JPH02163097A - 阻害剤の共存下における酵素活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、酵素活性測定用充填剤を充填したカラムを用
いて酵素阻害剤の共存下において行う酵素活性測定方法
に関する。

［従来の技術］ 酵素は、生箱胞により合成されるタンパク質であり、そ
の生体反応に対する触媒作用が生命の維持に重要な役割
を持つことが知られている。自然界には、動、植物また
は微生物起源の数百万種にのぼる酵素が存在しているが
、その中で単離された約２，０００種のうちのあるもの
は、工業用酵素として食品や洗剤関係に、また医療用酵
素として酵素製剤や分析、ｌ［未検査用に、さらに近年
は遺伝子工学用にと幅広く利用されている。酵素の活性
を測定することは、即ち酵素の触媒能を測ることであり
、酵素の機能を示す基本的な指標を得ることに他ならな
い。従来より酵素活性の測定は、基質の減少量または生
成物の増加量を分析することで行われてきたが、その方
法としては例えば酵素の種類により反応後の基質の減少
量を吸光光度計を用いて吸光度で測定する方法、基質ま
たは生成物を化学試薬で発色させて測定する方法、生成
物をさらに着色性の物質に転換して測定する方法等がし
ばしば用いられている。その他、基質を放射性の元素で
ｍａｔ、て検出する方法などいろいろあるが、総じてい
えることは測定する酵素の量が多く試薬が高価となるこ
と、使用する試薬の種類が多いこと、測定に長時間を要
すること、測定技術に熟練を要すること、不純物の影響
を受は易く正確な値が得にくいこと、等々の欠点を有す
ることであった。これらの欠点に対応した工夫の一つと
して、液体クロマトグラフィーと組み合わせることによ
り酵素のカラムによる分離精製を行い、カラム溶出後、
基質溶液と接触させて基質の減少量を測定することがな
された［エッチ、ニー、チエイス：　ジャーナル・オブ
・ケミカルテクノロジー・アンド・バイオテクノロジー
、３６巻、３５１頁。

１９８６　年、　　（Ｈ，Ａ、　　Ｃｈａｓｅ：　　Ｊ
、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｔｅｃｈ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ、、　　３６．３５１（１９８６）　）および　伊
藤尚史ら：ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、４
００巻、１６３　頁、　１９８７　年、　（Ｎ、　　Ｉ
ｔｏ　ｅｔ　ａｌ：　　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ（「、、
側、１６３（１９８７）　）　］。しかし、この方法も
高価な試薬を連続して流し続ける必要があること及びそ
のためにポンプなど新たな装置が必要となるなどの点で
必ずしも満足すべきものではない。また、以上の酵素測
定の技術は、活性測定対象酵素の阻害剤が共存する場合
も全く同様と考えることができる。

［発明が解決しようとする課ｇ］ 本発明の目的は、前記従来の酵素活性測定方法の欠点を
克服して、活性測定対象酵素の阻害剤共存下において簡
便、迅速でしかも精度の高い酵素活性の測定が可能な酵
素活性の測定方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明によって上記目的を達成し得る酵素活性の測定方
法が提供される。

即ち、本発明は、阻害剤が共存する活性測定対象酵素を
、酵素によって認識される基質を水に不溶性の支持体に
固定化してなる酵素活性測定用充填剤を中空管に充填せ
しめてなるカラムに導入し、得られる基質分解物を定量
することにより、活性測定対象酵素の残存活性または阻
害剤を定量することを特徴とする、阻害剤の共存下にお
ける酵素活性測定方法に関する。

以下、本発明における酵素活性測定用充填剤、それを充
填したカラム及びそれを用いる酵素活性の測定方法につ
いて説明する。

本発明の酵素活性測定用充填剤は、酵素にょフて認識さ
れる基質を水に不溶性の支持体に固定化させることによ
ってｍＨされる。

用いられる水に不溶性の支持体としては、ポーラスまた
はノンポーラスのいずれであってもよく、従来しばしば
用いられてきたセルロース、アガロース、デキストラン
等の多糖体及びポリアクリルアミドのようないわゆるソ
フトビーズ；　シリカゲル：　スチレン系重合体、ビニ
ルアルコール系重合体及びメタクリレート系重合体など
のような合成高分子ビーズ等があげられるが、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）として用いるためには
シリカゲルおよび合成高分子ビーズのような硬質ビーズ
が望ましい。粒径は特に制限はないが３〜１００μｍの
範囲が望ましい。

支持体に酵素によって認識される基質を結合させるに際
しては、まず上記支持体が有する結合基導入基１例えば
水酸基に基質が共有結合可能な官能基を有する結合基を
結合させることが必要である。

官能基としてはエポキシ基、アミノ基、ヒドラジノ基、
カルボキシル基、ホルミル基等が例示される。これらの
官能基を有する結合基の支持体への導入は、公知の方法
で適当な溶媒の存在下で容易に行うことができる。例え
ばエポキシ基を有する結合基としてはエビクロロヒドリ
ンのようなエビハロヒドリン類、１，４−ブタンジオー
ルジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテル
類、１．７−オクタジニンジエボキシドにょうなジェポ
キシド類等があげられるが、これらは支持体上の水酸基
とアルカリ条件下で速やかに反応しエポキシ変性支持体
を与える。また、得られたエポキシ変性支持体は、アン
モニ乙　ヒドラジン、あるいはプロパンジアミンのよう
なジアミノアルカン類等と反応させることによりアミノ
基を有するアミノ変性支持体を、またアミノ酪酸にょう
なアミノカルボンａｌＩと反応させることでカルボキシ
ル変性支持体を、また、エポキシ基を加水分解し過ヨウ
素酸酸化を行うことでホルミル変性支持体を与える。ま
た、アミン変性支持体は、無水コハク酸のような酸無水
物と反応させることによりカルボキシル変性支持体とす
ることもできる。これらの官能基を有する支持体に酵素
によって認識される基質を結合させるに際しては、結合
基が有する官能基に応じて必要であれば、適宜触媒や反
応試薬等を用いて適当な溶媒下で行うことができる。例
えば触媒としては、塩酸や炭酸ナトリウムまたは炭酸水
素ナトリウムなどの酸、アルカリが主として官能基がエ
ポキシ基の場合に用いられ、また、例えば反応試薬とし
ては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、■−エチルー３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）　カルボジイミドまたはカルボニルジイ
ミダゾールのような、縮合剤が官能基がカルボキシル基
またはアミノ基の場合に、また水素化シアノホウ素ナト
リウムのような還元剤が官能基がホルミル基の場合に用
いられる等々を例示することができる。また、溶媒とし
ては、通常水が用いられるが、必要に応じてリン酸や酢
酸緩衝液として用いることもでき、また塩化ナトリウム
などの無機塩類を添加して用いることも可能である。

なお、結合基の長さとしては、特に制限はないが、原子
数６〜３０が望ましい。

官能基を有する支持体に固定化させる酵素によって認識
される基質は、対応する活性測定対象酵素との接触によ
り基質分解物を生じるものであればよく、特に１１限さ
れない。基質の代表例としては、グルコース、コレステ
ロール、コリン、尿酸、ベンジルアミン、ヒスタミンな
どのアミン類、キサンチン、アセチルコリン、グルタチ
オン、チミジン−５−リン酸、　コンドロイチン硫酸、
　（デオキシ）リホ核酸、コレステロールエステル、ビ
スパラニトロフェニルリン酸などのリン酸モノエステル
、アルギニン、リジン、チロシンなどのアミノ酸、フェ
ニルアラニルセリルアルギニンのようにＣ末端に特異的
なアミノ酸を有するオリゴペプチドのＣ末端にバラニト
ロフェニル基などの標識化合物が結合したもの、グリシ
ルグルタミン酸のようなオリゴペプチドがエステル縮合
したもの、ベンゾイルアルギニンエチルエステルなどの
ような合成基質、α−（β−）グルコース、α−（β−
）ガラクトース、　α−（β−）マンノース１、　β−
フルクトース、α、α　〜　トレハロース、　β−グル
クロン酸、α−Ｌ−フコースがグルコースなどの他の糖
とあるいはメチルウンベリフェロンなどのような標識化
合物とグリコシド結合しているもの、セルロース、キチ
ン、デキストラン、デンプン、ヘパリン、フルクトース
　−１，６−ビスリン酸などがあげられる。上記のよう
にして得られた酵素によって認識される基質を水に不溶
性の支持体に固定化してなる酵素活性測定用充填剤は、
通常は常法に従って中空管に充填され、酵素活性の測定
用カラムとして使用される。

酵素活性測定用充填剤を充填する中空管の材質は、一般
的にはガラス製、ステンレス製、テフロン製、ステンレ
スの内壁をテフロンで被覆したもの等が用いられる。中
空管のサイズは、目的に応じて適宜法めればよく、特に
制限はない。

酵素活性測定用充填剤の中空管への充填方法は、常法に
従って行われ特に制限はない。また、充填率は適宜選択
すればよい。

本発明によって得られた酵素活性測定用カラムを用いて
、活性測定対象酵素の残存活性または阻害剤を測定する
には、阻害剤が共存する活性測定対象酵素をカラムに注
入し、得られる基質分解物を定量することによって行わ
れる。即ち、酵素活性測定対象酵素が該カラムを通過す
るに伴い、対象酵素の活性に対応した量の基質分解物を
生成し、生成した基質分解物を紫外吸収、蛍光吸収、屈
折率などの検出器または電気化学検出器等を用いて検出
することができる。測定温度は、特に制限はないが１通
常は４〜６０℃の範囲が望ましい。　活性測定対象酵素
は、特に制限はなく、すべての酵素が適用できる。

本発明に係る酵素及び支持体に固定化された基質は１両
者の接触により基質分解物を生じるものであればよい。

例えば活性測定対象酵素としてオキシドリダクターゼ、
　トランスフェラーゼ、ヒドラーゼ、リアーゼ等を適用
した場合、これらの活性測定対象酵素と基質の好ましい
組み合わせ及びそれらを組み合わせた系から生じる基質
分解物の検出方法について例示する。

まず、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、コリンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミ
ンオキシダーゼ、及びキサンチンオキシダーゼなどのよ
うなオキシダーゼに対応する基質としては、それぞれグ
ルコース、コレステロール、コリン、尿酸、ベンジルア
ミン、ヒスタミンなどのアミン類、及びキサンチンなど
をあげることができる。これらの系で生じる基質分解物
は、主として過酸化水素であり１例えば電気化学的に容
易に検出測定することができる。

また、ヒドロラーゼとしては、エステラーゼ、プロテア
ーゼ、グリコシダーゼなどがある。エステラーゼについ
ては、特に種類は問わないが、アセチルコリンエステラ
ーゼ、グルタチオンチオールエステルヒドラーゼ、ホス
ホジェステラーゼ！、コンドロイチンスルファダーゼ、
　（デオキシ）リボヌクレアーゼＩ、■　のようなヌク
レアーゼ。

コレステロールエステラーゼ、アルカリホスファターゼ
等においては、それぞれに対応するＭＥ質としてアセチ
ルコリン、グルタチオン、チミジン−５−リン酸、コン
ドロイチン硫酸、　（デオキシ）リボ核酸、コレステロ
ールエステル、ビスバラニトロフェニルリン酸などのリ
ン酸モノエステルをあげることができる。これらの系で
生じる基質分解物は、コリン、グルタチオン、チミジン
、コンドロイチン、ヌクレオチド、コレステロール、バ
ラニトロフェノールなどであり、これらはいずれも紫外
吸収、蛍光吸収あるいは屈折率等の変化により検出測定
することができる。

トリプシン、プラスミン、ウロキナーゼ、ブロメライン
、プロナーゼ、キモパパイン、ペプシン。

キモトリプシン、　トロンビンなどのプロテアーゼにお
いては、基質としてはアルギニン、リジン、チロシンな
どのような、対象酵素が特異性を持つアミノ酸またはフ
ェニルアラニルセリルアルギニンのようにＣ末端に特異
的なアミノ酸を有するオリゴペプチドのＣ＊端にバラニ
トロフェニル基などの標識化合物が結合したもの（以下
、　（Ａ）という）、あるいはグリシルグルタミン酸の
ようなオリゴペプチドがエステル結合したもの（以下。

（Ｂ）という）、あるいはベンゾイルアルギニンエチル
エステルなどのような合成基質（以下、　（Ｃ）という
）があげられる、これらプロテアーゼの場合、上記（Ａ
）および（Ｂ）の系では、特異的なアミノ酸に結合して
いた標識化合物またはオリゴペプチドが、また（Ｃ）の
系では合成基質の分解生成物が生成してくる。したがっ
て、これらの生成物の検出は、生成化合物の性質に応じ
て適宜選択することができる。生成物が標識化合物の場
合、パラニトロフェノール、バラニトロアニリンのよう
な紫外吸収を持つ化合物は、紫外分光光度計により検出
測定する。　また、４−アミノメチルクマリンのような
蛍光吸収を持つ化合物の場合は、蛍光光度計により検出
測定する。また、オリゴペプチドおよびベンゾイル基ま
たはダンシル基などを有する合成基質分解生成物が生成
してくる場合には、紫外分光光度計あるいは屈折計を用
いて検出測定することができる。

グリコシダーゼにおいては、α値β−）グルコシダ、−
ゼ、αべβ−）ガラクトシダーゼ、　α−（β−）マン
ノシダーゼ、　β−フルクトシダーゼ、α。

α−トレハラーゼ、　β−グルクロニダーゼ、　α−Ｌ
−フコシダーゼなどがあり、それぞれ基質として番よα
−（β−）グルコース、　α−（β−）ガラクトース、
α−（β−）マンノース、　β−フルクトース、　α、
αトレハロース、　β−グルクロン酸、　α−Ｌ−フコ
ースがグルコースなどの他の糖とある９１番よメチルウ
ンベリフェロンなどのような標識イし金物とグリコシド
結合しているものをあげることカーできる。

また、セルラーゼ、キチナーゼ、デキストラナーゼ、ジ
アスダーゼ、ヘバリナーゼ、と（＼つた多糖に特異性を
もつグリコシダーゼ番こ対する基質としては、セルロー
ス、キチン、デキストラン、デンプン、ヘパリンをあげ
ることができる。

これらグリコシダーゼに°おし）で１分解生成物力（糖
である場合には屈折針により、また紫外吸収あるいは蛍
光吸収のある標識化合物である場合シ二番よ、紫外分光
光度計、蛍光光度計により検８Δ測定することができる
。

さらに、リアーゼにおいては、例えばフルクトースビス
リン酸アルドラーゼなどのアルドラーゼがあげられる。

基質としては、　フルクトース−１゜６−ビスリン酸な
どを用い分解生成物であるジヒドロキシアセトンリン酸
またはグリセルアルデヒド−３−リン酸などを紫外分光
光度計あるいは示差屈折計を用いて検出測定することが
できる。

本発明に係わる活性測定対象酵素は、当該酵素の活性阻
害剤の共存下において、なお遊離の活性部位を有する酵
素による活性を示す場合、上述の支持体に固定化された
基質を用いてその残存活性を測定することができる。

共存酵素阻害剤としては特にＩＩＩ限はなく、天然物由
来または合成化合物を問わず、また阻害形式を問わず１
通常知られている物質を例示することができる。例えば
、金属や無機元素を含む化合物の例として、システィン
残基を活性部位に持つチオール酵素に対するヨード酢酸
や　ｐ−メルクリ安息香酸、カタラーゼなどのヘム酵素
に対する一酸化炭素やシアン化水素酸などがあげられる
。動物や植物中に見いだされる阻害物質は非常に種類が
多いが、これらは生体の調節機構や代謝経路において重
要な後側を担っているためである。例えばトリプシン、
　トロンビン、プラスミン、キモトリプシン、カテプシ
ンのようなプロテアーゼに対してα−１−アンチトリプ
シン、α−２−マクログロブリン（α２Ｍ）−コントラ
ブシン、　ムリノグロプリン、インター−α−トリプシ
ンインヒビター、アンチトロンビン−ＩＩＩ　（Ａ　Ｔ
−ＩＩＩ）、ヘパリンコファクターＩＩ、プロティンＣ
ａインヒビター、　α−２−プラスミンインヒビタ−１
Ｃ１−インアクチベーター　α−１−アンチキモトリプ
シン、　ＳＨ−プロテイナーゼインヒビターのような阻
害物質が動物体内に知られているが、植物体内にも例え
ばダイズトリプシンインヒビターが知られている。さら
に、Ｌ−トレオニンデヒドロゲナーゼのようなデヒドロ
ゲナーゼがし一イソロイシンにより阻害されるなどは代
謝調節のほんの一例である。さらに、微生物が産み出す
酵素阻害剤の例としては、プロテアーゼに対するロイペ
プチン、アンチパイン、キモスタチンや、エラスタチナ
ール、ホスホラミトン、シアリダーゼに対するパノシア
リン、　β−ガラクトシダーゼに対するピリジントロー
ル、チロシンヒドロキシラーゼに対するラブノン、　ド
パミン−β−ヒドロキシラーゼに対するフザリン酸やド
パスチン、ドーパデカルボキシラーゼに対するイソフラ
ボンなどである。その他特に例示はしないが非常に多く
の化学合成された阻害化合物も知られており酵素阻害剤
の枚挙に逼がない。

酵素阻害剤共存下での酵素活性の測定値は、全酵素活性
から酵素阻害剤による酵素活性の失活分を差し引いた値
を示すことになることから、既知量の酵素阻害剤を用い
ることにより全酵素活性を求めることができるが、逆に
、既知量の酵素を用いることにより酵素阻害剤の量を求
めることができる。また、既知量の酵素阻害剤または既
知量の酵素を一定量ずつ数回に分けて加えることにより
行うこともできる。

また、上述の酵素や酵素阻害剤は、精製した単一標品の
他、粗精製標品でもよく、また、生体試料中に存在して
いる一成分であってもよい。特に試料中に夾雑タンパク
質などの他物質が存在しているような場合には、ゲル渡
過、イオン交換、疎水性クロマトグラフィーなどの分離
カラムと組合せ、酵素活性測定用カラムをボストカラム
として併用することもできる。こうしたボストカラム法
では、酵素活性測定と同時に、分離カラムによって分離
されたピークのどの部分に活性が存在しているかを直ち
に知ることができる。高速液体クロマトグラフィー装置
に組み込むことにより少量の試料で感度よく、短時間で
容易に酵素活性を測定することができ、また他の様々の
分離カラムとの組合せも有利となる。

［実施例］ 以下、本発明について代表的な例を示しさらに具体的に
説明する。なお、これらは説明のための単なる例示であ
って本発明はこれらに何ら制限されるものでないことは
いうまでもない。

実施例１ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレートから得られた水酸基変性ビーズに、ＩＭ　Ｎ
ａＯＨ水溶液中で１，４−ブタンジオールジグリシジル
エーテルを反応させエポキシ基を導入した後、　さらに
γ−アミノ酪酸でカルボキシル基を導入した。得られた
ビーズを無水ジオキサンで充分洗浄し、カルボキシル変
性ビーズとした。カルボキシル変性ビーズに、無水ジオ
キサン中でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド及びジシクロ
ヘキシフレカルボジイミドを加え、室温で１．５時間ｍ
ｌｋ反応した後ビーズを濾取し、無水ジオキサン、メタ
ノールで素早く洗浄した。このビーズＩｇをＤ−フェニ
ルアラニルピペコリルアルギニンノくラニトロアニリド
（Ｓ−２２３８Ｋａｂｉ社）　５　ＢのＯ，ＯＩＮ炭酸
１１ｆｉｆ液（ｐＨ９，４）の水３　ｍｌに加え、室温
で２時間振盪反応後、４℃で一夜放置した。　次いでビ
ーズを濾取し、　　ＬＭ　ＮａＣ１水溶液及び水で洗浄
した。こうして得られたＳ−２２３８固定化ビーズは乾
燥ビーズ１ｇあたり　Ｓ−２２３８を約１０μｍｏｌｅ
担持させてＩ／Ａることか確かめられた。

得られたＳ−２２３８固定化ビーズを、内径　４．６開
、長さ　１．０　ｃｍのステンレス製カラムに充填しＳ
−２２３８固定化カラムとした。　また、カルボキシル
変性ビーズを内径４．６順、長さ３．５　ａｍのステン
レス製カラムに充填したものを、ポストカラムとし、高
速液体クロマトグラフ装置に、Ｓ−２２３８固定化カラ
ム及びポストカラムを組み込んだ。

一定量のＡＴ−ＩＩＩ（約１．５　ＮＩＨｕｎｉｔｓ）
を含む緩衝液（０，１５Ｍ　　ＮａＣ１を含む５０ＩＩ
ＩＭトリス塩酸緩街液ｐＨ７，４）　３０μｌに１．３
．２．８．５．２．６．６．ＮＩＩＩ　ｕｎｉしＳのト
ロンビンを含む上記緩衝液８０μｍを用意し、上記Ａ　
Ｔ−ＩＩＩ溶液にそれぞれ加えた。２５℃で３分間放置
して得られた試料のうち５μ■を本装置に注入し、遊離
するバラニトロアニリン（ｐＮＡ）ピークを検出した。

また、全＜　Ａ　Ｔ−ＩＩＩを含まない上記緩衝液３０
μｍにトロンビンを加え同様の操作を行ってブランクと
した。本装置により各試料におけるトロンビン活性値を
検出した。図１に示す通りＡ　Ｔ−ＩＩＩ共存下及び非
共存下におけるトロンビン活性値を比較することにより
、該試料５μｍ中に存在するＡＴ−ＩＩＩは、　トロン
ビン０．１７　ＮＩＩＩ　ｕｎｉｔｓを阻害する量であ
ることがわかった。

なお、クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液　：　　５０＋ｎＭ　）リス塩酸緩衝液　ｐｌ＋
７．４＋　　０．１５Ｍ　　　ＮａＣ１ 流速　　：　　１　ｍｌ／　ｍｉｎ 検出　　：４０５ｒ＋＋＋＋ 試料　　： ＡＴ−ＩＩＩ　　（Ｓｉｇｍａ社製。

ヒト　血しよう） トロンビン　（Ｓｉｇｍａ社製、 ヒト血しよう） 測定温度＝２５℃ 実施例２ 実施例１における固定化用基質Ｓ−２２３８の代わりに
、アルギニンパラニトロアニリド（Ａｒｚ−ｐＮＡ　）
を用い、　以下同様の操作によりＡｒｇ−ｐＮＡ固定化
ビーズを得た。　得られたＡｒに−ｐＮＡ固定化ビーズ
は、乾燥ビーズ１ｇあたりＡｒｇ−ｐＮＡを約１０　ｐ
　ｍｏｌｅ担持させていることが確かめられた。　Ａｒ
ｇ−ｐＮＡ固定化ビーズを、実施例１と同様にしてカラ
ムに充填し、ポストカラムと共に高速液体クロマトグラ
フ装置に組み込んだ。

一定量のａ　２Ｍ　（１２ｘ　１０−２ｎ１０−２ｎを
含む緩衝液（５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液ｐＨ８，４）　
０．８ｍｌに、０．３．９．１２．１４．１６ｘｌＯ−
２ｎｍｏｌｅのトリプシンを含む上記緩衝液０．２　ｍ
ｌをそれぞれ用意し、上記α２Ｍ溶液にそれぞれ加えた
。　室温で１分間放置して得られた試料のうち　０．５
　ｍｌを本装置に注入し遊離するｐＮＡピークを検出し
た。　また、全くα２Ｍを含まない上記緩衝液０．８　
ｍｌに　トリプシンを加え同様の操作を行ってブランク
とした。

本装置により各試料におけるトリプシン活性値を検出し
た結果を図２に示した。　α２Ｍ共存下及び非共存下に
おけるトリプシン活性値を比較することにより１本試料
中に存在するα２Ｍは、α２Ｍ＝トリプシン＝３＝　１
の割合でトリプシンを結合したということが判った。

なお、クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液　：５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液　ｐｉ　８．４流
速　　：　ｌ　ｍｌ／　ｍｉｎ 検出　　：　４０５ｎｍ 試料　　：　トリプシン　（Ｓｉｇｍａ社製、ウシ膵臓
） ａ　２Ｍ　（Ｓｉｇｍａ社製、　ヒト）測定温度：２５
℃ ［発明の効果］ 本発明による酵素活性測定方法は、前記従来の酵素活性
測定方法の欠点を解決した簡便迅速で精度の高い方法で
あり、今後、酵素の分離分析及び精製に関わる様々な分
野において有用な手段を提供するものであるが、その中
でも特に酵素阻害剤の定量や、酵素と阻害剤の結合比率
などといった、活性測定対象酵素と他の物質との相互作
用等に関する知見を簡便に得るために有用である。

【図面の簡単な説明】

図１は１本発明による酵素活性測定装置を用いてトロン
ビンとＡＴ−ＩＩＩの結合比率を求めたものである。図
中横軸は本装置に注入したトロンビンの活性（ＮＩＨｕ
ｎｉｔｓ　）を、縦軸は検出したｐＮＡＮ−ビー積を示
す、また、Ａ及びＢはそれぞれＡＴ−■非共有下、共存
下て測定を行ったことを示す。 図２は、本発明による酵素活性測定装置を用いてα２Ｍ
とトリプシンの結合比率を求めたものである。図中横軸
は本装置に注入したトリプシン濃度（ｘ　１０−”ｎｍ
ｏｌｅ　）を、縦軸は検出したｐＮＡＮ−ビー積を示す
。また、Ａ及びＢはそれぞれα２Ｍ非共存下、共存下で
測定を行ったことを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 　阻害剤が共存する活性測定対象酵素を、酵素によつて
   認識される基質を水に不溶性の支持体に固定化してなる
   酵素活性測定用充填剤を中空管に充填せしめてなるカラ
   ムに導入し、得られる基質分解物を定量することにより
   、活性測定対象酵素の残存活性または阻害剤を定量する
   ことを特徴とする、阻害剤の共存下における酵素活性測
   定方法。