中已发表的PSMα3(6NIV)的蛋白质结构。通过Ressource ParisienneBioInformatique Structurale在线服务器的Peptide sitefinder功能模块(NucleicAcids Research,2014)进行结合模式预测，如图4。图4不仅显示了PSMα3(6NIV)和亲和噬菌体ID7P的结构，而且显示两者的结合方式。就结合位点而言，PSMα3(6NIV)上显示的深色区域为最可能结合位点，超过90％的可能性，略浅色区域为70％以上可能性，其余的近白色区域的结合可能性则更低。该方法从理论上证实了，PSMα3(6NIV)与亲和噬菌体ID7P存在特异性相互作用。

实施例3.噬菌体的加入量对大肠杆菌ER2738菌膜生长的影响

①MM培养基：

每1L MM培养基含200mL 5*M9培养液，800mL去离子水，121℃高压灭菌20分钟。待冷却后加入2mL 1M MgSO₄，0.1mL 1M CaCl₂，20mL 20％葡萄糖。

5*M9储存液：每1L含64g Na₂HPO₄·7H₂O，15g KH₂PO₄，2.5g NaCl，5.0g NH₄Cl。

②亲和噬菌体-大肠杆菌生物被膜体系的培养

a.挑取ER2738单菌落至LB培养基中，37℃，200rpm/min过夜培养。

b.每个共聚焦平皿中加入1mL的菌液，37℃静置培养4小时。其中，每次试验使用12个平皿，设实验组(ID7P)、阴性对照组(ER2738 only)和阳性对照组(KG7P和Empty phage)，每组三个噬菌体浓度梯度。

c.倒去菌液，用0.9％NaCl溶液轻洗平皿1次，使未结合到平皿底部的菌体以及杂质去除。

d.每个平皿内加入100μL MM培养基，另外，实验组(ID7P)和阳性对照组(KG7P和Empty phage)均加入1μL噬菌体原液(约10⁸、10⁹、10¹⁰pfu)，37℃静置培养48h。

e.倒去菌液，每平皿加入1mL去离子水清洗一次并风干。此时用光学显微镜观察，拍照如图5。每平皿加入100μL 0.2％结晶紫染液染色15分钟。倒去染色液，用温和的水流洗去多余结晶紫染液，直至倒出的水不再线紫色。此时对平皿拍照，获得不同组别的结晶紫定量的结果如图6。再用75％乙醇溶液脱色，在595nm处检测吸光度，作图如图7。

由此可见，噬菌体的加入会对大肠杆菌的生物被膜形成有一定的抑制作用。这种抑制作用来源于噬菌体对大肠杆菌的侵染，虽然不至于使大肠杆菌裂解死亡，但在一定程度上能延缓它的增殖。但从生物被膜结晶紫定量结果上看，在不同种类、不同浓度的噬菌体加入后，生物被膜的量依然能够保持在60％以上，甚至70％，而且在光学显微镜下，生物被膜中的菌体依然非常致密，对平皿底部的覆盖率依然很高。我们从中选取10⁹pfu作为后续验证实验的噬菌体加入量。

实施例4.亲和噬菌体-大肠杆菌生物被膜体系对靶标分子PSMα3的固定化展示性能表征

①亲和噬菌体-大肠杆菌生物被膜体系的培养

a.挑取ER2738单菌落至LB培养基中，37℃，200rpm/min过夜培养。

b.每个共聚焦平皿中加入1mL的菌液，37℃静置培养4小时。其中，每次试验使用12个平皿，设实验组(ID7P)、阴性对照组(ER2738 only)和阳性对照组(KG7P和Empty phage)，每组三个平行样。注：KG7P为与PSMα3非特异性结合的噬菌体，Empty phage为不含有插入展示多肽序列的空载噬菌体。

c.倒去菌液，用0.9％NaCl溶液轻洗平皿1次，使未结合到平皿底部的菌体以及杂质去除。

d.每个平皿内加入100μL MM培养基，另外，实验组(ID7P)和阳性对照组(KG7P和Empty phage)均加入1μL噬菌体原液(约10⁹pfu)，37℃静置培养48h。

②激光共聚焦和FITC荧光检测生物被膜体系对FITC-PSMα3的固定化展示性能

a.用0.9％NaCl溶液轻洗如上所述生长有生物被膜的平皿1次。

b.此后的每步操作需要避光。用DMSO溶解多肽FITC-PSMα3至1mg/mL，取出120μL上述多肽溶液，用0.9％NaCl溶液稀释至12mL，充分混匀。

c.每个平皿内加入1mL上述多肽稀释液，避光共孵育15min。

d.倒出多余液体，并用0.9％NaCl溶液，然后用0.5％TBS/Tween清洗一次，最后用超纯水清洗平皿两次，超净台避光风干后用锡箔纸包被用于激光共聚焦检测，结果如图8。

e.在上述处理之后，每个平皿每次用1mL 0.8％TBS/Tween清洗6次，并分别将6次清洗液收集于EP管内，用于FITC荧光检测，以此来定量FITC-PSMα3的固定化展示量，结果如图9。

根据激光共聚焦定性结果与FITC荧光检测定量结果可知，亲和噬菌体ID7P-大肠杆菌生物被膜体系对FITC-PSMα3的固定化展示性能最好，约为其他对照组(阴性对照组ER2738 only和阳性对照组KG7P和Empty phage)的1.75～2倍，这说明亲和噬菌体ID7P在大肠杆菌生物被膜展示FITC-PSMα3的过程中起到了至关重要的作用，同时证明了亲和噬菌体ID7P与PSMα3之间具有很强的亲和力。

本发明提供了一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法。其中，亲和噬菌体的筛选依据所想要分离、固定化展示的靶标分子而定，这给予了该方法一定的可编程性。本发明提供的方法在靶标分子的分离、固定化展示、组装等多个方面的研究中具有重要的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法

<130> /

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Gly Val Thr Leu Val Asn

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Tyr Gln Val Val Leu Arg

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ala Tyr Asp Ala Gln Asn

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Pro Tyr Lys Ala Pro Asp

1 5

Claims (4)

1.一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，其特征在于，利用生物淘选技术得到目标蛋白的亲和噬菌体，将所述亲和噬菌体与大肠杆菌共培养得到有大量亲和噬菌体分布的大肠杆菌生物被膜，再将含有荧光标记的目标蛋白溶液与所述生物被膜共孵育后，将目标蛋白特异性地固定化并展示到生物被膜的表面。

2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，其特征在于，生物淘选中所用的噬菌体为M13噬菌体。

3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，其特征在于，所述目标蛋白为PSMα3。

4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌-亲和噬菌体共生的生物被膜固定化展示方法，其特征在于，所述亲和噬菌体所包含的插入多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.4任一所示。

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