FI109131B - Menetelmä rekombinoitujen mikro-organismien, joiden pinnalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivisuutta, erottamiseksi - Google Patents
Menetelmä rekombinoitujen mikro-organismien, joiden pinnalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivisuutta, erottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI109131B FI109131B FI942469A FI942469A FI109131B FI 109131 B FI109131 B FI 109131B FI 942469 A FI942469 A FI 942469A FI 942469 A FI942469 A FI 942469A FI 109131 B FI109131 B FI 109131B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- solid support
- molecule
- enzymatic activity
- phages
- microorganisms
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 44
- 229940125808 covalent inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 35
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 10
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-2-iminopentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCC(=N)C(=O)O)SC[C@@H]21 DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 3
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 239000013038 irreversible inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 49
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 45
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 40
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 108090000656 Annexin A6 Proteins 0.000 description 13
- 102100034278 Annexin A6 Human genes 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 9
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 7
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- WBKFWQBXFREOFH-UHFFFAOYSA-N dichloromethane;ethyl acetate Chemical compound ClCCl.CCOC(C)=O WBKFWQBXFREOFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- -1 methoxymethyl ester Chemical class 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012072 active phase Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- VHCSBTPOPKFYIU-UHFFFAOYSA-N 2-chloroethanesulfonyl chloride Chemical compound ClCCS(Cl)(=O)=O VHCSBTPOPKFYIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BWRRWBIBNBVHQF-UHFFFAOYSA-N 4-(3-pyridin-2-yl-1,2,4-oxadiazol-5-yl)butanoic acid Chemical compound O1C(CCCC(=O)O)=NC(C=2N=CC=CC=2)=N1 BWRRWBIBNBVHQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001484259 Lacuna Species 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 150000001414 amino alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N benzyl chloroformate Chemical compound ClC(=O)OCC1=CC=CC=C1 HSDAJNMJOMSNEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- MWFJXRUUPWIALU-UHFFFAOYSA-N ethyl ethenesulfonate Chemical compound CCOS(=O)(=O)C=C MWFJXRUUPWIALU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N glutaric anhydride Chemical compound O=C1CCCC(=O)O1 VANNPISTIUFMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000012073 inactive phase Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- OTCKOJUMXQWKQG-UHFFFAOYSA-L magnesium bromide Chemical compound [Mg+2].[Br-].[Br-] OTCKOJUMXQWKQG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001623 magnesium bromide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- NZVYQOWVZYRUON-UHFFFAOYSA-M sodium 3-amino-1-[(4-nitrophenyl)methoxy]-1-oxopropane-2-sulfonate Chemical compound [N+](=O)([O-])C1=CC=C(COC(=O)C(CN)S(=O)(=O)[O-])C=C1.[Na+] NZVYQOWVZYRUON-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- LWPHUVGDBNUVHA-GXZWQRSESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[[3-[2-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethylamino]-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCNC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LWPHUVGDBNUVHA-GXZWQRSESA-N 0.000 description 1
- KWFXTKHPKNQZRT-UHFFFAOYSA-N 1,1-dichloroethane;ethyl acetate Chemical compound CC(Cl)Cl.CCOC(C)=O KWFXTKHPKNQZRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIAFURWZWWWBQT-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanol Chemical compound NCCOCCO GIAFURWZWWWBQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKTYGPATCNUWKN-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JKTYGPATCNUWKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000237074 Centris Species 0.000 description 1
- XJUZRXYOEPSWMB-UHFFFAOYSA-N Chloromethyl methyl ether Chemical compound COCCl XJUZRXYOEPSWMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001429175 Colitis phage Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100421450 Drosophila melanogaster Shark gene Proteins 0.000 description 1
- 101100338242 Drosophila virilis His1.1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000003436 Schotten-Baumann reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102220472589 Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1_S68A_mutation Human genes 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N sulfuryl dichloride Chemical compound ClS(Cl)(=O)=O YBBRCQOCSYXUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
Description
! 109131
MENETELMÄ REKOMBINOITUJEN MIKRO-ORGANISMIEN, JOIDEN PINNALLA AINAKIN YHDELLÄ MOLEKYYLILLÄ ON ENTSYMAATTISTA AKTIIVISUUTTA, EROTTAMISEKSI
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää rekombinoitujen mikro-organismien, joiden pinnalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivisuutta, valitsemiseksi.
Tämä keksintö koskee myös välineitä tämän menetelmän toteuttamiseksi ja menetelmiä näiden saavuttamiseksi.
Biokemiallisten prosessien parantamisessa sellaisten entsyymien keksiminen, joilla on uusia ominaisuuksia (katalyyttinen aktiivisuus, uusi lisääntynyt stabiliteetti, muuttunut spesifi-teetti, muuttunut pH-profiili ja vastaava) on suuren mielenkiinnon kohteena.
Vaikkakin tiedetään yhä enemmän proteiinien rakenteen vaikutuk-• / sista niiden aktiivisuuteen (Atkins et. ai., Current opinion in structural biology (1991), 1, s. 611-623), on yhä vaikeasti ennustettavissa minkä tyyppinen modifikaatio tarvitaan prote-iinissa, jotta saataisiin sen ominaisuudet muutetuksi haluttuun ;: · suuntaan.
Tämän vuoksi, sovelletaan yleensä strategiaa, jossa käytetään lähtöaineena tunnettua entsyymiä, jonka geeni on mutatoitu.
Tämä mutageneesi suoritetaan satunnaisella tavalla, ja kehite-. tään täten valtava joukko mutanttientsyymejä. Näiden joukosta *;;; toivotaan löytyvän joitakin, joilla on toivotut ominaisuudet '·’ ’ (Cunningham et ai., Protein Engineering (1987), 1, s. 319-325, : : : ja Lehtovaara et ai., Protein Engineering (1988), 2, s. 263- 268).
Onnistumisen mahdollisuuksien lisäämiseksi on välttämätöntä ’· '· testata suuri joukko mutantteja ja on käytettävä sopivaa tekniikkaa valinnan suorittamiseksi mahdollisimman suuren joukon 2 109131 kesken, niiden entsyymien valitsemiseksi, joilla on sopivat ominaisuudet.
Voidaan myös tuottaa proteiineja, joilla on uusia entsymaatti-sia ominaisuuksia käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetek-niikkaa. Tässä tapauksessa, sellaisten vasta-aine-entsyymien (abtsyymit) valitseminen, joilla on sopivat ominaisuudet, vaatii myös tehokasta seulontatekniikkaa.
Menetelmä, jota käytetään yleisesti mutanttientsyymien osoittamiseksi, perustuu kehitetylle entsymaattisen aktiivisuuden herkkyystestille. Seulonta suoritetaan sitten suoraan joukolle mutantteja, jotka on asetettu Petri-maljalle, niiden löytämiseksi, jotka tuottavat haluttua entsyymiä. Tämä menetelmä on kuitenkin hyvin työläs, ja vain rajoitettu joukko klooneja tulee testatuksi (Pollack et ai., J. Am. Chem. Soc., 111, s. 5961-5962 (1989) ja Huse et ai., Science, 246, s. 1275-1281 (1989)) .
Silloin kun haluttu katalyyttinen aktiivisuus on hyödyllinen * , vastaavaa geeniä ilmentävän mikro-organismin eloonjäännille tai I t .
kehittymiselle on saavutettu edullinen vaihtoehto menetelmälle.
t I « Tällöin riittää, että mutanttien kasvattamiseen tarkoitettu • · elatusaine on selektiivinen, niiden kantojen valitsemiseksi, jotka tuottavat haluttua entsyymiä (Hermes et ai., PNAS, USA, :V: 87, s. 696-700 (1990) ja Evnin et ai., PNAS, USA, 87., s. 6659- 6663 (1990)).
Tällä menetelmällä on se haittapuoli, ettei sitä voida soveltaa . kaikille molekyyleille, joilla on entsymaattista aktiivisuutta.
*•11 » * t> ’·’ , On myös tunnettua (Smith, Science (1985), 228, s. 1315-1317, : Parmley ja Smith, Gene (1985), 76, 305-318, de la Cruz et ai., J. Biol. Chem. (1988), 263, s. 4318-4322, Bass et ai., Proteins V (1990), 8, s. 309-314, Cwirla et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.
USA (1990), 87, s. 6378-6382, Devlin et ai., Science (1990), '· ’· 249, 404-406, McCafferty et ai., Nature (1990), 348, s.552-554,
Scott ja Smith, Science (1990), 249, s. 386-390, Clackson et 3 109131 5 [ al., Nature (1991), 352, s. 624-628, Lowman et al., Biochemistry, (1991), 30, s. 10832-10838, J. McCafferty et al., Prot. Engng (1991) 955-961, Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi. 88, s.4363-4366; Barbas et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi. 88, s. 7978-7982; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992), 89, s. 2429-2433), että voidaan liittää tiettyjä vieraita polypeptidejä, erityisesti proteiineja, rihmamaisten faagien ja phagemidien pinnalle.
Kuitenkaan ei ole vielä selvitetty miten suoritetaan sellaisten fagien in vitro valinta, joilla on aktiivisia polypeptidisekvenssejä pinnallaan.
On kuvattu erilaisia affiniteettikromatografisia menetelmiä. Kehitetyistä affiniteettikantajista, useissa käytetään immobi-lisoitua streptavidina tai avidinia, viimeksimainitun ollessa edullisesti monomeerimuododssa (EP-A-0432938). Täten on valittu peptidisekvenssejä kantavat faagit, joilla on affiniteettia streptavidinille, käyttämällä tätä proteiinia sisältävää ... agaroosia (Delvin et al., Science (1990), 249, 404-406).
I I » t * 4 '·!·' Näissä menetelmissä on kuitenkin se haittapuoli, että affi- niteettikromatografiaan perustuvassa faagien erotuksessa, käy-\ tetään hyväksi faagien kykyä muodostaa komplekseja peptidi- reseptorien tai spesifisten vasta-aineiden kanssa, jotka mieli-valtaisesti sitovat aktiivisia tai inaktiivisia molekyylejä.
On myös kehitetty joukko muita merkintämenetelmiä spesifisten mikro-organismien osoittamiseksi. Esimerkiksi, tiettyjä mikro-, organismeja on erotettu käyttämällä näille isäntäsoluille *;;; spesifisiä merkittyjä bakteriofaageja (WO-A-8804326) . Baktee-reita voidaan merkitä käyttämällä transdusoituvia partikkelei-i ta, joilla on tunnettu isäntäspesifisyys ja jotka sisältävät fenotyyppiä muuttavia geenejä (WO-A-9004041).
• »
Spesifisiä mikro-organismeja on myös osoitettu käyttämällä * · ’· hyväksi plasmidin koodittamaa herkkyyttä tietyille myrkyllisil le aineille, yhdessä bioluminisenssimittauksen kanssa.
i 109131 4
Mikään näistä menetelmistä ei kuitenkaan sovellu katalyyttisiä peptidejä kantavien mikro-organismien valitsemiseen.
Lisäksi, kovalenttiset inhibiittorit, joita tietyt entsyymit käyttävät substraatteina, toimivat myös kaikkien entsymaattis-ten reaktioiden inhibiittoreina sitoutumalla kovalenttisesti entsyymin aktiiviseen kohtaan.
Joitakin kovalenttisia inhibiittoreita kutsutaan myös "itsemurha" inhibiittoreiksi (ATOR et ai., The Enzyme, voi. 19, s. 214-282, edit. Sigman Boyer 3rd edition (1990)), koska ne sitoutuvat irreversiibelisti entsyymin aktiiviseen kohtaan käyttäen tämän katalyyttista mekanismia ja täten tekevät entsyymin uudelleenkäytön mahdottomaksi.
Tunnetaan myös menetelmä substraatin immobilisoimiseksi, jossa se sidotaan ensin biotiiniin ja viedään saatu tuote kosketuksiin veteen liukenemattomaan kantajaan sidotun avidinin kanssa (JP-A-3080098). Täten immobilisoitu substraatti mahdollistaa tiettyjen entsyymiaktiivisuuksien helpon määrityksen, mutta ... tätä ei voida käyttää kromatografisena kantajana katalyyttisia '. proteiineja kantavien mikro-organismien valitsemiseksi.
···' Keksinnön tarkoituksena on kehittää menetelmä rekombinoitujen *.*·: mikro-organismien erottamiseksi, joiden pinnalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivisuutta, ja jolla : : : menetelmällä ei ole tekniikan tason menetelmien haittapuolia.
Keksinnön tarkoituksena on erityisesti kehittää menetelmä, jonka avulla voidaan valita ja erottaa rekombinoituja mikro-organismeja, joiden pinnalla on entsymaattista aktiivisuutta omaavia molekyylejä, ja joka valinta tehdään näiden molekyylien . katalyyttisen aktiivisuuden perusteella mieluummin kuin näiden ;.· j komplekseja muodostavan aktiivisuuden perusteella.
V Keksintö kohdistuu menetelmään rekombinoitujen mikro-organismi-en erottamiseksi, joilla on pinnallaan ainakin yksi molekyyli, • jolla on entsymaattista aktiivisuutta, jossa menetelmässä 5 109131 rekombinoidut mikro-organismit, edullisesti virukset kuten rihma -maiset faagit tai λ-faagit tai fagemidit, immobilisoidaan kiin-teälle kantajalle entsymaattisen aktiivisuuden omaavan molekyylin I aktiivisen kohdan kovalenttisen inhibiittorin välityksellä, joka on liitetty kiinteään kantajaan rangan avulla; otetaan talteen rekombinoidut mikro-organismit tai niiden koko genomi tai osia siitä ja eristetään niiden koko genomi tai osia siitä.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
Käsite "rekombinoitu mikro-organismi" on tarkoitettu käsittämään mitä tahansa makromolekylaarista rakennetta, joka tyydyttää englanninkielisen määritelmän "Genetic Display Packagell (GDP), siis mikä tahansa makromolekylaarinen rakenne, joka sisältää geneettistä materiaalia ja joka sisältää tämän geneettisen materiaalin koodit tämän peptidisekvenssin.
Tämä määritelmä käsittää yleensä hiivat, bakteerit, faagit, kuten rihmamaiset faagit tai fagemidit.
Käsite "kiinteä kantaja" tarkoittaa mitä tahansa kiinteää rakennetta, johon voidaan väliaikaisesti immobilisoida mikroorganisme- *:·. ja· » · ·
Ammattimies voi valmistaa tällaisen kiinteän kantajan tekniikan ..,'·' tason tuntemien menetelmien mukaan.
• * · Tämä kantaja voi olla kromatografinen kantaja, paramagneettisia ;;; partikkeleita, polystyreenikantaja tai mikä tahansa muu kantaja, ’’ * johon immobilisoidaan mikro-organismeja sitovia komplekseja muodostavia proteiineja kuten avidiinia tai streptavidiinia tai vas-' ' ta-ainetta.
, Entsymaattista aktiivisuutta omaavat molekyylit valitaan edulli- * * • sesti ryhmästä entsyymit, abtsyymit, katalyyttiset peptidit tai näiden seos.
, . Keksinnön mukaisen menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaan re kombinoidut mikro-organismit merkitään ennen niiden immobilisoin-tia kiinteään kantajaan kovalenttisella inhibiittorilla, 109131 6 i joka on rangan avulla sitoutunut ligandiin, joka voi olla imxnobilisoitu kiinteälle kantajalle.
Keksinnön mukaisen menetelmän toisen edullisen suoritusmuodon mukaan, mikro-organismit tai niiden koko genomi tai osa siitä kerätään talteen mikro-organismin hajottamisella tai sen irroittamisella kiinteästä kantajasta.
Tämä irroittaminen voidaan suorittaa useamman menetelmän mukaan; joko lohkaisemalla ligandi kiinteästä kantajasta eluoi-valla liuoksella, edullisesti happaman pH:n omaavalla liuoksella tai lohkaisemalla ranka, joka liittää kovalenttisen inihi-biittorin kiinteään kantajaan; tai lohkaisemalla kovalenttisen inhibiittorin ja entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin välillä oleva sidos; tai lohkaisemalla entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin ja mikro-organismin välillä oleva peptidisidos.
Entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin peptidisidos lohkaisu suoritetaan edullisesti spesifistä proteaasia käyttä-... mällä, kuten tekijä 10A tai kollagenaasi; voidaan myös käyttää syaanibromidia, joka lohkaisee metioniinia sisältävän pepti-*; disidoksen tai hydroksyyliamiinia, joka lohkaisee peptidisidok-sen, joka sisältää peptidin asparagiini-glysiinin.
Tällainen lohkaisu antaa mahdollisuuden edullisesti lisätä : : ·' keksinnön mukaisen menetelmän selektiivisyyttä.
Menetelmässä käytetty kovalenttinen inhibiittori voi tosi-asiasssa, myös sitoutua mikro-organismiin muissakin kohdissa kuin entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivi-V.i sessa kohdassa.
·.· j Lohkaisemalla spesifinen peptidisidos entsymaattista aktiivi-: : suutta omaavan molekyylin ja mikro-organismin välillä, vain ’·’ mikro-organismit, joiden pinnalla on aktiivinen entsymaattinen molekyyli otetaan talteen eluoinnin yhteydessä.
7 109131 Tätä erotusmenetelmää voidaan lisäksi soveltaa mikro-organismien valintaan ja erottamiseen, joiden pinnalla on, mikro-organismin natiivi- tai rekombinanttiproteiinissa, yksi tai useampi spesifinen peptidi, joka saa aikaan soluperäisen tai ruumiinnesteperäisen immuunireaktion.
On todettu, että tällaisten peptidien pelkällä vasta-aine-anti-geenireaktion tunnistamisella ei voida erottaa niitä peptidejä, jotka helpoiten saavat aikaan solu- tai ruumiinnesteimmuuni-reaktion (Wetzel (1991), Prot. Eng., voi. 4, s. 371-374).
Tästä johtuen, suoritettaessa lohkaisu keksinnön mukaisesti peptidisidoksen kohdalla, joka sijaitsee mainitun peptidin ja mikro-organismin natiivimolekyylin välillä voidaan valita spesifisesti peptidi (peptidit), jotka helpoiten saavat aikaan solu- tai ruumiinnesteimmuunireaktion.
Lisäksi, voidaan ottaa talteen mikro-organismin genoomin kaikki osat tai osia siitä hajottamalla mikro-organismi tai ottamalla talteen sen genomin kaikki osat tai osia siitä. Tämä genomi eristetään tämän jälkeen, monistetaan (esim. PCR:llä, polymera-: se chain reaction) ja kloonataan.
Il* Keksintö koskee myös merkkiainetta, joka koostuu kovalenttises-ta, mielummin irreversiibelistä, entsymaattisen aktiivisuuden omaavan molekyylin aktiivisen kohdan inhibiittorista, joka on sidottu rangan avulla ligandiin, joka voi olla immobilisoitu kiinteälle kantajalle.
Ligandi on edullisesti biotiini tai iminobiotiini.
Ranka sisältää edullisesti lohkaistavan kemiallisen funktionaa-lisen ryhmän, edullisesti disulfidifunktionaalisen ryhmän.
_·. Keksinnön mukaisen merkkiaineen edullisen suoritusmuodon mu-‘Γ. kaan, kovalenttinen inhibiittori on entsymaattisen aktiivisuu-den omaavan molekyylin entsymaattisen reaktion spesifisen ;/·; siirtymisvaiheen analogi.
3 109131
Keksinnön vielä eräs kohde on menetelmä keksinnön mukaisen merkkiaineen valmistamiseksi, jossa entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kovalenttinen inhibiittori sidotaan rangan välityksellä ligandiin, joka voi olla immobilisoitu kiinteään kantajaan.
Keksintö koskee myös kiinteää kantajaa, jossa entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kovalenttinen inhibiittori on liitetty rangan välityksellä kiinteään kantajaan.
Kiinteään kantajaan sidottu kovalenttinen inhibiittori koostuu edullisesti keksinnön mukaisesta merkkiaineesta.
Keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan, ranka on sitoutunut kiinteään kantajaan esterisidoksella tai sisältää vierusasemas-sa diolin.
Keksinnön vielä eräs kohde on menetelmä keksinnön mukaisen kiinteän kantajan valmistamiseksi, jossa entsymaattista aktii-... visuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan inhibiittori sidotaan rangan välityksellä kiinteään kantajaan.
• I »
Kuvien lyhyt kuvaus.
y Kuva 1 kuvaa plasmidin pBR322 β-laktamaasia koodaava geenin :Y: nukleotidisekvenssiä
Kuva 2 esittää kaavamaisesti menetelmän vaiheet, jossa kypsää β-laktamaasia koodaava geeni siirretään faagi fdDOGl:teen.
Kuva 3 kuvaa β-laktamaasia koodaavan geenin komplementaa-;;; risten primeerien nukleotidisekvenssejä.
'·’ Kuvat 4-9 kuvaavat kaavamaisesti menetelmän vaiheet, jossa : : : valmistetaan keksinnön mukaisia merkkiaineita
Kuva 10 kuvaa kaavamaisesti mikro-organismin sitomisen kiinteään kantajaan, käyttämällä keksinnön mukaista ;·*’ merkkiainetta, ja näyttää myös mahdolliset loh- 109131 9 kaisukohdat, jotka mahdollistavat mainitun mikro-organismin talteenoton.
Kuvassa 10 esitetään kaavamaisesti rekombinoitu mikro-organismi 1, jonka pinnalla on entsymaattista aktiivisuutta omaava molekyyli 2, joka on immobilisoitu kiinteälle kantajalle 3, joka sisältää kompleksia muodostavaa proteiinia 4 kuten avidii-nia tai streptavidiinia, merkkiaineen välityksellä, joka koostuu entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin 2 aktiivisen kohdan kovalenttisesta inhibiittorista 5, ja ranka 6 ja ligandi 7, joka voi olla immobilisoitu kompleksia muodostavan proteiinin 4 välityksellä kiinteään kantajaan 3.
Mikro-organismit tai niiden genomin kaikki osat tai osia siitä voidaan ottaa talteen: - lohkaisemalla ligandi 7 kiinteältä kantajalta eluoivalla liuoksella, kuten liuoksella, jonka pH on alueella n. 4 (A); - lohkaisemalla ranka 6 merkkiaineesta (B); - lohkaisemalla inhibiittorin 5 ja entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin 2 välinen sidos (C); ... - lohkaisemalla mikro-organismin 1 ja entsymaattista aktiivi suutta omaavan molekyylin 2 välinen peptidisidos (D); - hajottamalla mikro-organismi 1 ja ottamalla talteen sen ♦ · * ·· genomin kaikki osat tai osia siitä (E).
t
Seuraavissa esimerkeissä menetelmää kuvataan lähemmin viitaten V : oheisiin kuviin.
Esimerkki 1: Aktiivia β-laktamaasia (fd-blal sisältävien faaaien valmistaminen ia erottaminen • ► · » » . Viruksia, joiden pinnalla on entsymaattista aktiivisuutta :,· ! omaavia molekyyleja valmistetaan rihmamaisista faageista.
» I · , ,·. Rihmamaiset faagit kuten M13 tai fd ovat bakteeriviruksia, i’\ jotka vapaassa muodossaan sisältävät 6,4 kb yksijuosteisen * ‘ kierteisen DNA:n, joka on kapseloitunut viiden proteiinin I 109131 ! 10 muodostamaan pitkään sylinterinmuotoiseen proteiinikuoreen (Beck & Zink, Gene (1981), 16, s. 35-58; Grant et ai., J. Biol. Chem. (1981), 256, s. 539-546; Lopez & Webster, Virology (1983), 127, s. 177-193.
Näistä, geeni lll:n (pIII) tuote on monimutkainen proteiini, joka on läsnä 3-5 kopiona, jotka sulkevat yhden virionin päistä, ja joka proteiini koostuu kolmesta osasta: signaali-peptidi, jolla on käyttöä proteiinin siirtymisessä bakteerin periplasmaan, ja joka lohkaistaan erittymisen aikana; globulaa-rinen osa, joka on välttämätön infektoinnin aikaansaamiseksi, ja joka tunnistaa E.coli kohdesolun F-piluksen; viruksen morfo-geneesivaiheen hydrofobinen, transmembraaninen osa, joka myöhemmin varmistaa pillin liittymisen partikkeliin (J. Armstrong et ai., FEBS Letters (1981), 135, s.167-172; C.W. Gray et ai., J. Mol. Biol. (1981) 146. s. 621-627; G. Glasez-Wuttke et ai., BBA (1989) 985, S. 239-247).
Seurauksena töistään koskien proteiinin pIII osuutta ja tehtävää faagi fd:n fysiologiassa, Smith ja Crissman (Virology ,«;· (1984), 132. s. 445) osoittivat, että oli mahdollista, käyttä- • I < mällä rekombinaatio-DNA menetelmiä, siirtää vieras peptidisek- '·; venssi proteiinin pIII sekvenssiin (Science (1985) 228, s.1315- ·;·: 1317) tai signaalipeptidin ja kypsän proteiinin sekvenssin *. väliin (Gene (1988) , 73, s. 305-318) . Tämä insertio ei tee faagia elinkelvottomaksi ja lisätty sekvenssi on helppopääsyi- ' ' nen.
*
Faagi-entsyymi fd-tet-B-laktamaasi (fd-bla) valmistetaan faagi fdDOGl:stä (Clackson et ai., Nature, 352, s. 624-628 (1991), johon mutantti β-laktamaasia koodaava sekvenssi on siirretty.
• I
. Tämä faagi on johdettu faagi fd-tet:stä (Beck et ai., Nukl.
Acids. Res., 5, s. 4495-4503 (1978)), jossa on lisätty polylin-·'itt keri proteiini III:n (pIII) signaalipeptidiä ja kypsää pIII:a , ,·. koodavien sekvenssien välille; tällä tavalla, B-laktamaasi [’, muodostaa pIII:n kanssa fuusioproteiinin. Faagi fd-tet on johdettu faagista fd (Zacher et ai., Gene, 9, s. 127-140 109131 11 (1980)), insertoimalla transposoni Tn 10:n tetrasykliinires-tenssigeeni.
Faagissa fdDOGl on kaksi restriktiokohtaa (Notl ja ApaLl), jotka on muodostettu mutaatioilla proteiini pill:a koodaavien sekvenssien alueella, signaalipeptidin ja globulaarisen osan välillä.
Faagi fdDOGl käsittää myös tetrasykliinigeenin, joka on inser-toitu faagin replikaation aloituskohdan alueelle ja mahdollistaa faagin lisääntymisen plasmidina.
β-Laktamaasia koodaavan nukleotidisekvenssin erottaminen E.coli:n plasmidin pBR322 β-laktamaasigeeni (jonka seksvenssin ovat antaneet Sutcliffe, PNAS USA, 75, s. 3737-3741 (1987) ja
? . . O
esitetty kuvassa 1) eristettiin fagemidista pBluescnpt S/K+^ .
Edellyttäen, että kloonaus fdDOGl:ksi käyttää ApaLl kohtaa ja että β-laktamaasisekvenssi sisältää tällaisen kohdan, viimeksi-,·;· mainittu on ensin poistettava kohtaankohdistetulla mutaatiolla.
* * 4 Tämä mutaatio säilyttää proteiinisekvenssin.
* * t
Phagemidi pBluescript S/K+®(Stratag^ne®yhtiöltä, myy Ozy-*' me®), mutatoidaan Ecksteinin kuvaaman menetelmän mukaan (Nucl.
,,ii' Acids Res., 14, s.9679-9698 (1986) käyttäen Amershamin® markki kinoimaa välinepakkausta.
In vitro mutaation jälkeen käytetään mutatoidun phagemidin pBluescript S/K+^ (pBluescnpt-Μ) kaksoisjuostetta E.coli TG1 ; kannan transformointiin (Gibson, Studies on the Epstein-Barr virus genome, PhD Thesis, Cambridge University England (1984)).
• * * »
Transformoidut solut asetetaan Petri-maljoille LP-Amp elatusai-·’,,, neelle (Sambrook et ai., Molecular Cloning, A laboratory I > manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) Appendice A).
i I < 109131 12
Otetaan talteen pesäkkeitä ja kasvatetaan niitä LB-Amp elatus-aineessa. Lisäämällä elatusaineeseen auttaja faageja R408 tuotetaan pBluescript-M:n yksijuosteista muotoa (Russel et ai./ 45, s. 333-338 (1986)).
i pBluescript-M juoste sekvensoidaan (sekvenssi määritetään) Sangerin menetelmällä (PNAS, 74., s. 5463-5467 (1977)), primerin 5/-TTTAAAAGTGGCCATCATTGGA avulla, joka on kohdistettu kohtaan, joka koodittaa Ser 68:aa, jolloin varmistetaan, että mutaatio on todella siirtynyt valittuihin klooneihin.
β-Laktamaasin kloonaus faaqiin fdDOGl
Geenin se sekvenssi, joka koodaa kypsää β-laktamaasia, inser-toidaan faagiin fdDOGl niiden sekvenssien väliin, jotka koodaa-vat pillin signaalipeptidia ja kypsää pilliä. Kloonauskohtia ApaLl ja Notl käytetään kuvan 2 esittämän kaavion mukaan. Tätä varten, β-laktamaasigeeni otetaan talteen phagemidista pBluescrpit-M lisäämällä sopivat restriktiokohdat PCRillä.
Kuvassa 3 esitetyillä primeereillä on seuraavat ominaisuudet: : : : 5'-primeeri on 30-meeri, ja on kypsän β-laktamaasigeenin (koodaa Pro 2ita) kanssa komplementaarinen 18 emäksen kohdalla • j. alkaen toisesta kodonista. 5'-Jatke (12 emästä) lisää ApaLl : kohdan ja aiheuttaa mutaation, joka johtaa His l:en korvaami- seen Gin Iillä. Tämä mutaatio suoritetaan, jotta faageilla ei olisi β-laktamaasia, jonka pääteaminohappokoostumus on His-Pro-Glin, jolla on affiniteettia avidinille tai streptavidinille (Devlin et ai., Science, 249, s. 404-406 (1990)), jota myöhemmin käytetään näiden erottamiseen.
..11’ 3'-Primeeri on 47-meeri, ja β-laktamaasigeenin kanssa komple-: : : mentaarinen 21 emäksen kohdalla sen päässä. Jatke korvaa stop . V kodonin kodonilla, joka koodaa glysiiniä, ja lisää neljä ko- donia geenien välille, jotka koodaavat β-laktamaasia ja prote-·;·. iini pilliä, ja Notl restriktiokohdan kloonaukselle. Nämä neljä : : : ylimääräistä aminohappoa muodostavat mahdollisen lohkaisukahdan
näiden kahden proteiinin välillä tekijälle Xa. Proteiini pIII
109131 13 aikaansaa faagien infektointikapasiteettia (Goldsmith et al.f Biochemistry, 16, s. 2686-2694 (1977)). Suurikokoisen proteiinin kuten β-laktamaasin läsnäolon vaikuttaessa infektointika-pasiteettiin, inkubointi Xa tekijällä mahdollistaa viimeksi-j mainitun ennalleenpalauttamisen.
f Tämä kohta muodostaa lisäksi ylimääräisen lohkaisukohdan otettaessa talteen mikro-organismia.
Faagin fdDOGl annetaan hajota 18 tunnin ajan käyttämällä ApaLl:tä ja Notl:tä, ja puhdistetaan agaroosigeelillä. Phagemi-din pBluescript-M sekvenssiä lisätään mainituilla primeereillä käyttämällä 34 PCR-sykliä (1 min 95°C:ssa, 1 min 60°C:ssa ja 2,5 min 72°:ssa) Tagpolymerase^:in läsnäollessa (Saiki et ai., Science, 239, s. 487 (1988)). Geelipuhdistuksen jälkeen tuote hajotetaan käyttämällä ApaLlrtä ja Notl:tä 18 tunnin ajan ja puhdistetaan uudelleen; tämän jälkeen sekoitetaan 1,5 μg hajotettua fdDOGl:tä ja 250 ng B-laktamaasigeeniä 60 /il:ssa liuosta, joka sisältää 4 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Gibco-BRL®) ja seosta pidetään yön yli 16°C:ssa. Puhdistettua ligaasiseosta käytetään E.coli TG1 kannan transformointiin.
• « · : Solut asetetaan maljoille LB-tet ja LB-Amp elatusaineelle (Sambrook et ai.), jolloin voidaan huomata, että faagin läsnä-.·. : olo aikaansaa antibioottiresistanssin.
Pesäkkeitä kasvatetaan 2xYT-Tet elatusaineessa tai 2xYT-Amp elatusaineessa faagin fd-bla valmistamiseksi.
Sen sijaan, että faagientsyymejä valmistetaan manipuloimalla proteiinia pIII, on myös mahdollista valmistaa fuusioproteiini ..H' proteiinin pVIII kanssa, joka on pieni 5,2 kd proteiini, joka muodostaa faagin fd sylinterinmuotoisen kuoren ja on yleensä . V läsnä 2700 kopiona (Newman et ai., J. Mol. Biol. (1977), 116, s. 593-606) . Jos DNA-molekyylin kokoa modifioidaan, proteiinin pVIII kopioiden lukumäärää voidaan säätää, jolloin säilytetään : : : mainittu DNA-molekyyli.
109131 14 Tämä muunnos saadaan aikaan phagemidilla, jolloin voidaan säätää fuusioproteiinin kopioiden lukumäärää, Kang et ai., (1991), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, voi. 88, s. 4363-4366.
Aktiivia β-laktamaasia ffd-bla) kantavan faaain karakterisointi Täten rakennettu faagi karakterisoidaan seuraavalla tavalla. Ensin osoitetaan faagilla infektoitujen solujen resistanssi ampisilliinille. Sitten osoitetaan suoraan, että faagi itsessään omaa erästä β-laktaamia, eli nitroferiiniä, hydrolysoivaa aktiivisuutta. Se seikka, että ultrafiltraatilla, joka on suodatettu sellaisen membraanin läpi, joka päästää β-laktamaa-sin läpi, ei ole entsymaattista aktiivisuutta, osoittaa, että entsyymi on sitoutunut faagiin. Lopuksi, faagiproteiineja analysoidaan geelielektroforeesilla ja Western Blotting menetelmällä, ja osoitetaan, että proteiini pIII on läsnä fuusioproteiinin muodossa β-laktamaasin kanssa. Tämä osoittaa sen, että rakenne on oikea, ja että viruksen morfogeneesin aikana ei tapahdu proteolyyttistä lohkaisua, joka johtaisi β-laktamaasin irtoamiseen faagista.
Infektoimalla E.coli TG1 soluja tällä faagilla ja asettamalla ' . maljoihin LB-Amp elatusaineeseen, muodostuu ampisilliinille resistenttejä pesäkkeitä. β-Laktamaasiaktiivisuus osoitetaan ·;’ suoraan Petri-maljoissa nitrosefiinikokeella (Pliickthun et ai., J. Biol. Chem., 262. s.3951-3957 (1987)). Samaten, faagi, joka eristetään elatusaineesta solujen sentrifugoinnin jälkeen, · saostetaan 4%:lla PEGsllä, 0,5 M NaClillä (lopullinen) ja suspendoidaan uudelleen 50 mM tris-puskuriin, 150 mM NaCl:ään pHtssa 7,5 konsentraatioon 1012 transdusoivaa yksikköä (tu) millilitrassa, hydrolysoi nitrosefiiniä.
Faagien kantaman entsyymin spesifinen aktiivisuus on identtinen liuoksessa olevan fl-laktamaasi RTEM kanssa (Boehringer). Aktiivisuuden mittaaminen suoritettiin myös fagien ultrasuoda-tuksen jälkeen Centri/por-membraanilla molekyylikoon rajan V ollessa 100 000, joka päästää kaupallisesti saatavilla olevan β-laktamaasin RTEM läpi. Ultrasuodatteessa todettiin vähemmän 109131 15 kuin 5% β-laktamaasiaktiivisuutta, joka osoittaa, että entsyymi pysyy sitoutuneena faagiin.
Valmistetaan viruksia fd-tet ja fd-bla ja konsentroidaan (1012 tu/ml). Lisätään 20 μΐ kumpaakin liuosta 12,5%sseen SDS-polyak-ryyliamidigeeliin ja analysoidaan (miniprotean® II, Biorad® :lta). Proteiinit siirretään nitroselluloosalle käyttäen Western Blottingsa (minitransblotw,Biorad :lta) ja revealing suoritetaan käyttämällä kaniinin anti-proteiini III vasta-ainetta, jonka jälkeen käytetään vuohen vasta-ainetta HRP:hen (piparjuuriperoksidaasi) liitetyn kaniinin vasta-ainetta vastaan. HRP:n kromoforinen substraatti osoittaa juovia, joilla on näennäinen molekyylipaino 70 kd ja 105 kd fd-tet: lie ja fd-bla:lie vastaavasti. Revealing suoritettiin myös anti-fl-laktamaasi vasta-aineelle; löydettiin juova vain fd-bla: lie siinä kohdassa, jossa fuusioproteiinin oletettiin olevan.
Esimerkki II: Faaaien valmistaminen ia karakterisointi, jotka kantavat inaktiivia β-laktamaasia (fd-bla'^
Keksinnön mukaisen erotusmenetelmän tehokkuuden testaamiseksi, ·, valmistetaan ja karakterisoidaan faageja, jotka kantavat inaktiivia β-laktamaasia (fd-bla').
Phagemidille pBluescript-M suoritetaan mutaatio, jossa kodoni, joka koodaa välttämätöntä seriini 68:aa muuttuu alaniiniksi, * · : jolloin entsyymi inaktivoituu.
Mutanttigeeni otetaan talteen käyttäen samaa menetelmää kuin käytettiin aktiiviselle β-laktamaasille (PCR-monistaminen) restriktiokohtien lisäämisellä (katso kuva 2)): Faagi, joka ’^kantaa inaktiivia β-laktamasia (fd-bla") karakterisoidaan . restriktiofragmenttianalyysillä, Bla-geenin koko sekvenssin ; määrittelyllä, entsymaattisen aktiivisuuden määrittämisellä ja : proteiinianalyysillä.
16 109131 S68A mutaatio suoritetaan samalla menetelmällä, jota käytettiin ApaLl kohdan mutaatiossa. Transformoidut solut siirretään maljoille X-Gal elatusaineelle (Horwitz et ai., J. Med. Chem., T_, s.574 (1964) ilman ampisilliinia. Sinisiä pesäkkeitä kasvatetaan 2xYT elastusaineessa ja yksijuosteinen muoto tuotetaan lisäämällä auttajafaagia R408. Mutantti sekvensoidaan Sangerin menetelmällä käyttämällä primeeriä 5'-TAGTGTATGCGGCGACC, joka on komplementaarinen alueen kanssa, joka koodaa G90-Y95:tä.
Kun geeniä on monistettu käyttämällä PCRiää, kloonattu, ja transformoitu ja asetettu maljoille tet elatusaineelle kuten tehtiin aktiiviselle β-laktamaasille, otetaan talteen pesäkkeitä ja kasvatetaan 2xYT-tet elatusaineessa. Faagin kaksijuostei-nen DNA-juoste erotetaan ja hajotetaan restriktionukleaaseilla BamHl:llä ja EcoRl:llä. Hajotustuotteet erotetaan agaroosilla; transformantit osoittavat 2 fragmenttia 4,7 kbp:ssä ja 5,5 kbp:ssä, kuten voitiin olettaa. Mutatoidun Bla-geenin täydellinen sekvensoiminen suoritettiin käyttämällä primereitä 5'-TAGTGTATGCGGCGACC, 5'-A[lacuna]GCGAGTTAC[lacuna]G, 5'-CCAGC-CAGCCGGAAG ja 5'-TGCTAAACAACTTTC, jotka sijaitsevat vastaavasti alueissa, jotka koodaavat B-laktamaasin G90-Y65, H156-L160, .··.·. L223-W227 ja kypsän proteiinin pIII E5-A9:ää. Täten saadaan • tarkistettua, ettei PCR-monistaminen johda muihin mutaatioihin ” kuin haluttuun aktiivisen kohdan inaktivointiin.
’· ' β-Laktamaasiaktiivisuuden läsnäolo osoitetaan sitten suoritta-maila faagin fd-bla" viljelyn supernatantille yllä kuvattu : nitrosefiinikoe. Kuten voitiin olettaa ei voitu todeta mitään aktiivisuutta.
Lopuksi, suoritetaan faagin kuoriproteiinien tutkimus denatu-,:. roivalla geelielektroforeesilla, Western Blotting ja immunologi· gisella määrityksellä, kuten tehtiin faagi fd-bla;lle. Fuusio-. proteiini ΡΙΙΙ-β-LAKTAMASE voidaan identifioida oikeaksi.
: ·' Esimerkki III; Itsemurhainhibiittorin ia lioandin välillä sijaitsevan pienikokoisella rangalla varustetun aktiivin β-laktamaasimerkkiaineen synteesi 17 109131
Faagit, joiden DNA sisältää aktiivin β-laktamaasigeenin ja jotka kantavat vastaavaa entsyymiä sitoutuneena kuoriprote-iiniin pIII, erotetaan niiden reaktion perusteella keksinnön mukaisen merkkiaineen kanssa. Tämä merkkiaine koostuu bifunk-tionaalisesta molekyylistä, joka sisältää yhdessä päässä β-laktamaasin kovalenttisen inhibiittorin ja toisessa päässä ligandin, tässä tapauksessa biotiinia, joka on helposti immobi-lisoitavissa kiinteälle kantajalle.
Itsemurhainhibiittorimolekyyli koostuu penamsulfonista (katso Fisher et ai., Biochemistry (1981), 20, 2726-2731, Hezes et ai., FEBS Let. (1982), 143, 265-267, Clarke et ai., (1983), 748, 389-397, Dmitrienko et ai., Bioorg. Chem. (1985), 13, 34- 46) siten funktionalisoituna, että sen sitoutuminen rangan kautta ligandiin tai kantajaan on mahdollista.
Voidaan myös edullisesti käyttää iminobiotiiniä, koska sen affiniteettiä streptavidiniä kohtaan voidaan oleellisesti vähentää vähentämällä liuoksen pH:ta. Tämä antaa lisämahdollisuuden faagien erottamiseksi kantajasta immobilisoinnin jälkeen.
Nämä kaksi rakennetta ovat sitoutuneena tarpeeksi pitkän rangan ,·. välityksellä, jotta sallitaan merkkiaineen kantaman ligandin vuorovaikutus immobilisoidun proteiinin kanssa.
• '·' Bifunktionaalisen proteiinin synteesikaavio annetaan kuvissa * t · 4-6. Useimmat tämän synteesin vaiheista on kuvattu kemiallises-· sa kirjallisuudessa tai käsittävät tavanomaisia menetelmiä. Molekyylit karakterisoidaan IR-spektroskopian avulla ja 1H-NMRrllä.
.:. Natrium-p-nitrobentsyylioksikarbonyyli-2-aminoetaanisulfonaat-,··> tia (3) valmistetaan lisäämällä kaksi ekvivalenttia p-nitro-. bentsyyliklooriformiaattia yhteen ekvivalenttiin, 1 N NaOH
» » ! liuotettuun, tauriinia (2) 0°C:ssa, neutralisoimalla väliaine :t>(: jatkuvasti lisäämällä NaOH s ta, Schotten-Baumann olosuhteissa.
, Kun p-nitrobentsyylialkoholi on uutettu etyyliasetaatilla, tuote pakkaskuivataan. Saanto 66%.
* I i 18 109131
Sulfonaatti (2) muunnetaan sulfonyylikloridiksi (4) fosfori-oksikloridilla Fujitan menetelmän mukaan (Synthesis, 423-424 (1982)). Pesemällä saatu öljy kuivalla eetterillä, saadaan tuote valkoisen jauheen muodossa saannolla 97%.
Samaten, 6-aminopenisillaanihappo (5) muunnetaan sen metoksime-tyyliesteriksi (6) Manhas et ai. (Synthesis, 549-552 (1983)) esittämän menetelmän mukaan käyttämällä metoksimetyylikloridia sen jälkeen kun on väliaikaisesti suojattu etyyliasetoasetaa-tilla.
Happokloridi (4) liitetään 6-aminopenisillaanihappoesteriin (5.) dikloorimetaanissa trietyyliamiinin läsnäollessa. Tuote (2)/ joka puhdistetaan piihappopylväässä (eluantti: etyyliase-taatti-dikloorimetaani 80:20), saatiin saannolla 50%.
Tämä tuote hapetetaan sulfoniksi (8.) Johnson et ai. (J. Org. Chem., 28, 1927-28 (1963)) esittämän menetelmän mukaan; saatu tuote pestään eetterillä, jolloin saadaan valkoinen kiinteä aine, joka puhdistetaan piihapolla (eluantti: etyyliasetaatti-dikloorimetaani 50:50). Saanto oli 75%.
* « *
Kun aminofunktionaalisen ryhmän suojaryhmä poistetaan hydraa- « · « maila palladium/hiilellä tavanomaisen menetelmän mukaan, saa- * · · ··* daan tuote (9.), joka liitetään suoraan sulfosukkini-imidyyli-2- '· (biotinamido)-etyyli-1,3-ditiopropionaattiin (10) (PIERCE® :n ...T markkinoima), jolloin saadaan merkitty prekursori (li), joka • , · ·,:: puhdistetaan piihappokromatografiällä (eluantti: etyyliasetaat- ti-dikloorimetaani 50:50). Saanto oli 25%.
Yhdisteen (il) penamrenkaan 3-asemassa olevan karboksyyli-funktionaalisen ryhmän suojaryhmä poistetaan käyttämällä t '!i! magnesiumbromidia dikloorimetaanissa Kim et ai. (Tetrahedron *. . Letters, 32, 3099-3100 (1991) esittämän menetelmän mukaan.
Raakatuote (JL2), joka otetaan talteen liuottimen haihduttamisen "· jälkeen, käytetään suoraan entsyymin inhibointiin ja aktiivia V entsyymiä kantavan faagin merkitsemiseen.
19 109131
Esimerkki IVi Aktiivia β-laktamaasia /fd-blal kantavien faaqien immobilisointi j Kovalenttisen merkkiaineen käyttäminen, joka sitoutuu irrever- siibelisti entsyymin aktiiviseen kohtaan ja tekee mahdottamaksi entsyymin uudelleenkäytön, ei ole epäkohta menetelmässä entsyymin valitsemiseksi. Tosiasiassa tässä menetelmässä on vain kyse aktiivia molekyyliä koodaavan geneettisen sekvenssin valinnasta ja talteensaamisesta.
Ensin määritetään bifunktionaalisen merkkiaineen aktiivia β-laktamaasia kantavien faagien, inhibition optimiolosuhteet. Tämän saavuttamiseksi määritetään faagien β-laktamaasiaktiivi-suuden pieneneminen käyttämällä nitrosefiinitestiä ajan funktiona inhibiittorilisäyksen jälkeen. Sitten faageja inkuboidaan merkkiaineen läsnäollessa.
Sitten reaktiotuotteen annetaan läpäistä pylväs, jossa aga-roosiin on liitetty streptavidiinia. Faagit eluoidaan tämän jälkeen lohkaisemalla merkkiaineen disulfidifunktionaalinen ryhmä. Näitä käytetään E.coli viljelmän uudelleeninfektointiin.
* » * V ’ Tästä viljelmästä voidaan helposti eristää geeni, joka koodaa ; aktiivia β-laktamaasia.
Valmitetaan bakteeriviljelmä, joka on infektoitu fd-bla faagil-la, 2xYT elatusaineeseen, joka sisältää 15 μg/ml tetrasyklii-,·,· niä, ja inkuboidaan sekoituksessa 37°C:ssa 16 tunnin ajan.
Supernatantti otetaan talteen kun viljelmää on sentrifugoitu 10000 rpm:ssä 10 minuutin ajan. Faagit saostetaan lisäämällä 1/5 tilavuus 20%:sta polyetyleeniglykoliliuosta 2,5 M NaCl:ssä. Kun on inkuboitu tunnin ajan 4°C:ssa ja sentrifugoitu, faagit uudelleensuspendoidaan 50 mM asetaattipuskuriin pH:ssa 5,0.
: ,· Faagia (suunnilleen 10n tu/ml) ja 1% BSA:ta sisältävään liuokseen lisätään merkkiaine (12) DMSO-liuoksessa konsentraatiossa ' !*, lmg/25 μΐ, ja lopulliseen konsentraatioon 0,25 mM. Inhibition •M, annetaan jatkua vielä 30 minuutin ajan.
109131 20 Tämän jälkeen pestään suspensio, jossa on 250 μΐ agaroosistrep-tavidina (PIERCE®) 20 ml:11a PBS-puskuria, joka sisältää 1% BSA:ta (Bovine Serum Albumine, Sigma). Pylvääseen lisätään 0,3 ml liuosta, joka sisältää l,25xl09 faagia, pestään 6 ml:11a PBS/1% BSA:ta ja 6 ml:lla PBS:ää. Tämän jälkeen faagit elu-oidaan 1 ml:11a 500 mM ditiotreitoliliuosta PBS-puskurissa. Puskurin vaihdon jälkeen, osa talteenotetuista faageista inku-boidaan 10 ml:n eksponentiaalikasvuvaiheessa olevien E.coli TG1 soluja kanssa 37°C:ssa. Faagien talteenotto osoitetaan asettamalla niiden erilaisia laimennuksia maljoille LB-tet elatusai-neelle ja laskemalla pesäkkeet. Tällä tavoin saatiin talteen l,8xl04 faagia, joka vastaa 14,4 ppm, jotka kantavat aktiivia β-laktamaasia.
Esimerkki V: Inaktiivia B-laktamaasia (fd-bla~1 kantavien faaaien immobilisointi 1,05x10® faagia (fd-bla-) 0,3 ml:ssa asetaattipuskuria pH:ssa 5 lisätään keksinnön mukaiseen merkkiaineeseen (12.) ja reaktio-tuotteen annetaan läpäistä agaroosi-streptavidiini-pylväs ja eluoidaan kuten esimerkissä 4 on esitetty. Tällä tavoin saatiin • i i ·.· · talteen 2,0xl03 inaktiivia B-laktamaasia kantavaa faagia, joka k ?.!t vastaa 1,9 ppm.
% • t « * • t e »
•t\j Kun verrataan tuloksia, jotka saatiin esimerkeissä IV ja V
huomataan, että aktiivinen faagi pidättyy paremmin kuin inak- • t t t ,·,· tiivinen faagi kertoimella 8.
Esimerkki VI: Aktiivien faaaien rikastus seoksesta, joka sisältää aktiiveja (fd-blal ia inaktiiveia (fd-bla~1 faageia: eluointi ditiotreitolilla » > « » • < « * * » · :.· Samantapainen koe suoritetaan seokselle, joka sisältää aktiive-: .* ja faageja ja inaktiiveja faageja, faagien rikastuskertoimen , ·· suoraksi määrittämiseksi.
* * * f · *
Seos, joka sisältää 6,4x10® aktiiveja faageja ja l,4xl010 inak-tiiveja faaageja 0,3 ml:ssa etikkahappopuskuria pH:ssa 5, 109131 1% BSA:n läsnäollessa, lisätään merkkiaineeseen (12), lopulliseen pitoisuuteen 0,25 mM. Ylimääräinen merkkiaine poistetaan ultrasuodatuksella Millipore :n Ultrafree 30,000 yksiköllä. Liuos viedään streptavidiini-agaroosille. Sen jälkeen kun pylväs on pesty 5 ml:11a PBS/1% BSA:ta, faagit eluoidaan 500 mM:lla ditiotreitolia. Osa eluoiduista faageista asetetaan maljoille eri laimennuksilla LB-tet-maljoille; ja pesäkkeet lasketaan. Täten saatiin yhteensä l,3xl06 faagia talteen. Aktiivia B-laktamaasia kantavat faagit määritetään mittaamalla suoraan pesäkkeiden β-laktamaasiaktiivisuus nitrosefiinimalja-testillä kuten yllä on kuvattu. Tämä lukumäärä tarkistettiin myös asettamalla sama määrä eluaattia BL-Amp-maljoille. Eluoi-tujen aktiivien faagien lukumäärä oli Ι,ΙχΙΟ6. Saatu rikastus-kerroin oli täten 5,5.
Esimerkki VII: Aktiiveja ffd-bla) ia inaktiiveja (fd-bla~) faaqeia sisältävän seosken rikastaminen aktiiveilla faaqeilla: eluointi tekijällä Xa
Suoritetaan samantapainen koe seokselle, joka sisältää aktiive-ja ja inaktiiveja faageja rikastuskertoimen suoraksi määrittä-. .·. miseksi; eluointi suoritetaan tällä kertaa tekijällä Xa, joka ' J lohkaisee peptidisidoksen B-laktamaasin ja proteiini III:n *!'. välillä.
Seos, joka sisältää 2,8xl010 aktiiveja faageja ja 2,2xl010 inaktiiveja faageja 1,5 ml:ssa etikkahappopuskuria, 1% BSA:n läsnäollessa lisätään merkkiaineeseen (12) lopulliseen pitoisuuteen 0,75 mM, ja annetaan läpäistä streptavidiini-agaroosi. Kun pylväs on pesty 80 ml:11a PBS:ää, 2 ml:11a 0,1 M TRIS-• |· puskuria, joka sisältää 0,02% NaN3 pH:ssa 7 ja 2 ml: 11a TRIS-puskuria pH:ssa 7, lisätään suspensioon 1 ml liuosta, joka • sisältää 10 Mg tekijää Xa (Boeringher), ja annetaan seistä yön ; yli huoneenlämmössä, kevyesti sekoittaen. Kun on sentrifugoitu, ’...· supernatantti analysoidaan viemällä eri laimennuksina LB-tet-; ·; maljoille; ja pesäkkeet lasketaan. Täten saatiin talteen yh-: teensä 6xl05 faagia. Eluoitujen aktiivien faagien määrä oli 5,7xl05. Täten, saavutettu rikastuskerroin oli 15.
22 1 09 1 31
Esimerkki VIII: Aktiiveja (fd-blal ia inaktiiveia (fd-bla~) faaqeia sisältävän seoksen rikastaminen aktiiveilla faaqeilla: merkkiaineen esi-immobilisointi
Suoritetaan vielä koe seoksella, joka sisältää aktiiveja ja inaktiiveja faageja, mutta suorittamalla merkkiaineen esi-immobilisointi streptavidiini-agaroosipylväälle.
250 μΐ Streptavidiini-agaroosisuspensiota inkuboidaan tunnin ajan etikkahappopuskurissa pH:ssa 5 1% BSA:n läsnäollessa; kun on pesty 2,5 ml:11a etikkahappopuskuria, joka ei sisältänyt BSA:ta, lisätään 2 μΐ merkkiaineen (12) 50 mM-liuosta DMSOsssa. Kun on kulunut 1 minuutti ja 5 pesukerran ja sentri-fugoinnin jälkeen, käyttäen joka kerralla 1 ml etikkahappoa, lisätään suspensioon 0,8 ml faageja etikkahappopuskurissa, jossa on 1% BSAsta, joka sisältää 9,6xl010 aktiiveja faageja ja 5xl010 inaktiiveja faageja, ja sekoitetaan varovaisesti yön yli 4°C:ssa. Kun on pesty 20 ml:lla PBS/1% BSA ja 50 ml:lla liuosta, joka sisältää 0,1% Tween 20 PBS:ssä, faagit eluoidaan tekijä Xatlla ja lasketaan kuten esimerkissä VI. Täten saatiin talteen l,15xl05 aktiiveja faageja ja l,85xl05 inaktiiveja faageja. Täten, saavutettu rikastuskerroin oli 3,2.
Esimerkki IX: Aktiiveja faaqeia ffd-bla) ia inaktiiveia faaqeia (fd-bla~1 sisältävän seoksen rikastaminen aktiiveilla faaqeil-: la: eluointi aswli-entswmisidoksen hvdrolwsilla
Tehdään samantapainen koe kuin esimerkissä VIII seokselle, joka sisältää aktiiveja ja inaktiiveja faageja, sen selvittämiseksi voidaanko ottaa faageja talteen lohkaisemalla β-laktamaasin ja itsemurhainhibiittorin välinen sidos, nimittäin asyylientsyymin ·;;; esterisidos. Tämä lohkaisu suoritetaan hydrolyysillä.
• Seos, joka sisältää 2,8xl010 aktiiveja faageja ja l,05xl010 . ··. inaktiiveja faageja, viedään pylvääseen, jonne merkkiaine on immobilisoitu. Kun on perusteellisesti pesty kuten esimerkissä VIII, suspension annetaan seistä yön yli huoneenlämmössä ja sentrifugoinnissa saatu supernatantti analysoidaan. Täten 23 1 09 1 31 saatiin talteen l#4xl05 aktiiveja faageja ja 2,5xl05 inaktiive-ja faageja. Täten, saatu rikastuskerroin oli 2,1.
Mainituissa esimerkeissä immobilisoitujen faagien osuus on pieni koska immobilisoidun ligandin ja inhibiittorin välinen ranka on varsin pieni. Jotta vältettäisiin tämä haittapuoli, valmistetaan toinen merkkiaine, jolla oli isompi ranka.
Esimerkki X: Aktiivisen β-laktamaasin merkkaineen synteesi, jolla merkkiaineella on suurikokoinen ranka itsemurhainhibiit-torin ia ligandin välillä
Valmistetaan karbobentsyylioksi-2-(2-aminoetoksi)etanolia (15) (kuva 7) lisäämällä 1 ekvivalentti bentsyyliklooriformaattia (131 2-(2-aminoetoksi)etanoliin (14) bikarbonaatilla kyllästetyssä vedessä. Tuote uutetaan orgaaniseen faasiin ja puhdistetaan piihappopylväässä (eluantti: etyyliasetaatti-dikloori-metaani 50:50). Saanto oli 58%.
Etyylivinyylisulfonaattia (17) valmistetaan 2-kloorietaanisul-... fonyylikloridista (16.) Whitmore:n ja Landau:n esittämän mene-• . telmän mukaan (J. Am. Chem. Soc., £8, s. 1797-1798 (1946)).
Yhdiste pudistetaan horisontaalitislauksella 88°C:ssa paineessa 0,6 mm elohopeaa, jolloin saadaan väritön öljy (saanto 45%). Yksi ekvivalentti suojatusta aminoalkoholista (15) lisätään yhdisteeseen (17) kuivassa asetonitriilissä, johon lisätään hienosti jauhettua kaliumbikarbonaattia. Kun on kuumennettu 3 päivän ajan 80°C:ssa, ja suodatettu ja liuotin haihdutettu, tuote (.18) puhdistetaan piihappopylväässä (eluantti: etyy-liasetaatti-dikloorimetaani 50:50). Saanto oli 60%. Sul-fonifunktionaalisesta ryhmästä poistetaan suojaryhmä Tipson et ;;; ai. esittämän menetelmän mukaan (J. Org. Chem., 12, 133-137 (1947)), jolloin saadaan 24 tunnin reaktion jälkeen, kun on : pesty heksaanilla yhdiste (lj)) valkoisen jauheen muodossa (saanto 86%). Tämä tuote muunnetaan happokloridiksi (20)
Fuijtan menetelmän mukaan (Synthesis, 423-424 (1982)).
24 109131
Happokloridi (20) (kuva 7) yhdistetään suoraan 6-aminopenisil-laanihapon esteriin (6) dikloorimetaanissa trietyyliamiinin läsnäollessa tunnin ajan. Saatu tuote (21.) puhdistetaan piihap-popylväässä (eluantti: etyyliasetaatti-diklooriinetaani 50:50), ja saatiin saannoksi 34%. Tuote hapetetaan sulfoniksi (22) Johnson et ai. (J. Org. Chem. 28, 1927-28 (1963)), esittämän menetelmän mukaan, ja saatu tuote pestään eetterillä, jolloin saadaan valkoinen kiinteä aine, joka puhdistetaan piihappopyl-väässä (eluantti: etyyliasetaatti-dikloorimetaani 50:50).
Saanto oli 72%.
Tuote (23) (kuva 8) saadaan poistamalla amiinifunktionaalisen ryhmän suojaryhmä hydraamalla palladium/hiilellä etanolissa tavanomaisen menetelmän mukaan, joka tuote yhdistetään suoraan sulfosukkini-imidyyli-2-(biotinamido)etyyli-1,3-ditiopropionaa-tin (.10) kanssa (markkinoi PIERCE®), jolloin saadaan merkki-aineprekursori (24), joka puhdistetaan kromatografisesti piihappopylväässä (eluantti: etyyliasetaatti-dikloorimetaani 50:50). Saanto oli 13%.
Yhdisteen (24.) penamrenkaan 3-asemassa oleva karboksyylifunk-. tionaalisen ryhmän suojaryhmä poistetaan magnesiumbromidin avulla dikloorimetaanissa Kim et ai. (Tetrahedron Letters, 32, ·’"· 3099-3100 (1991)) esittämän menetelmän mukaan.
’;·; Esimerkki XI: Aktiiveja faageja (fd-blal ja inaktiiveja faageja *‘ (fd-bla~1 sisältävän seoksen rikastaminen aktiiveilla faageil-la: merkintä inhibiittorilla (24), eluointi tekijällä Xa
Suoritetaan rikastuskoe merkitsemällä inhibiittorilla (24.) *;· aktiivien ja inaktiivien faagien seos, sen määrittämiseksi mikä vaikutus biotiiniligandia itsemurhainhibiittoriin sitovan ran-, gan koolla on.
*··[ Seosta, joka sisältää l,2xl010 aktiiveja faageja ja 3,3xl010 : inaktiiveja faageja 1,5 ml:ssa etikkahappopuskuria, jossa oli : 1% BSA:ta, lisätään merkkiaineeseen lopulliseen pitoisuuteen 0,75 mM, ja annetaan läpäistä streptavidiiniagaroosipylväs. Kun „ 109131 pylväs on pesty suoritetaan eluointi kuten esimerkissä VII ja analysoidaan, jolloin määritetään 6,8xl06 aktiiveja faageja ja 1,9xl05 inaktiiveja faageja. Saavutettu rikastuskerroin oli 98.
Esimerkki XII: Toisen aktiivisen B-laktamaasimerkkiaineen synteesi, jolla on suurikokoinen ranka itsemurhainhibiittorin ia liaandin välillä.
Yleisen menetelmän kehittämiseksi ligandin ja inhibiittoripään välillä sijaitsevan isokokoisen rangan omaavan merkkiaineen syntetisoimiseksi, valmistetaan prekursori, joka kantaa aktivoitua esterifunktionaalista ryhmää ja joka voi täten liittyä lukuisiin inhibiittoreihin ja sisältää itse isokokoisen rangan. Tämä liitetään β-laktamaasin itsemurhainhibiittoriin.
Valmistetaan N-hydroksisukkini-imidin ja biotiini-N-e-aminoka-pronihapon aktivoitu esteri (2j5) (Wilchek ja Bayer, Methods Enz. (1990), 184, 123-160). Tämä yhdiste liuotetaan DMFrään ja tämä seos lisätään liuokseen, jossa oli 3 ekvivalenttia kysta-miinia (27.) DMF:ssä (kuva 9) .
. .·. Raakatuote, joka on eristetty saostamalla eetterillä (10 kertaa ’j. liuoksen tilavuus) , puhdistetaan Sepharoosi S (Pharmacia ) pylväässä, joka on tasapainoitettu 1 itiumkloridillä, käyttäen ' , eluanttina 25% etanolia. Additiotuote (28) eluoidaan 50 mM ··· LiCL:llä. Liuos pakkaskuivataan. Saanto oli 79%.
Kolme ekvivalenttia asetonitriiliin liuotettua glutaarihappoan-hydridiä (29.) , lisätään vähitellen puhdistettuun tuotteeseen (joka sisältää LiCl:ää), joka on liuotettu 10% etanolia sisäl-·*· tävään puskuroituun vesipitoiseen väliaineeseen (KHC03-K2C03, .‘I· 50/50, 10 mM pHrssa 9,6) pitoisuuteen 0,01 M. Saatu happo f30) * , ·/ saostetaan tekemällä liuos happamaksi 1 N suolahapolla pH · 2reen. Tuote suodatetaan ja kuivataan. Saanto oli 43%.
: Saatu happo (30) muutetaan aktivoiduksi esteriksi standardi- . . : olosuhteissa liittämällä se N-hydroksisukkini-imidiin (31) käyttämällä disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) DMFrssä. Kun on 26 109131 kulunut 72 tuntia, reaktioväliaine saostetaan kuivalla eetterillä. Sakka kuivataan desikkattorissa (saanto: 87%), tätä tuotetta (32) käytetään sellaisenaan kytkentäreaktioon suojaamattoman 6-aminopenisillaanihapon esterin (6.) kanssa kuivassa etanolissa.
Esimerkki XIII: Aktiiveja faaqeia (fd-bla) ia inaktiiveia faaaeia (fd-bla~1 sisältävän seoksen rikastaminen aktiiveilla faaqeilla: immobilisointi paramaqneettisille partikkeleille
Suoritetaan samantapainen koe kuin koe VI, sillä erolla, että streptavidiini on liittynyt paramagneettisiin partikkeleihin. Pesut suoritetaan uudelleensuspendoimalla puhtaaseen puskuriin. Immobilisoitujen faagien eluointi suoritetaan 50 mM ditiotrei-tolilla. Rikastuskerroin määritetään kuten esimerkissä VI.
Esimerkki XIV: Aktiiveja faaaeia (fd-bla^ ia inaktiiveia faaqeia (fd-bla") sisältävän seoksen rikastaminen aktiiveilla faaqeilla: immobilisointi "huuhtomalla" polvstvreeniputkeen ... Suoritetaan samantapainen koe kuin koe VII, sillä erolla, että ‘ . streptavidiini immobilisoidaan "huuhtomalla" polystyreeniputken pinnalle, ELISA-testeihin tavallisesti käytetyllä tekniikalla. Pesut suoritetaan uudelleensuspendoimalla puhtaaseen puskuriin. Immobilisoitujen faagien eluointi suoritetaan tekijällä Xa. Rikastuskerroin määritetään kuten esimerkissä VII.
Ottaen huomioon, että esimerkeissä XIII ja XIV pesut voidaan suorittaa nopeammin kuin esimerkeissä, joissa käytettiin kromatografisia menetelmiä, joissa esimerkeissä XIII ja XIV . faagit tarttuvat huonommin kuin geeliin, nämä rikastusmenetel-mien variantit ovat sopivampia korkeiden rikastuskertoimien toteamiseen.
:*“· Esimerkki XIII: Abtsvvmeiä kantavien faagien erottaminen • i · 27 109131 Tässä tapauksessa kovalenttinen inhibiittori käsittää itsemur-hainhibiittorin, joka on luonteenomainen abtsyymin tai spesifisen siirtymisvaiheen analogin katalysoimalle reaktiolle.
Näiden faagien toteaminen ja erottaminen suoritetaan sitten samalla tavalla kuin faageille, joilla on pinnallaan aktiiveja entsyymejä.
Claims (25)
1. Menetelmä rekombinoitujen mikro-organismien, joiden pin- ! nalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivi suutta, valitsemiseksi, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikro-organismit immobilisoidaan kiinteälle kantajallle entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kova-lenttisen inhibiittorin avulla, joka on liitetty kiinteään kantajaan rangan avulla, joka ranka sisältää lohkaistavan kemiallisen funktionaalisen ryhmän ja että rekombinoidut mikro-organismit tai niiden koko genomi tai osa siitä otetaan talteen ja että niiden koko genomi tai osa siitä eristetään.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikro-organismit merkitään entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kova-lenttisella inhibiittorilla ennen niiden immobilisointia kiinteälle kantajalle, joka inhibiittori on sidottu mainitun rangan s kautta ligandiin, joka voidaan immobilisoida kiinteälle kanta jalle.
3. Minkä tahansa patenttivaatimuksen l tai 2 mukainen erotus-'j\ menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismit ovat viruksia, . .·. edullisesti faageja kuten rihmamaiset faagit.
4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen erotus- • · ·.'·: menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismit ovat fagemide- ja.
5. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja koostuu kro- > » · t · matografisesta pylväästä, jolle on immobilisoitu avidiinia, * I ···' streptavidiinia ja/tai vasta-ainetta.
6. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen ero- , ’ tusmenetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattista aktiivisuutta omaavat molekyylit on valittu ryhmästä johon kuuluu entsyymit, ; : abtsyymit, katalyyttiset peptidit tai näiden seos. 29 1 09 1 31
7. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismit otetaan talteen lohkaisemalla ne kiinteältä kantajalta.
8. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikro-organismit otetaan talteen lohkaisemalla mainittu ranka, joka yhdistää kovalenttisen inhibiittorin kiinteään kantajaan.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikroorganismit otetaan talteen lohkaisemalla ligandi kiinteältä kantajalta eluoi-valla liuoksena, edullisesti liuoksena, jolla on hapan pH.
10. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikro-organismit otetaan talteen lohkaisemalla sidos, joka sijaitsee kovalenttisen inhibiittorin ja entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin välillä.
11. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikro-organismit ote- ... taan talteen lohkaisemalla peptidisidos, joka sijaitsee entsy- ’·* maat t is ta aktiivisuutta omaavan molekyylin ja mikro-organismin välillä.
• · · · : 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että lohkaiseminen suoritetaan proteaasin avulla. v
; 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että lohkaiseminen suoritetaan käyttämällä syaanibromi-dia.
14. Patenttivaatimuksen 11 mukainen erotusmenetelmä, tunnettu siitä, että lohkaiseminen suoritetaan käyttämällä hydroksyyli-amiinia.
15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen erotusmene- ! telmä, tunnettu siitä, että rekombinoidut mikro-organismit ha- 109131 j I jotetaan ja että otetaan talteen, eristetään ja kloonataan nii- j den koko genomi tai osa siitä. |
16. Merkkiaine, jota voidaan käyttää minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukaisessa menetelmässä, tunnettu siitä, että se koostuu entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kovalenttisesta inhibiittorista, joka on rangan, joka sisältää lohkaistavan kemiallisen funktionaalisen ryhmän, kautta sidottu ligandiin, joka voidaan immobilisoida kiinteälle kantajalle.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen merkkiaine, tunnettu siitä, että kovalenttinen inhibiittori on irreversiibeli inhibiittori .
18. Patenttivaatimusten 16 tai 17 mukainen merkkiaine, tunnet-tu siitä, että ligandi on biotiini tai iminobiotiini.
19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16-18 mukainen merkkiaine, tunnettu siitä, että mainittu ranka käsittää disulfidifunk-tionaalisen ryhmän.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16-19 mukainen merkkiai-·.·'·' ne, tunnettu siitä, että kovalenttinen inhibiittori on entsy- .* maattista aktiivisuutta omaavan molekyylin entsymaattisen reak- ··· tion spesifisen siirtymisvaiheen analogi.
* · · · • · • · · ’· / 21. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen 16-20 mukaisen « · · ···· merkkiaineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että entsymaat- v : tista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kova lenttinen inhibiittori liitetään mainitun rangan välityksellä ’:··: ligandiin, joka voidaan immobilisoida kiinteään kantajaan. » · · * ·
22. Kiinteä kantaja, jota voidaan käyttää minkä tahansa pa- * · ’.’i tenttivaatimuksen 1-15 mukaisessa menetelmässä, tunnettu siitä, "·"· että se käsittää entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyy- Iin aktiivisen kohdan kovalenttisen inhibiittorin, joka on si- • · . dottu kiinteään kantajaan rangan välityksellä, joka ranka si sältää lohkaistavan kemiallisen funktionaalisen ryhmän. 3i 109131
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen kiinteä kantaja, tunnettu siitä, että kiinteään kantajaan sidottu kovalenttinen inhibiit- i tori koostuu patenttivaatimusten 17-20 mukaisesta merkkiainees- i ta.
24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen kiinteä kantaja, tunnettu siitä, että ranka on sidottu kiinteään kantajaan esterisidok-sella tai sisältää vierusasemassa diolin.
25. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimusten 22-24 mukaisen kiinteän kantajan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että entsymaattista aktiivisuutta omaavan molekyylin aktiivisen kohdan kovalenttinen inhibiittori sidotaan mainitun rangan välityksellä kiinteään kantajaan.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE9101106 | 1991-11-29 | ||
| BE9101106A BE1006312A3 (fr) | 1991-11-29 | 1991-11-29 | Procede de selection de microorganismes recombinants comportant a leur surface au moins une molecule a activite enzymatique. |
| PCT/BE1992/000052 WO1993011242A1 (fr) | 1991-11-29 | 1992-11-30 | Procede de selection de microorganismes recombinants comportant a leur surface au moins une molecule a activite enzymatique |
| BE9200052 | 1992-11-30 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI942469A0 FI942469A0 (fi) | 1994-05-26 |
| FI942469A FI942469A (fi) | 1994-05-26 |
| FI109131B true FI109131B (fi) | 2002-05-31 |
Family
ID=3885823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI942469A FI109131B (fi) | 1991-11-29 | 1994-05-26 | Menetelmä rekombinoitujen mikro-organismien, joiden pinnalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivisuutta, erottamiseksi |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0617737B1 (fi) |
| JP (1) | JP4125364B2 (fi) |
| KR (1) | KR100243997B1 (fi) |
| AT (1) | ATE147783T1 (fi) |
| AU (1) | AU671089B2 (fi) |
| BE (1) | BE1006312A3 (fi) |
| BR (1) | BR9206970A (fi) |
| CA (1) | CA2124580C (fi) |
| DE (1) | DE69216853T2 (fi) |
| DK (1) | DK0617737T3 (fi) |
| ES (1) | ES2098555T3 (fi) |
| FI (1) | FI109131B (fi) |
| HU (1) | HU220876B1 (fi) |
| NO (1) | NO313593B1 (fi) |
| SG (1) | SG48094A1 (fi) |
| WO (1) | WO1993011242A1 (fi) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA931263B (en) * | 1992-02-24 | 1993-11-02 | Igen Inc | Reaction-based selection for expression of and concentration of catalytic moieties |
| CA2368875A1 (en) | 1999-04-14 | 2000-10-19 | The Government Of The United States Of America | High sensitivity phage display biomolecule detection |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5325030B2 (fi) * | 1972-12-19 | 1978-07-24 | ||
| US4165258A (en) * | 1975-10-08 | 1979-08-21 | University Of Pennsylvania | Plasminogen activating enzyme-specific competitive inhibitor |
| CA1313111C (en) * | 1986-12-01 | 1993-01-26 | William J. Hubbard | Method of identifying unknown organisms |
| DE3833628A1 (de) * | 1988-10-03 | 1990-04-12 | Genlux Forschungsgesellschaft | Verfahren zum nachweis und zur identifikation toxischer substanzen mit hilfe klonierter mikroorganismen |
| EP0437537B1 (en) * | 1988-10-04 | 1997-02-26 | DNA Plant Technology Corporation | Bacterial detection by phage transduction of detectable phenotype |
| JP2810138B2 (ja) * | 1989-08-23 | 1998-10-15 | 昭和電工株式会社 | 酵素活性測定用充填剤、その使用方法および装置 |
| ES2062394T3 (es) * | 1989-09-29 | 1994-12-16 | Rohm & Haas | Medio que contiene un ligando para la separacion cromatografica, procedimiento para la preparacion del medio y uso del medio para aislar moleculas naturales o sinteticas de una mezcla liquida. |
-
1991
- 1991-11-29 BE BE9101106A patent/BE1006312A3/fr not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-11-30 WO PCT/BE1992/000052 patent/WO1993011242A1/fr active IP Right Grant
- 1992-11-30 DK DK92923617.2T patent/DK0617737T3/da active
- 1992-11-30 KR KR1019940701814A patent/KR100243997B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-11-30 SG SG1996007002A patent/SG48094A1/en unknown
- 1992-11-30 HU HU9401593A patent/HU220876B1/hu unknown
- 1992-11-30 ES ES92923617T patent/ES2098555T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-30 CA CA002124580A patent/CA2124580C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-30 JP JP50965793A patent/JP4125364B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-30 EP EP92923617A patent/EP0617737B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-30 AT AT92923617T patent/ATE147783T1/de active
- 1992-11-30 BR BR9206970A patent/BR9206970A/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-11-30 AU AU29373/92A patent/AU671089B2/en not_active Expired
- 1992-11-30 DE DE69216853T patent/DE69216853T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-10 NO NO19941731A patent/NO313593B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-05-26 FI FI942469A patent/FI109131B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9401593D0 (en) | 1994-08-29 |
| SG48094A1 (en) | 1998-04-17 |
| WO1993011242A1 (fr) | 1993-06-10 |
| JP4125364B2 (ja) | 2008-07-30 |
| HU220876B1 (en) | 2002-06-29 |
| JPH07505999A (ja) | 1995-07-06 |
| EP0617737A1 (fr) | 1994-10-05 |
| BR9206970A (pt) | 1995-12-19 |
| HUT70310A (en) | 1995-09-28 |
| BE1006312A3 (fr) | 1994-07-19 |
| ATE147783T1 (de) | 1997-02-15 |
| AU671089B2 (en) | 1996-08-15 |
| DK0617737T3 (da) | 1997-07-07 |
| AU2937392A (en) | 1993-06-28 |
| NO941731L (no) | 1994-06-21 |
| KR100243997B1 (ko) | 2000-02-01 |
| NO941731D0 (no) | 1994-05-10 |
| DE69216853D1 (de) | 1997-02-27 |
| DE69216853T2 (de) | 1997-06-26 |
| FI942469A0 (fi) | 1994-05-26 |
| EP0617737B1 (fr) | 1997-01-15 |
| NO313593B1 (no) | 2002-10-28 |
| FI942469A (fi) | 1994-05-26 |
| ES2098555T3 (es) | 1997-05-01 |
| CA2124580C (en) | 2002-07-16 |
| CA2124580A1 (en) | 1993-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Smith et al. | [15] Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage | |
| US5338665A (en) | Peptide library and screening method | |
| JP6075658B2 (ja) | 方法及び組成物 | |
| US6194183B1 (en) | Phage display for detergent enzyme activity | |
| Soumillion et al. | Phage display of enzymes and in vitro selection for catalytic activity | |
| ES2491166T3 (es) | Miméticos de lazo de horquilla beta fijados a patrón y su utilización en exposición en fagos | |
| FI109131B (fi) | Menetelmä rekombinoitujen mikro-organismien, joiden pinnalla ainakin yhdellä molekyylillä on entsymaattista aktiivisuutta, erottamiseksi | |
| Geiger et al. | Convenient site-selective protein coupling from bacterial raw lysates to coenzyme A-modified tobacco mosaic virus (TMV) by Bacillus subtilis Sfp phosphopantetheinyl transferase | |
| US6642014B1 (en) | Enzyme activity screen with direct substrate replacement | |
| CN114213532B (zh) | 高亲和力的抗鸡传染性法氏囊病毒的scFv抗体的制备及其应用 | |
| WO1995020601A1 (en) | Reagents binding vinculin, dynein, and glutathione s-transferase from peptide libraries | |
| Bonnycastle et al. | Assaying phage-borne peptides by phage capture on fibrinogen or streptavidin | |
| ES2310969B1 (es) | Biotina-soporte poroso, metodos de obtencion y usos. | |
| Ku | A combinatorial approach towards molecular recognition | |
| Huang | A combinatorial approach towards DNA recognition | |
| Zhang | Protein engineering and gene profiling by phage display and yeast surface display | |
| Shroyer | Bacterial detection using phage display for the differentiation of pre-and post-infection bacteriophages: A model M13 system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |