ES2310969B1 - Biotina-soporte poroso, metodos de obtencion y usos. - Google Patents
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Abstract
Biotina-soporte poroso, métodos
de obtención y usos.
Compuesto que comprende biotina unida a un
soporte poroso mediante un "linker" (grupo de unión o
enlazante) que contiene el grupo 1,2,3-triazol. La
invención también se refiere al método de obtención del compuesto y
a sus usos para la purificación de avidina y proteínas
biotiniladas, así como para el marcaje fluorescente de avidina.
Description
Biotina-soporte poroso, métodos
de obtención y usos.
La presente invención se refiere a un compuesto
que comprende biotina unida a un soporte poroso inorgánico mediante
un "linker" (grupo de unión) que contiene el grupo
1,2,3-triazol. Más particularmente, el soporte
poroso inorgánico es sílice. Además, se refiere a su método de
obtención y sus usos para la purificación de avidina y proteínas
biotiniladas, así como para el marcaje fluorescente de avidina.
La biotina es una vitamina esencial en el
metabolismo que constituye el grupo prostético de un conjunto de
enzimas denominado carboxilasas que participan en reacciones clave
del metabolismo intermediario. El déficit de biotina, o defectos
genéticos que impiden su unión covalente a las carboxilasas,
conduce a graves enfermedades metabólicas, que normalmente producen
situaciones de acidosis y coma.
Una posible situación de deficiencia de biotina
se produce por una ingesta excesiva de huevos crudos. En la clara
de huevo existe una proteína denominada avidina (Cf. DeLange, R.J.,
1969, J. Biol. Chem., vol. 245, pp.
907-916), que presenta la capacidad de unir
fuertemente biotina y secuestrarla. De hecho, la constante de unión
entre la biotina y la avidina es de aproximadamente 10^{-15} M,
lo que constituye probablemente la mayor afinidad por un ligando
descrita para cualquier sistema biológico.
Esta alta afinidad, así como la relativa
facilidad de obtener avidina, ha determinado que exista un alto
interés en el estudio y desarrollo de sistemas de afinidad que se
basen en la fuerte interacción entre estas dos moléculas. Así se
han desarrollado sistemas de marcaje de proteínas, ácidos
nucleicos, diversos constituyentes celulares e incluso células
completas, para posteriormente ser reconocidos por moléculas de
avidina, bien inmovilizada (creando sistemas de cromatografía de
afinidad) o bien marcada por la unión a fluoróforos o enzimas
(creando sistemas de detección, usualmente en fase sólida).
Las técnicas descritas en el párrafo anterior
han sido utilizadas clásicamente en inmunología para la detección
de antígenos o anticuerpos previamente biotinilados. Actualmente,
esta tecnología está en un proceso de expansión, extendiéndose su
uso a la proteómica y genómica, en el marcaje, separación y/o
inmovilización de proteínas o ácidos nucleicos.
La interacción de la avidina con la biotina
ocurre en condiciones fisiológicas de pH y fuerza iónica. Existen
numerosos reactivos para la biotinilización de proteínas y existe
comercialmente avidina (o una proteína análoga suya de origen
bacteriano, la estreptavidina) ya sea sola, marcada con diferentes
fluoróforos o inmovilizada sobre agarosa.
Un problema importante, y sólo parcialmente
resuelto, de esta tecnología es, paradójicamente, la elevada
afinidad de la avidina por la biotina. Esta elevada afinidad hace
que sea necesario utilizar condiciones extremas para romper la
interacción de ambas moléculas. Estas condiciones extremas implican
usualmente el empleo de agentes desnaturalizantes como SDS o
clorhidrato de guanidinio junto con pHs inferiores a 2.
En técnicas cromatográficas basadas en la
interacción de la avidina con la biotina, ya sea para la
purificación de la propia avidina o para la cromatografía de
afinidad de moléculas marcadas con biotina, el uso de estas
condiciones extremas de elución y la consiguiente desnaturalización
de las proteínas dificulta las aplicaciones posteriores de las
mismas.
Para soslayar este problema, se ha propuesto el
uso de iminobiotina, con una menor afinidad por la avidina, como
ligando. No obstante, el uso de iminobiotina es mucho más caro que
el de biotina en el marcaje de ligandos y además no puede ser
aplicado a las proteínas biotiniladas de manera natural. Otra
alternativa ha sido el uso de columnas de afinidad que emplean
avidina monomérica.
La purificación inicial de avidina por
cromatografía de afinidad se realizó en 1968 (Cf. Cuatrecasas, P.
et al., 1968, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
vol. 33, pp. 235-239) utilizando una columna de
biocitina-sefarosa. La elusión de la avidina de
esta columna implicaba el uso de cloruro de guanidinio 6 M a pH
1.5. Posteriormente, en 1980 (Cf. Hofmann et al.,
1980, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 77, pp.
4666-4668), fue descrito el uso de columna de
iminobiotina para la purificación de estreptavidina utilizando
condiciones de elución más suaves. La unión de avidina o
estreptavidina a este tipo de columnas implica el uso de un elevado
pH (en torno a 11) ya que a este pH se produce la unión efectiva de
la iminobiotina a la avidina puesto que la base libre de la
iminobiotina es la que es reconocida por la avidina (Cf. Green, N.
M., 1966, Biochem. J., vol 101, pp.
774-780). La elución en este tipo de columnas se
produce a pH 4.
Otras estrategias propuestas han sido el uso de
otros derivados de biotina como la destiobiotina, cuya menor
afinidad por la unión a avidina permite su desplazamiento por
biotina sin modificar (Cf. Hirsch, J. D. et al., 2002,
Anal. Biochem., vol 308, pp. 343-357). De
cualquier manera, clásicamente en la purificación de avidina siguen
empleándose columnas de iminobiotina y el rendimiento típico de las
mismas es de aproximadamente un 90% con una capacidad de unión de
aproximadamente 0.75 mg de avidina por mL de resina empleada (Cf.
Heney, G. et al., 1981, Anal. Biochem., vol.
114, pp. 92-96). En muchas ocasiones, aunque la
purificación se basa fundamentalmente en una etapa de afinidad se
incorporan etapas adicionales como una precipitación previa con
sulfato amónico o un intercambio iónico posterior a la
cromatografía de afinidad.
Actualmente existen en el mercado diferentes
soportes biotinilados siendo los más extendidos los basados en
agarosa y sefarosa. De forma análoga, la biotina y compuestos
relacionados han sido unidos covalentemente a una variedad de
superficies, fundamentalmente de vidrio, oxido de silicio,
polímeros y oro. La unión covalente de biotina a estos sólidos o
superficies es llevada a cabo usando derivados activos de la
biotina y soportes o superficies funcionalizadas
complementariamente tanto a través de métodos químicos como
fotoquímicos. La mayoría de los derivados activados de biotina usan
la cadena lateral del ácido valérico para incorporar distintos
grupos que no interfieren en la unión con la avidina y sus
homólogos. Entre los más usados se encuentran esteres activados
derivados de N-hidroxisuccinimida, maleimida
derivado, el iodoacetil derivado, el piridil disulfuro derivado, el
hidrazido derivado y otros derivados conteniendo grupos
fotoactivables que son anclados a los soportes o superficies a
través de uniones de tipo amida, tioeter, disulfuro o hidrazona
fundamentalmente (cf. Smith, C. L., et al., 2006,
Top. Curr. Chem. Vol 261, pp. 63-90).
La cicloadición de alquinos y azidas (Reacción
de Huisgen) (Cf. R. Huisgen, In 1,3-Dipolar
Cycloaddition Chemistry (Ed.: A. Padwa), Willey, New York,
1984, pp. 1-176) se ha establecido
recientemente como una importante herramienta sintética dentro del
concepto de "click-chemistry" (cf. Kolb H. C.
et al. 2001, Angew Chem Int Ed, vol. 40, pp.
2005) especialmente desde el descubrimiento de su catálisis
regioselectiva y a temperatura ambiente mediante Cu(I) (cf.
Rostovtsev, V. V. et al. 2002, Angew. Chem. Int.
Ed., vol. 41, pp. 2596; Tornøe, C. W. et al. 2002,
J. Org. Chem., vol. 67, pp. 3057-3064;
WO03101972 A1). Las principales ventajas de esta reacción son la
fácil introducción de grupos azido y alquino en los sustratos y la
estabilidad de ambas funciones que toleran agua y oxigeno, y que
permiten el ensamblaje modular de diferentes moléculas. La formación
de los triazoles resultante de la fusión de ambas funciones es
irreversible y normalmente transcurre con muy altos rendimientos.
Debido a estas notables características, se han desarrollado una
gran cantidad de aplicaciones en ciencia biomédica, síntesis
orgánica y ciencia de los materiales mediante el uso de la
"click-chemistry" (cf. Wang, Q. et al.
2005, Lett. Org. Chem., vol. 2, pp.
293-301; Kolb, H. C. et al. 2003,
Drug Discov. Today, vol. 8, pp. 1128-1137;
Bock, V. D., et al. 2005, Eur. J. Org. Chem.,
pp. 51-68; Lutz, J.F. 2007, Angew. Chem.
Int. Ed. vol. 46, pp.1018-1023). En particular,
la funcionalización de soportes basados en gel de sílice (cf.
Lummerstorfer, T. et al. 2004, J. Phys. Chem.
B, vol. 108, pp. 3963-3966) y agarosa (cf.
Punna, S. et al., 2005, Bioconjugate Chem.,
vol. 16, pp. 1536-1541) se ha realizado usando
esta
metodología.
metodología.
En la presente invención se proporciona un
compuesto nuevo que comprende biotina unida a un soporte poroso
mediante un grupo enlazante (o "linker"). Además de
proporcionar su método de obtención y sus usos.
Mediante el uso del compuesto de la invención se
proporciona un sistema apropiado para:
- \circ
- La purificación de avidina. Este sistema es más económico que usando iminobiotina; con facilidad de elución de la avidina unida; y con posibilidad de escalarlo en sistemas de microfiltros y centrifugación.
- \circ
- El marcaje fluorescente en columna de avidina con las siguientes ventajas: facilidad operatoria del marcaje; y posibilidad de realizar el marcaje sin afectar a uno de los sitios de unión de la avidina a la biotina que permanece protegido por la unión al soporte poroso a través de la biotina.
- \circ
- La purificación de proteínas biotiniladas in vitro y en general ligandos biotinilados. En función del pH de elución empleado es posible seleccionar específicamente la unión biotina-avidina a liberar: la unión con la biotina soportada o la unión con la biotina del ligando. Además, los ligandos purificados pueden ser fácilmente caracterizados por espectrometría MALDI-TOF.
\vskip1.000000\baselineskip
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere al compuesto, en adelante compuesto de la invención, que
comprende:
- a.
- biotina o cualquiera de sus derivados de fórmula general (I);
- b.
- un "linker" o enlazante que comprende un grupo triazol, más concretamente un grupo 1,2,3-triazol; y
- c.
- un soporte poroso.
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
X es S ó SO_{2}, preferiblemente X es S;
Y es O ó NH, preferiblemente Y es O;
Z es CH_{2} ó CH_{3} cuando X no existe;
preferiblemente Z es CH_{2}.
R^{1} es O ó NH, preferiblemente R^{1} es
NH; y
R^{2} es un grupo seleccionado de entre un
alquilo (C_{1}-C_{10});
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}, donde n tiene un valor de
0 a 10; ó un
(CH_{2})_{4}CH(NH_{2})COOCH_{2}.
Preferiblemente R^{2} es un metileno.
El símbolo 100 indica el punto de
unión de la biotina o cualquiera de sus derivados con el
"linker".
Entendemos por "derivados de biotina" a los
compuestos que tienen una estructura análoga a la biotina y cuya
función biológica es similar, como por ejemplo biocitina,
iminobitina, destiobitina, etc..
En una realización preferida del compuesto de la
presente invención, el "linker" tiene la estructura que se
representa por las fórmulas generales (II) ó (III):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
R^{3} es un grupo seleccionado de entre un
alquilo (C_{1}-C_{10}); ó
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}, donde n tiene un valor de
0 a 10. Preferiblemente R^{3} es un metileno.
R^{4} se selecciona del grupo que comprende O,
C(O)R^{1}, R^{1}C(O)R^{1} ó
R^{1}C(S)R^{1} (donde R^{1} es O ó NH); y
m tiene el valor de 1 a 11. Preferiblemente m es
1, 2 ó 3.
El símbolo 100 indica, en estas
estructuras, el punto de unión del "linker" con la biotina o
cualquiera de sus derivados.
Por "alquilo" se refiere en la presente
invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen
de 1 a 10 átomos de carbonos, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo,
n-butilo, t-butilo,
n-pentilo, etc.
Dependiendo de la estructura del "linker",
los compuestos de la invención estarán representados por las
siguientes fórmulas generales (IV) ó (V):
\vskip1.000000\baselineskip
Como "soporte sólido poroso" entendemos
aquí un soporte poroso inorgánico, como por ejemplo pero sin
limitarse a sílice, alúmina, tierra silícea, zeolita, o un soporte
poroso orgánico seleccionado del grupo que comprende celulosas ó
resinas, como por ejemplo pero sin limitarse a poliamina ó resina
de Merrifield. Preferiblemente el soporte es un material
inorgánico, y más preferiblemente el soporte es sílice.
Una realización preferida de la invención
comprende un compuesto de fórmula (VI), denominado también en esta
descripción, "biotina-silica":
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento de obtención de los compuestos de la invención,
que comprende los siguientes pasos:
- a)
- funcionalización del soporte poroso usando un compuesto que comprende un grupo terminal azido (N_{3}) ó alquino (C\equivCH).
- b)
- funcionalización de biotina o cualquiera de sus derivados con un grupo terminal alquino (C\equivCH) ó azido (N_{3});
- c)
- reacción del soporte funcionalizado del paso (a) con la biotina o cualquiera de sus derivados funcionalizados complementariamente del paso (b) por reacción de cicloadición 1,3-dipolar ("click-chemistry").
Este procedimiento se puede describir mediante
los siguientes esquema de reacción, donde el compuesto (VII) y
(VIII) serían los compuesto derivados de biotina obtenido en el
paso (b) y el compuesto (IX) y (X) sería el soporte poroso
funcionalizado con un grupo azido o alquino obtenido en el paso (a)
dando lugar al compuesto de fórmula general (IV) o (V), obtenido en
el paso (c), que comprende biotina, o cualquiera de sus derivados,
unida a un soporte poroso mediante un "linker" (grupo
de unión) que comprende el grupo 1,2,3-triazol:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde X, Y, Z, R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y m están descritos
anteriormente.
\newpage
La reacción que se produce entre los grupos
alquino y azido para dar anillos de 1,2,3- triazoles es una
cicloadición 1,3-dipolar que, para el caso
particular de estos grupos funcionales, es conocida en el estado de
la técnica como reacción de
"click-chemistry".
La reacción de la presente invención se puede
llevar a cabo mediante las mismas condiciones que otras reacciones
de "click-chemistry" descritas en el estado de
la técnica, temperatura, tiempo de reacción, etc. incluyendo el uso
de catalizadores ya descritos. En una realización preferida de la
presente invención, el catalizador utilizado en el procedimiento de
obtención del compuesto (I) o (II) es el complejo
(EtO)_{3}P.Cu(I) (Et=etilo).
En una realización preferida de la invención, la
reacción de cicloadición se produce entre un grupo azido del
soporte poroso funcionalizado y un grupo alquino de la biotina
funcionalizada.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de los compuestos de la invención para la purificación de
avidina.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de los compuestos descritos en la presente invención para la
inmovilización de avidina.
Al inmovilizarse la avidina en el compuesto de
la invención se forma un complejo que posteriormente se puede
utilizar para la purificación de ligandos biotinados o para el
marcaje de avidina.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención se refiere a este complejo
avidina-compuesto de la invención.
La purificación de ligandos biotinilados es una
de las principales aplicaciones que se persigue con el uso de esta
tecnología basada en la interacción de la avidina con la biotina,
que es la identificación y aislamiento de proteínas biotiniladas
in vitro. Con el actual desarrollo de la proteómica, la
capacidad de identificación y purificación de las proteínas así
modificadas, utilizando unas condiciones suaves que permitan su
posterior análisis mediante electroforesis bidimensional y
espectrometría de masas, es una necesidad acuciante.
La purificación de avidina y/o de los ligandos
biotinilados usando el complejo avidina-compuesto
de la invención se puede llevar a cabo mediante la adecuada
selección del pH. Así por ejemplo, el complejo
avidina-ligando biotinilado puede eluir a pH <
2.5, mientras que a pH 4 eluye sólo el ligando biotinilado.
Otro aspecto más de la presente invención se
refiere al uso del compuesto de la invención para el marcaje
fluorescente de avidina una vez que esta ha sido previamente
inmovilizada al mencionado compuesto de la invención. Esta
operatoria permite la salvaguarda en el marcaje del centro activo
de la avidina a través del cual la avidina se ha unido al compuesto
de la invención manteniéndose de esta forma su funcionalidad una
vez que sea eluido del soporte.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente
invención.
Fig. 1.- Muestra la cromatografía de afinidad de
la avidina utilizando el compuesto de fórmula (VI) (también llamado
biotina-silica). A.- Cromatograma de la purificación
de avidina a partir de un extracto crudo de huevo B.-
Electroforesis en SDS-PAGE de las fracciones
cargadas y eluidas en la columna.
Fig. 2.- Muestra un gel de
SDS-PAGE de las fracciones eluidas para el
compuesto biotina-silica.
Fig. 3.- Muestra el marcaje de avidina con el
compuesto
7(2-hidroxietoxi)-4-nitro-2,1,3-benzooxadiazol
(NBD-OCH_{2}CH_{2}OH). A.- Cromatograma de la
elución del compuesto biotina-silica. B.-
Electroforesis en SDS-PAGE de las fracciones
eluidas. Donde "L" corresponde al lavado de la columna previa
a la elución. C.- Espectro de emisión de fracciones correspondientes
al lavado y los dos picos eluidos. La excitación se ha realizado a
460 nm.
Fig. 4.- Muestra la purificación de peroxidasa
de rábano picante biotinilada in vitro A.- Cromatograma de
la elución en la resina. La absorbancia a 440 nm es un índice de la
actividad enzimático de la POD eluida. B.- Electroforesis en
SDS-PAGE de las fracciones eluidas. Se ha incluido
POD y avidina como estándares de la electroforesis.
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la
invención.
La síntesis de biotina-silica se
llevó a cabo en varios pasos:
A una solución de
3-cloropropil-trietoxisilano (2.31
g, 9.6 mmol) y yoduro de tetrabutilamonio (0.02 g, 0.05 mmol) en
butanona (25 mL) se le añadió azida sódica (3.120 g, 48 mmol) y se
calentó la mezcla de reacción a reflujo durante 50 horas. Pasado
este tiempo, se filtró sobre celita y se evaporó el disolvente a
vacío. El crudo de reacción se disolvió en diclorometano (150 mL) y
se lavó con agua (2 x 20 mL). La capa orgánica se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se evaporó para dar el compuesto de fórmula
(XI) (1.9 g) como una sustancia siruposa que fue directamente usada
sin otro proceso de purificación.
Se suspendió gel de sílice (4 g) en tolueno (20
mL) y se añadió
3-azidopropil-trietoxisilano (XI) (1
g). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 h; se
evaporó aproximadamente la mitad del volumen para eliminar el
etanol formado, se añadió el volumen eliminado de tolueno y se
calentó a reflujo durante 1 h. Se filtró la mezcla de reacción, se
lavó con diclorometano (4 x 50 mL) y se secó a vacío (1 mm Hg) a
50ºC durante 16 h.
Se disolvió biotina (370 mg) en cloruro de
tionilo destilado (5 mL) y se agitó durante 30 min. Se evaporó a
vacío el cloruro de tionilo y se coevaporó con tolueno anhidro. El
cloruro de ácido de biotina se disolvió en Cl_{2}CH_{2} anhidro
(5 mL) y se adicionó un exceso de propargil amina (207 \muL, 3
equiv.). La mezcla de reacción se agitó en atmósfera de argón
durante 30 min. y pasado este tiempo se evaporó el disolvente y se
purificó por cromatografía en columna (Cl_{2}CH_{2}:MeOH, 9:1)
obteniéndose un sólido blanco que corresponde a (XIII) (359 mg,
84%).
"a" representa: i) Cl_{2}SO
(5mL), t. amb., 30 min ii) NH_{2}CH_{2}C\equivCH,
CH_{2}Cl_{2}.
En una solución del alquino derivado de biotina
(XIII) (300 mg, 1.06 mmol) en DMF seca (10 mL) se suspendió la
azido-silica (XII) (3 g) y se añadió el catalizador
(EtO)_{3}P\cdotCul (10% en mmol, 37 mg). La reacción se
irradió a 800W y 80ºC durante 1 h en un Milestone Star Microwave
Labstation hasta que el espectro de IR o la cromatografía en placa
fina mostraron la total desaparición de la biotina. Se filtró la
biotina-silica (VI) resultante y se lavó con MeOH
(2 x 30 mL), EDTA sal disódica (50 mM, 2 x 30 mL), agua (2 x 30
mL), acetona (2 x 30 mL) y CH_{2}Cl_{2} (2 x 30 mL). La
biotina-silica (VI) se secó después a vacío (1 mm
Hg) a 50ºC durante 16 h obteniéndose 3.240 g.
Se ensayó la capacidad de unión de avidina a
biotina-silica (VI) a partir de muestras de clara
de huevo. Para ello, se emplearon sistemas de cromatografía en
columna así como sistemas de centrifugación rápida en microfiltros.
Este último sistema permitió el manejo sencillo de numerosas
muestras de pequeño volumen en un tiempo reducido ya que requiere
pequeños tiempos de centrifugación de aproximadamente 30 segundos.
En ambos casos, la avidina fue purificada a partir de clara de
huevo previamente sonicada utilizando métodos ampliamente descrito
previamente (Cf. Hofmann et al., 1980, Proc. Natl.
Acad. Sci., vol. 77, pp. 4666-4668; Airenne
et al., 1997, Protein expresión and purification, vol.
9, pp. 100-108; Hytönen et al, 2003,
Biochem. J., vol 372, pp. 219-225).
En la Fig. 1 se muestran los resultados de una
cromatografía de afinidad sobre una columna de
biotina-silica (VI). En dicha columna se cargó una
muestra diluida 1:1 de clara de huevo previamente sonicada a pH 11.
Se realizó un lavado con un tampón a pH 11 y posteriormente dos
eluciones secuenciales con un tampón carbonato a pH 4 y glicocola
0.1 M (pH = 2.5). Se monitorizó el pH así como la absorbancia a 280
nm y se realizó una electroforesis en SDS-PAGE al
15% de las fracciones eluidas. Durante todo el proceso la
temperatura se mantuvo a 4ºC. Pudo observarse que la columna
retiene de forma eficiente un elevado porcentaje del contenido de
avidina del extracto crudo, que posteriormente fue eluido de una
forma casi cuantitativa a pH 2.5. Por el contrario, la elución a pH
4 no fue capaz de romper la unión de la avidina a la matriz. El
rendimiento aproximado del proceso es de 0.1 mg de avidina por
gramo de resina.
En otros experimentos se utilizaron 200 mg de
silica funcionalizada que fueron incubados a 4ºC durante una hora
con un mL de extracto crudo de huevo a pH 11. Posteriormente la
suspensión de resina y extracto crudo se dispuso en un microfiltro
y se centrifugó durante 30 segundos. La resina se lavó con tampón a
pH 11 y posteriormente se eluyó con tampones conteniendo biotina
(10 mM) de pH 4 y de pH 2.5. Una electroforesis en
SDS-PAGE de las fracciones eluidas se muestra en la
Fig. 2. Pudo observarse como utilizando esta técnica es posible unir
avidina a la columna que es eluida específicamente a pH 2.5.
Los datos obtenidos indican que con la
biotina-silica (VI) se obtiene un resultado
inesperado y con una alta aplicabilidad: la elución de la avidina
unida a la columna en condiciones relativamente suaves, evitando el
uso de agentes caotrópicos o detergentes,. Esto permite el
desarrollo de columnas de biotina basadas en esta matriz en lugar
de las clásicas columnas de iminobiotina lo que se traduce en una
considerable reducción del coste de esta tecnología.
Adicionalmente, cabe señalarse que de los resultados de la
electroforesis de las fracciones purificadas se obtuvo un elevado
grado de pureza (>96% medido mediante electroforesis de
proteínas), lo que permite realizar la purificación en un único
paso.
Además, de forma alternativa la avidina puede
ser cargada a pH 7.5 e igualmente la avidina puede ser eluida en
una solución 0.2 N de HCl que posteriormente puede ser neutralizada
utilizando tampones volátiles (por ejemplo tampón
carbonato/bicarbonato) lo que permite obtener la proteína en
condiciones de fuerza iónica muy baja.
Puesto que la resina
biotina-silica permitió la purificación de avidina
en condiciones relativamente suaves, se procedió a ensayar el
marcaje en columna de la avidina unida a la resina con un
fluoróforo. Para ello se utilizó el compuesto
7(2-hidroxietoxi)-4-nitro-2,1,3-benzooxadiazol
(NBD-OCH_{2}CH_{2}OH.
Para el marcaje de la avidina se utilizó la
resina biotina-silica (2 g) que se incubaron con 15
mL de un extracto crudo de huevo sonicado y diluido 1:1. El pH se
fijó a 11 y tras una hora de incubación, la suspensión de la resina
se compactó en una columna. Tras lavarla se adicionaron 2 mL de una
solución 2 mM de NBD-OCH_{2}CH_{2}OH a pH 11 (en
todos los casos esta solución de lavado a pH 11 está formada por 50
mM Na_{2}CO_{3}, 1 M NaCl pH 11) y la solución se recirculó
durante 16 h a través de la resina a temperatura ambiente.
Seguidamente se lavó la columna con tampón a pH 11 y la avidina
unida se eluyó con una solución 0.2 N de HCl. Los resultados
obtenidos se muestran en la Fig. 3 y demuestran que es posible
realizar el marcaje de la avidina unida a la
biotina-silica con el mencionado reactivo
NBD-OCH_{2}CH_{2}OH. El marcaje de la avidina
con este reactivo hizo que la elución de la columna a pH 1 fuera
más rápida originando dos picos. Un primer pico de elución con una
mayor relación fluorescencia proteína y un segundo pico con una
relación de marcaje inferior y mayor retención en la columna. Esta
relación de marcaje fue confirmada mediante
MALDI-TOF. Una prueba adicional de marcaje se
obtuvo observando el espectro de fluorescencia de la avidina marcada
y comparándolo al del compuesto libre. Como se esperaba se produjo
un ligero desplazamiento del máximo de emisión que fue debido a la
unión a la proteína.
\newpage
Para valorar la capacidad de la resina
biotina-silica para la purificación y
caracterización de proteínas biotiniladas in vitro se
realizaron dos experimentos.
1º Se marcó con biotina una proteína
fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP) utilizando el
succinil éster del ácido 6-biotinil hexanóico.
Posteriormente, se purificó mediante su unión a avidina que había
sido previamente inmovilizada sobre la
biotina-silica utilizando para ello el sistema de
microfiltro con sólo 100 mg de resina
silica-biotina. La elución se realizó con HCl 0.2 N
y el eluato, tras ser liofilizado se analizó mediante
MALDI-TOF. Se observaron pesos moleculares
correspondientes con el monómero de avidina, así como con el de una
molécula de GFP modificada con 4 biotinas. Se demostró, así, que
esta técnica es idónea para la purificación y caracterización de
proteínas biotiniladas.
2º Se procedió a marcar peroxidasa de rábano
picante con el succinil éster del ácido 6-biotinil
hexanoico. La peroxidasa marcada fue separada del agente
biotinilante mediante cromatografía sobre sephadex
G-50 y se empleó posteriormente para comprobar la
capacidad de inmovilización sobre la resina
biotina-silica. Esta resina, previamente cargada con
avidina, fue eluida después de la unión de la
biotina-peroxidasa a pH 4 y pH 2. La elución de la
peroxidasa unida a la columna se monitorizó enzimáticamente usando
el reactivo de Trinder. Los resultados obtenidos se muestran en la
Fig. 4. Pudo observarse que la peroxidasa biotinilada fue reconocida
por la avidina unida a la columna y puede ser eluida de una manera
selectiva a pH 4 (la elución de la peroxidasa precede una fracción
al cambio del pH en la cromatografía). Esta elución se produjo sin
liberar la avidina unida a la columna (véase la electroforesis en
SDS-PAGE fracción 5) que sólo se eluye a pH 2
(Fracción 11 en la electrofóresis en SDS-PAGE).
Por tanto, este sistema tiene la ventaja de
permitir la elución del complejo avidina-ligando
biotinilado si se escoge como sistema de elución un tampón HCl a pH
1-2.5 o bien la elución específica del ligando
biotinilado si se escoge como sistema de elución un tampón a pH
4.
Claims (17)
1. Compuesto que comprende:
- a.
- biotina o cualquiera de sus derivados de fórmula general (I);
- b.
- un "linker" o enlazante que comprende el grupo 1,2,3-triazol; y
- c.
- un soporte poroso.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
X es S, el grupo SO_{2} ó no existe;
Y es O ó NH;
Z es CH_{2} ó CH_{3} cuando X no existe.
R^{1} es O ó NH; y
R^{2} es un grupo seleccionado de entre un
alquilo C_{1}-C_{10},
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}, donde n tiene un valor de
0 a 10, ó
(CH_{2})_{4}CH(NH_{2})COOCH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1, donde X
es S.
3. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde Y es O.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde R^{1} es NH.
5. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde R^{2} es CH_{2}.
6. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el enlazante tiene la fórmula general
(II) ó (III):
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
R^{3} es un alquilo
C_{1}-C_{10} ó un grupo seleccionado de entre
(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}, donde n tiene un valor de
0 a 10, o
(CH_{2})_{4}CH(NH_{2})COOCH_{2};
R^{4} se selecciona del grupo que comprende O,
C(O)R^{1}, R^{1}C(O)R^{1} o
R^{1}C(S)R^{1} (donde R^{1} es O ó NH); y
m tiene el valor de 1 a 11.
7. Compuesto según la reivindicación 6, donde m
tiene el valor de 1 a 3.
8. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7, donde R^{3} es CH_{2}.
9. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, donde el soporte poroso es sílice.
10. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, de fórmula (VI):
11. Procedimiento de obtención de un compuesto
descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que
comprende los siguientes pasos:
- a)
- funcionalización del soporte poroso usando un compuesto que comprende un grupo terminal azido (N_{3}) ó alquino (C\equivCH).
- b)
- funcionalización de biotina o cualquiera de sus derivados con un grupo terminal alquino (C\equivCH) ó azido (N_{3});
- c)
- reacción del soporte funcionalizado del paso (a) con la biotina funcionalizada o cualquiera de sus derivados funcionalizados del paso (b) por reacción de cicloadición 1,3-dipolar ("click-chemistry").
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
donde la reacción de cicloadicción se produce entre un grupo azido
del soporte poroso funcionalizado y un grupo alquino de la biotina
funcionalizada.
13. Uso de un compuesto descrito en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10, para la purificación de
avidina.
14. Uso de un compuesto descrito en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 10, para la inmovilización de
avidina.
15. Complejo que comprende un compuesto descrito
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y avidina.
16. Uso del complejo descrito en la
reivindicación 15, para la purificación de ligandos
biotinilados.
17. Uso del complejo descrito en la
reivindicación 15, para el marcaje fluorescente de avidina.
Priority Applications (2)
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2008
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ORTEGA-MUÑOZ, M. y col. Synthesis of glyco-silicas by Cu(I)- catalyzed "{}click-chemistry"{} and their applications in affinity chromatography. Advanced Synthesis & Catalysis. 2006, Vol. 348 (16+17), páginas 2410-2420. Todo el documento. * |
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