JP2810138B2 - 酵素活性測定用充填剤、その使用方法および装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素活性測定用充填剤、それを充填した酵
素活性測定用カラム、酵素活性測定装置およびそれを用
いる酵素活性の測定方法に関する。

［従来の技術］ 酵素は、生細胞により合成されるタンパク質であり、
その生体反応に対する触媒作用が生命の維持に重要な役
割を持つことが知られている。自然界には、動、植物ま
たは微生物起源の数百万種にのぼる酵素が存在している
が、その中で単離された約2,000種のうちのあるもの
は、工業用酵素として食品や洗剤関係にまた医療用酵素
として酵素製剤や分析、臨床検査用に、さらに近年は遺
伝子工学用にと幅広く利用されている。酵素の活性を測
定することは、即ち酵素の触媒能を測ることであり、酵
素の機能を示す基本的な指標を得ることに他ならない。
従来より酵素活性の測定は、基質の減少量または生成物
の増加量を分析することで行われてきたが、その方法と
しては例えば酵素の種類により反応後の基質の減少量を
吸光光度計を用いて測定する方法、基質または生成物を
化学試薬で発色させて測定する方法、生成物をさらに着
色性の物質に転換して測定する方法等がしばしば用いら
れている。その他基質を放射性の元素で標識して検出す
る方法等いろいろあるが、総じて言えることは測定する
酵素の量が多く試薬が高価となること、使用する試薬の
種類が多いこと、測定に長時間を要すること、測定技術
に熟練を要すること、不純物の影響を受け易く正確な値
が得にくいこと、等々の欠点を有することであつた。こ
れらの欠点に対応した工夫の一つとして、液体クロマト
グラフィーと組み合わせることにより酵素のカラムによ
る分離精製を行い、カラム溶出後、基質溶液と接触させ
て基質の減少量を測定することがなされた［エッチ、エ
ー、チェイス：ジャーナル・オブ・ケミカルテクノロジ
ー・アンド・バイオテクノロジー、36巻、351頁、1986
年、（H.A.Chase:J.Chem.Tech.Biotechnol.,36,351（19
86））および伊藤尚史ら：ジャーナル・オブ・クロマト
グラフィー、400巻、163頁、1987年、（N.Ito et al:J.
Chromatogr.,400,163（1987））］。しかし、この方法
も高価な試薬を連続して流し続ける必要があることおよ
びそのためにポンプなど新たな装置が必要となる等の点
で必ずしも満足すべきものではない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、前記従来の酵素活性測定方法の欠点
を克服して、簡便、迅速でしかも精度の高い酵素活性の
測定が可能な、酵素活性測定用充填剤、それを充填した
カラム、酵素活性測定装置およびそれを用いる酵素活性
の測定方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によつて上記目的を達成し得る酵素活性測定用
充填剤、それを充填したカラム、酵素活性測定装置およ
びそれを用いる酵素活性の測定方法が提供される。

すなわち、本発明の第１の発明は、酵素によつて認識
される基質にビオチンが結合されており、水に不溶性の
支持体にアビジンが結合されており、かつ前記基質が前
記支持体にその基質に結合されているビオチンとその支
持体に結合されているアビジンとを介して固定化されて
いることを特徴とする酵素活性測定用充填剤に関する。

また、第２の発明は、第１の発明の酵素活性測定用充
填剤を中空管に充填せしめてなることを特徴とする酵素
活性測定用カラムに関する。

さらに第３の発明は、送液ポンプ、サンプリングバル
ブ、第２の発明の酵素活性測定用カラムおよび分解した
基質を検知する検出器より本質的になる酵素活性測定装
置に関する。

第４の発明は、第２の発明の酵素活性測定用カラム
に、活性測定対象酵素を導入し、得られる基質分解物を
定量することを特徴とする酵素活性測定方法に関する。

第５の発明は、第２の発明の酵素活性測定用カラム
に、阻害剤が共存する活性測定対象酵素を導入し、得ら
れる基質分解物を定量することにより、活性測定対象酵
素の残存活性または阻害剤を定量することを特徴とする
阻害剤の共存下における酵素活性測定方法に関する。

最後に第６の発明は、第２の発明の酵素活性測定用カ
ラムに、同一用途に用いられる活性測定対象酵素類を導
入し、得られる基質分解物を定量することにより、活性
測定対象酵素類の活性比較を行うことを特徴とする酵素
選別方法に関する。

以下、本発明の酵素活性測定用充填部、それを充填し
たカラム、酵素活性測定装置およびそれを用いる酵素活
性の測定方法について説明する。

本発明の酵素活性測定用充填剤は、酵素によつて認識
される基質であつて、かつビオチンの結合した基質を水
に不溶性の支持体であつて、かつアビジンの結合した支
持体に固定化させることによつて調製される。

用いられる水に不溶性の支持体としては、ポーラスま
たはノンポーラスのいずれであつてもよく、従来しばし
ば用いられてきたセルロース、アガロース、デキストラ
ン等の多糖体およびポリアクリルアミドのようないわゆ
るソフトビーズ；シリカゲル；スチレン系重合体、ビニ
ルアルコール系重合体及びメタクリレート系重合体など
のような合成高分子ビーズ等があげられるが、高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）として用いるためにはシリ
カゲルおよび合成高分子ビーズのような硬質ビーズが望
ましい。粒径は特に制限はないが３〜100μｍの範囲が
望ましい。

支持体に酵素によつて認識される基質を固定化させる
に際しては、支持体に結合されたアビジンと、基質に結
合されたビオチンを介して固定を行わしめるが、支持体
にアビジンを結合させるに際しては、まず上記支持体が
有する結合基導入基、例えば水酸基にアビジンが共有結
合可能な官能基を有する結合基を結合させることが必要
である。

官能基としてはエポキシ基、アミノ基、ヒドラジノ
基、カルボキシル基、ホルミル基等が例示される。これ
らの官能基を有する結合基の支持体への導入は、公知の
方法で適当な溶媒の存在下で容易に行うことができる。
例えばエポキシ基を有する結合基としてはエピクロロヒ
ドリンのようなエピハロヒドリン類、1,4−ブタンジオ
ールジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテ
ル類、1,7−オクタジエンジエポキシドのようなジエポ
キシド類等があげられるが、これらは支持体上の水酸基
とアルカリ条件下で速やかに反応しエポキシ変性支持体
を与える。また、得られたエポキシ変性支持体は、アン
モニア、ヒドラジン、あるいはプロパンジアミンのよう
なジアミノアルカン類等と反応させることによりアミノ
基を有するアミノ変性支持体を、またアミノ酪酸のよう
なアミノカルボン酸類と反応させることでカルボキシル
変性支持体を、また、エポキシ基を加水分解し過ヨウ素
酸酸化を行うことでホルミル変性支持体を与える。ま
た、アミノ変性支持体は無水コハク酸のような酸無水物
と反応させることによりカルボキシル変性支持体とする
こともできる。これらの官能基を有するい支持体にアビ
ジンを結合させるに際しては、結合基が有する官能基に
応じて必要であれば、適宜触媒や反応試薬等を用いて適
当な溶媒下で行うことができる。例えば触媒としては、
塩酸や炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムなどの
酸、アルカリが主として官能基がエポキシ基の場合に用
いられ、また、例えば反応試薬としては、Ｎ−ヒドロキ
シコハク酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドまたはカルボニルジイミダゾールのような縮
合剤が官能基がカルボキシル基またはアミノ基の場合
に、また水素化シアノホウ素ナトリウムのような還元剤
が官能基がホルミル基の場合に用いられる等々を例示す
ることができる。また溶媒としては通常水が用いられる
が必要に応じてリン酸緩衝液や酢酸緩衝液として用いる
こともでき、また塩化ナトリウムなどの無機塩類を添加
して用いることも可能である。

なお、結合基の長さとしては、特に制限はないが、原
子数６〜30が望ましい。

官能基を有する支持体に固定化させるアビジンは、通
常四量体として卵白から得られるものであるが、ビオチ
ンと結合能を有するものであれば、微生物から得られる
ストレプトアビジン、単量体のアビジンまたはビオチン
結合能を失わない程度に化学修飾したアビジンでもよ
く、化学修飾としてはグアニジル化、アセチル化、カル
バミル化、スクシニル化、還元アルキル化などを例示す
ることができる。

基質にビオチンを結合させるに際しては、ビオチンが
有するカルボキシル基に基質を共有結合させることが必
要であるが、この際に、基質を直接共有結合させる以外
に、ビオチンのカルボキシル基に、基質が共有結合可能
な前記のごとき官能基を有する結合基を介して結合させ
て行うことができる。ビオチンと基質を直接または結合
基を介して結合させるには、例えば、前述の支持体にア
ビジンを結合させる際と同様に、公知の方法で適当な溶
媒の存在下で容易に行うことができるが、ビオチンまた
はビオチンアミドカプロン酸のＮ−ヒドロキシコハク酸
イミドエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホコハク酸イ
ミドエステルなどの市販の試薬を用いて容易に基質と結
合させることが可能である。

なお、結合基の長さとしては、特に制限はないが、原
子数６〜30が望ましい。

基質に結合させるビオチンについて、天然にはＤ形、
即ち（＋）−cis−ヘキサヒドロ−２−オキソ−1H−チ
エノ−（３、４）−イミダゾール−４−吉草酸しか存在
しないが、アビジンと結合能を有するものであれば他の
立体異性体でもよく、また２−イミノビオチン、ジアミ
ノビオチンまたはデスチオビオチンなどでもよい。

ビオチンと結合させる酵素にによつて認識される基質
は、対応する活性測定対象酵素との接触により基質分解
物を生じるものであればよく、特に制限されない。基質
の代表例としては、グルコース、コレステロール、コリ
ン、尿酸、ベンジルアミン、ヒスタミンなどのアミン
類、キサンチン、アセチルコリン、グルタチオン、チミ
ジン−５−リン酸、コンドロイチン硫酸、（デオキシ）
リボ核酸、コレステロールエステル、ビスパラニトロフ
ェニルリン酸などのリン酸エステル、アルギニン、リジ
ン、チロシンなどのアミノ酸、フェニルアラニルセリル
アルギニンのようにＣ末端に特異的なアミノ酸を有する
オリゴペプチドのＣ末端にパラニトロアニリンなどの標
識化合物が結合したもの、グリシルグルタミン酸のよう
なオリゴペプチドがエステル縮合したもの、、ベンゾイ
ルアルギニンエチルエステルなどのような合成基質、α
−（β−）グルコース、α−（β−）ガラクトース、α
−（β−）マンノース、β−フルクトース、α，α−ト
レハロース、β−グルクロン酸、α−Ｌ−フコースがグ
ルコースなどの他の糖とあるいはメチルウンベリフェロ
ンなどのような標識化合物とグリコシド結合しているも
の、セルロース、キチン、デキストラン、デンプン、ヘ
パリン、フルクトース、−1,6−ビスリン酸などがあげ
られる。

上記のようにして得られた酵素によって認識される基
質を結合したビオチンは、水系あるいはジメチルスルホ
キサイドのような適当な溶媒中で前述のアビジンを結合
した水に不溶性の支持体と接触させることにより固定化
され、酵素活性測定用充填剤として得ることができる。
この充填剤は通常は常法に従つて中空管に充填され、酵
素活性の測定用カラムとして使用されるため、基質結合
ビオチンを、アビジン結合支持体が予め充填された中空
管に流して固定化を行い、酵素活性測定用のカラムを得
ることもできる。

酵素活性測定用充填剤を充填する中空管の材質は、一
般的にはガラス製、ステンレス製、チタン製、プラスチ
ック製、ステンレスの内壁をプラスチックで被覆したも
の等が用いられる。中空管のサイズは、目的に応じて適
宜決めればよく、特に制限はない。

酵素活性測定用充填の中空管への充填方法は、常法に
従つて行われ、特に制限はない。また、充填量は適宜選
択すればよい。

本発明によつて得られた酵素活性測定用カラムを用い
て酵素活性を測定するには、活性測定対象酵素をカラム
に注入し、得られる基質分解物を定量することによつて
行われる。すなわち、酵素活性測定対象酵素が該カラム
を通過するに伴い、対象酵素の活性に対応した量の基質
分解物を生成し、生成した基質分解物を紫外吸収、蛍
光、屈折率などの検出器または電気化学検出器等を用い
て検出することができる。酵素活性を測定するに当たつ
ては、上記検出器のほかに、図１に示すごとく溶離液を
酵素活性測定用カラムに流すための送液ポンプ、活性測
定対象酵素を酵素活性測定用カラムに注入するためのサ
ンプリングバルブが少なくとも必要であるが、さらに酵
素活性測定用カラムを一定温度に保つための恒温槽の使
用が望ましい。測定温度は、特に制限はないが、通常は
４〜60℃の範囲が望ましい。

活性測定対象酵素は、特に制限はなく、すべての酵素
が適用できる。活性測定対象酵素は、精製した単一標品
のほか、粗精製標品でもよく、また、生体試料中に存在
している一成分であつてもよい。特に試料中に他の夾雑
タンパク質などの他物質が存在しているような場合に
は、ゲル濾過、イオン交換、分配吸着、疎水性、アフィ
ニティなどの分離モードのクロマトグラフィーカラムと
組合せ、酵素活性測定用カラムをこれらのプレカラムま
たはポストカラムとして併用することができる。特にこ
うしたポストカラム法では、酵素活性測定と同時に分離
ゲルカラムによつて分離されたピークのどの部分に活性
が存在しているかを直ちに知ることが出来る。HPLC装置
に組み込むことにより少量の試料で感度よく、短時間で
容易に酵素活性を測定することができ、また他の様々の
分離カラムとの組合せも有利となる。

本発明に係る酵素によつて認識される支持体に固定化
された基質は、活性測定対象酵素との接触により基質分
解物を生じるものであればよい。例えば活性測定対象酵
素としてオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、
ヒドラーゼ、リアーゼ等を適用した場合、これらの活性
測定対象酵素と基質の好ましい組み合わせ及びそれらを
組み合わせた系から生じる基質分解物の検出方法につい
て例示する。

まず、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、ア
ミンオキシダーゼ、及びキサンチンオキシダーゼなどの
ようなオキシダーゼに対応する基質としては、それぞれ
グルコース、コレステロール、コリン、尿酸、ベンジル
アミン、ヒスタミンなどのアミン類、及びキサンチンな
どをあげることができる。これらの系で生じる基質分解
物は、主として過酸化水素であり、例えば電気化学的に
容易に検出測定することができる。

また、ヒドロラーゼとしては、エステラーゼ、プロテ
アーゼ、グリコシダーゼなどがある。エステラーゼにつ
いては、特に種類は問わないが、アセチルコリンエステ
ラーゼ、グルタチオンチオールエステルヒドラーゼ、ホ
スホジエステラーゼＩ、コンドロイチンスルファター
ゼ、（デオキシ）リボヌクレアーゼＩ、IIのようなヌク
レアーゼ、コレステロールエステラーゼ、アルカリホス
ファターゼ等に於いては、それぞれに対応する基質とし
てアセチルコリン、グリタチオン、チミジン−５−リン
酸、コンドロイチン硫酸、（デオキシ）リボ核酸、コレ
ステロールエステル、ビスパラニトロフェニルリン酸な
どのリン酸エステルをあげることができる。これらの系
で生じる基質分解物は、コリン、グルタチオン、チミジ
ン、コンドロイチン、ヌクレオチド、コレステロール、
パラニトロフェノールなどであり、これらはいずれも紫
外吸収、蛍光あるいは屈折率等の変化により検出測定す
ることができる。

トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ブロメライ
ン、プロナーゼ、キモパパイン、ペプシン、キモトリプ
シン、トロンビン、などのプロテアーゼにおいては、基
質としてはアルギニン、リジン、チロシンなどのよう
な、対象酵素が特異性を持つアミノ酸またはフェニルア
ラニルセリルアルギニンのようにＣ末端に特異的なアミ
ノ酸を有するオリゴペプチドのＣ末端にパラニトロアニ
リンなどの標識化合物が結合したもの（以下、（Ａ）と
いう）、あるいはグリシルグルタミン酸のようなオリゴ
ペプチドがエステル結合したもの（以下、（Ｂ）とい
う）、あるいはベンゾイルアルギニンエチルエステルな
どのような合成基質（以下、（Ｃ）という）があげられ
る。これらプロテアーゼの場合、上記（Ａ）および
（Ｂ）の系では、特異的なアミノ酸に結合していた標識
化合物またはオリゴペプチドが、また（Ｃ）の系では合
成基質の分解生成物が生成してくる。したがって、これ
らの生成物の検出は生成化合物の性質に応じて適宜選択
することができる。生成物が標識化合物の場合、パラニ
トロフェノール、パラニトロアニリンのような紫外吸収
を持つ化合物は、紫外分光光度系により検出測定する。
また、４−アミノメチルクマリンのような蛍光を持つ化
合物の場合は、蛍光光度計により検出測定する。また、
オリゴペプチドおよびベンゾイル基またはダンシル基な
どを有する合成基質分解生成物が生成してくる場合に
は、紫外分光光度計あるいは屈折計を用いて検出測定す
ることができる。

グリコシダーゼにおいては、α−（β−）グルコシダ
ーゼ、α−（β−）ガラクトシダーゼ、α−（β−）マ
ンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α，α−トレハ
ラーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ
などがあり、それぞれ基質としてはα−（β−）グルコ
ース、α−（β−）ガラクトース、α−（β−）マンノ
ース、β−フルクトース、α，α−トレハロース、β−
グルクロン酸、α−Ｌ−フコースがグルコースなどの他
の糖とあるいはメチルウンベリフェロンなどのような標
識化合物とグリコシド結合しているものをあげることが
できる。また、セルラーゼ、キチナーゼ、デキストラナ
ーゼ、ジアスターゼ、ヘパリナーゼ、といった多糖に特
異性をもつグリコシダーゼに対する基質としては、セル
ロース、キチン、デキストラン、デンプン、ヘパリンを
あげることができる。

これらグリコシダーゼにおいて、分解生成物が糖であ
る場合には屈折計により、また紫外吸収あるいは蛍光に
ある標識化合物である場合には、紫外分光光度計、蛍光
光度計により検出測定することができる。

さらに、リアーゼにおいては、例えばフルクトースビ
スリン酸アルドラーゼなどのアルドラーゼがあげられ
る。基質としては、フルクトース−1,6−ビスリン酸な
どを用い分解生成物であるジヒドロキシアセトンリン酸
またはグリセルアルデヒド−３−リン酸などを紫外分光
光度計あるいは示差屈折計を用いて検出測定することが
できる。

本発明に係わる活性測定対象酵素は、前述のごとく精
製、未精製を問わずその酵素の活性値を測定することが
できるが、そのほか本発明において同一基質固定化カラ
ムを用いて、同一用途に用いられる活性測定対象酵素類
の活性比較を行って酵素選別を行うことができる。例え
ば、アルギニンパラニトロアニリドまたはリジンパラニ
トロアニリドを固定化基質として用いた場合、アルギニ
ンまたはリジンに対して特異的な作用を有する酵素はす
べて活性測定対象酵素類として例示することができ、測
定対象酵素類の活性は各酵素活性に応じて生成する分解
生成物であるパラニトロアニリンを検出することによっ
て比較することができる。アルギニンパラニトロアニリ
ド固定化カラムによる活性比較対象酵素には、トロンビ
ン、トリプシン、XI a因子、XII a因子、X a因子、カリ
クレイン、ウロキナーゼなどを挙げることができ、リジ
ンパラニトロアニリド固定化カラムを用いた場合には、
プラスミンや、カリクレイン、エンテロキナーゼなどの
活性を比較することができる。本比較法は、上記アルギ
ニン、リジンに特異的な既知のプロテアーゼにとどまら
ず、広範囲にわたる未知の、またプロテアーゼ以外の様
々な酵素に対して用い得ることは言うまでもない。一般
に、ほとんど同一の基質特異性を有するにも関わらず、
活性が非常に異なっている酵素は数多く知られている
が、本発明の酵素活性測定用カラムを用いることによ
り、それらの酵素の簡便な議別同定に用いることができ
る。

さらに、本発明に係わる活性測定対象酵素は、当該酵
素の活性阻害剤の共存下において、なお遊離の活性部位
を有する酵素による活性を示す場合、上述の支持体に固
定化された基質を用いてその残存活性を測定することが
できる。共存酵素阻害剤としては特に制限はなく、天然
物由来または合成化合物を問わず、また阻害形式を問わ
ず、通常知られている物質を例示することができる。例
えば、金属や無機元素を含む化合物の例として、システ
イン残基を活性部位に持つチオール酵素に対するヨード
酢酸やｐ−メルクリ安息香酸、カタラーゼなどのヘム酵
素に対する一酸化炭素やシアン化水素酸などがあげられ
る。動物や植物中に見いだされる阻害物質は非常に種類
が多いが、これらは生体の調節機構や代謝経路に於て重
要な役割を担っているためである。例えばトリプシン、
トロンビン、プラスミン、キモトリプシン、カテプシン
のようなプロテアーゼに対してα−１−アンチトリプシ
ン、α−２−マクログロブリン（α2M）、コントラプシ
ン、ムリノグロブリン、インター−α−トリプシンイン
ヒビター、アンチトロンビン−III（AT−III）、ヘパリ
ンコフファクターII、プロテインCaインヒビター、α−
２−プラスミンインヒビター、C1−インアクチベータ
ー、α−１−アンチキモトリプシン、SH−プロテイナー
ゼインヒビターのような阻害物質が動物体内に知られて
いるが、植物体内にも例えばダイズトリプシンインヒビ
ターが知られている。さらに、Ｌ−トレオニンデヒドロ
ゲナーゼのようなデヒドロゲナーゼがＬ−イソロイシン
により阻害されるなどは代謝調節のほんの一例である。
さらに、微生物が産み出す酵素阻害剤の例としては、プ
ロテアーゼに対するロイペプチン、アンチパイン、キモ
スタチンや、エラスタチナール、ホスホラミドン、シア
リダーゼに対するパノシアリン、β−ガラクトシダーゼ
に対するピリジンドロール、チロシンヒドロキシラーゼ
に対するウデノン、ドパミン−β−ヒドロキシラーゼに
対するフザリン酸やドパスチン、ドーパデカルボキシラ
ーゼに対するイソフラボンなどである。その他特に例示
はしないが非常に多くの化学合成された阻害化合物が知
られおり酵素阻害剤の枚挙は遑がない。

酵素阻害剤共存下での酵素活性の測定値は、全酵素活
性から酵素阻害剤による酵素活性の失活分を差し引いた
値を示すことになることから、既知量の酵素阻害剤を用
いることにより全酵素活性を求めることができるが、逆
に、既知量の酵素を用いることにより酵素阻害剤の量を
求めることができる。また、既知量の酵素阻害剤または
既知量の酵素を一定量ずつ数回に分けて加えることによ
り行うこともできる。

［実施例］ 以下、本発明について代表的な例を示しさらに具体的
に説明する。なお、これらは説明のための単なる例示で
あって本発明はこれらになんら制限されるものでないこ
とはいうまでもない。

実施例１ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメ
タクリレートから得られた水酸基変性ビーズに、1M水酸
化ナトリウム中で１、４−ブタンジオールジグリシジル
エーテルを反応させ、エポキシ基を導入してエポキシ基
変性ビーズとした。このビーズ1gを、1.5M硫酸ナトリウ
ムを含む0.05N炭酸水素ナトリウム水溶液（pH11）の3ml
に50mgのアビジンを溶解した溶液中に加え、30℃で10時
間振盪反応後、25℃で一晩放置し、アビジン結合支持体
を得た。次いでビーズを濾取し、1M塩化ナトリウム水溶
液および水で洗浄した。こうして得られたアビジン結合
支持体は、反応に用いたアビジンを総て担持させている
ことが確かめられた。

一方、3.4mgのＮ−ヒドロキシコハク酸イミドビオチ
ンのジメチルスルホキサイド1mlにおける溶液に、6.0mg
のＤ−フェニルアラニルピペコリルアルギニンパラニト
ロアニリド（Ｓ−2238、Kabi社）を加え、25℃で２時間
遮光下で放置した。この溶液を、先に得られたアビジン
結合支持体とともに9mlの燐酸緩衝液（pH7.4）に加え、
25℃で１時間遮光下で振盪した。次いでビーズを濾取
し、1M塩化ナトリウム水溶液、0.01N塩酸および水で洗
浄した。こうして得られたＳ−2238固定化充填剤は、ビ
ーズ1gあたりＳ−2238を2.2μmolを担持させていること
が、基質完全消化法により確かめられた。

実施例２ 実施例１におけるＮ−ヒドロキシコハク酸イミドビオ
チンの代わりにビオチンアミドカプロン酸のＮ−ヒドロ
キシコハク酸イミドエステルを用い、またＳ−2238の代
わりにアルギニンパラニロトロアニリドを用い、他は同
様に操作することによりアルギニパラニトロアニリド固
定化充填剤が得られた。

実施例３ 実施例２におけるアルギニンパラニトロアニリドの代
わりにＳ−2238を用い、他は同様に操作することにより
Ｓ−2238固定化充填剤が得られた。

実施例４ 実施例３におけるビオチンアミドカプロン酸のＮ−ヒ
ドロキシコハク酸イミドエステルの代わりにビオチンア
ミドカプロン酸アミドカプロ酸のＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドエステルを用い、他は同様に操作することによ
りＳ−2238固定化充填剤が得られた。

測定１ 上記のように得られたＳ−2238固定化充填剤を、内径
4.6mm、長さ7.5cmのステンレス製カラムに充填し、酵素
活性測定用カラムとした。また、実施例１におけるエポ
キシ基変性ビーズにγ−アミノ酪酸でカルボキシル基を
導入したカルボキシル基変性ビーズを内径4.6mm、長さ
1.0mmのステンレス製カラムに充填しポストカラムとし
た。高速液体クロマトグラフにこれらのカラムを組み込
み（図１）、トリプシンを注入してその活性値を測定し
たところ、注入したトリプシンの活性値とウロマトグラ
ムで得られたピーク面積は非常に良い相関を示した（図
２）。

第１図は本発明による酵素活性測定装置の模式図であ
り、図中〜は、送液ポンプ、サンプリングバル
ブ、恒温槽、酵素活性測定用カラム、検出器を示
す。図２は、注入したトリプシンの活性値を得られた測
定値の相関を示したものである。図中、縦軸は分解生成
物であるパラニトロアニリン（pNA）のピーク面積（×1
0^-3＝pNA μmole）を、横軸は注入したトリプシンの活
性（BAEEnkat/5μmole）を示す。また高速液体クロマト
グラフの測定条件は以下の通りである。

溶離液:50mMトリスー塩酸緩衝液（pH7.4）＋1mM塩化
カルシウム 流 速:1ml/min 検 出:405nm 温 度:25℃ 試 料：トリプシン（ウシ、すい臓、Sigma社製）、 BAEE（ベンゾイルアルギニンエチルエステル）に対する
加水分解活性量としてnkat/5μｌ（溶離液＋0.5mM塩化
カルシウム）の溶液を調整し使用。

測定２ 測定１と同じ装置を用いて、トリプシン2nkat/5μｌ
を注入し、流速に対するトリプシン活性値の依存性を調
べた。図３は、流速とpNAのピーク面積との関係を示し
たものであり図中、縦軸はpNAのピーク面積（×10^-3＝p
NAμmole）を、横軸は流速（ml/min）を示す。この結果
より、流速の増加に伴つて値が減少する傾向がみられ
た。なお、高速液体クロマトグラフの条件は、流速を除
いて測定１に準じた。

測定３ 測定１と同じ装置を用いて、トリプシン2nkat/5μｌ
を注入し、検出されるトリプシン活性値と溶離液中の塩
濃度との相関を検討した。ここで溶離液として50mMトリ
スー塩酸緩衝液（pH7.4）＋1mM塩化カルシウム±塩化ナ
トリウムを用い、その他の条件は測定１に準じた。図４
は、塩濃度とpNAのピーク面積との関係を示したもので
あり、図中縦軸はpNAのピーク面積（×10^-3＝pNAμmol
e）を、横軸は溶離液中の塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を
示す。この結果より、本装置で検出されるトリプシン活
性値は、約0.25Mの塩存在下に於いて最も高く、その後
徐々に低下することが分かつた。

測定４ 測定１と同じ装置を用いて、トリプシン2nkat/5μｌ
を注入し、検出されるトリプシン活性値と測定温度との
相関を検討した。図５は、温度と測定値との関係を示し
たものであり、図中縦軸はpNAのピーク面積（×10^-3＝p
NAμmole）を、横軸は温度（℃）を示す。この結果か
ら、本装置で検出されるトリプシン活性値は、約50℃で
最も高いことが分かつた。なお高速液体クロマトグラフ
の条件は温度を除いて測定１に準じた。

実施例５ 実施例４と同じ装置を用いて、一定量のダイズトリプ
シンインヒビター（STI、Sigma社、約0.3×10^-2nmole）
を含む緩衝液（0.15M NaClを含む50mMトリスー塩酸緩
衝液、pH7.4）0.8mlに、０、３、６、９、12、14、16×
10^-2nmoleのトリプシンを含む上記緩衝液0.2mlをそれぞ
れ用意し、上記STI溶液にそれぞれ加えた。室温で５分
間放置して得られた試料のうち、それぞれ0.5mlを本装
置に注入し遊離するpNAのピーク面積を測定した。ま
た、全くSTIを含まない上記緩衝液0.8mlにトリプシンを
加え同様の操作を行つてブランクとした。

本装置により、各試料に於けるトリプシン活性値を検
出し、STIとトリプシンの結合比率を求めた結果を図６
に示す。図中縦軸はpNAのピーク面積を、横軸は注入し
たトリプシンの活性（BAEEnkat/5μｌ）を示す。また、
Ａ及びＢはそれぞれSTI非存在下、存在下で測定を行つ
たことを示す。STI存在下及び非存在下におけるトリプ
シン活性値を比較することにより、本試料中に存在する
STIは、STI:トリプシン＝2:1の割合でトリプシンと結合
したということが判った。尚、その他の溶離条件は実施
例４に準じた。

実施例６ 実施例４と同じ装置を用いて、40μｇ（約0.4μkat）
のトリプシン、40μｇ（約10NIHU）のトロンビン、45μ
ｇ（約2.5BAEEμkat）のカリクレリン及び50μｇ（約0.
4nkat）のウロキナーゼを含む緩衝液（50mMトリスー塩
酸緩衝液、pH7.4）1mlのうちそれぞれ20μｌを本装置に
注入し、遊離する各酵素活性値を検出し比較した。その
結果を図７に示した。図中、横軸は検出したpNAピーク
面積比を、またＡ〜Ｄは注入した酵素を示し、それぞれ
トリプシン、トロンビン、ウロキナーゼ及びカリクレイ
ンを表す。この結果より、本酵素活性測定用カラムから
遊離したpNAピークは、トロンビン、トリプシンの順に
高く、ウロキナーゼ及びカリクレインは検出されないこ
とが判った。なお使用した試料は以下の通りでありその
ほかの溶離条件は実施例４に準じた。

試料：トリプシン（ウシ、すい臓、Sigma社） トロンビン（ヒト、血しょう、Sigma社） カリクレイン（ブタ、すい臓、Sigma社） ウロキナーゼ（ヒト、肝臓、Sigma社、尚、ウ
ロキナーゼの活性はpH7.5、37℃でα−カゼイン溶液1ml
の275nmに於ける吸光度を１分間に１変化させるプラス
ミノーゲンを活性化する酵素量とした。） ［発明の効果］ 本発明による酵素活性測定方法は、前記従来の酵素活
性測定方法の欠点を克服した簡便、迅速で精度の高い方
法であり、今後、酵素の分離精製に係わる様々な分野に
おいて有用な手段を提供するものであるが、その中でも
特に類似酵素の選別や酵素活性の強弱の判定など簡単な
スクリーニング方法に応用が可能であり、またさらに、
酵素阻害剤の定量や酵素と阻害剤の結合比率などという
ような、活性測定対象酵素と他の物質との相互作用など
に関する知見を簡単に得ることができるなど有用性は非
常に大きい。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明による酵素活性測定装置の模式図であ
る。図２は、実施例４に於ける、トリプシンの活性値と
pNAのピーク面積との関係を示した図である。図３は、
流速とpNAのピーク面積との関係を示した図である。図
４は、塩濃度とpNAのピーク面積との関係を示した図で
ある。図５は、温度とpNAのピーク面積との関係を示し
た図である。図６は、実施例５に於けるトリプシン活性
値とpNAのピーク面積との関係を示した図である。図７
は、実施例６に於ける各酵素活性値を示した図である。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵素によつて認識される基質にビオチンが
   結合されており、水に不溶性の支持体にアビジンが結合
   されており、かつ前記基質が前記支持体にその基質に結
   合されているビオチンとその支持体に結合されているア
   ビジンとを介して固定化されていることを特徴とする酵
   素活性測定用充填剤。
2. 【請求項２】請求項（１）記載の酵素活性測定用充填剤
   を中空管に充填せしめてなることを特徴とする酵素活性
   測定用カラム。
3. 【請求項３】送液ポンプ、サンプリングバルブ、請求項
   （２）記載の酵素活性測定用カラムおよび分解した基質
   を検知する検出器により本質的になる酵素活性測定装
   置。
4. 【請求項４】請求項（２）記載の酵素活性測定用カラム
   に、活性測定対象酵素を導入し、得られる基質分解物を
   定量することを特徴とする酵素活性測定方法。
5. 【請求項５】請求項（２）記載の酵素活性測定用カラム
   に、阻害剤が共存する活性測定対象酵素を導入し、得ら
   れる基質分解物を定量することにより、活性測定対象酵
   素の残存活性または阻害剤を定量することを特徴とする
   阻害剤の共存下における酵素活性測定方法。
6. 【請求項６】請求項（２）記載の酵素活性測定用カラム
   に、同一用途に用いられる活性測定対象酵素類を導入
   し、得られる基質分解物を定量することにより、活性測
   定対象酵素類の活性比較を行うことを特徴とする酵素選
   別方法。