JPH01296997A - 酵素活性測定用充填剤、それを充填したカラムおよびそれを用いる酵素活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素活性測定用充填剤、それを充填した酵素
活性Ｍ１定用カラムおよびそれを用いる酵素活性のＡｌ
ｌｌｌ法に関する。

〔従来の技術〕

酵素は、生細胞により合成されるタンパク質であり、そ
の生体反応に対する触媒作用が生命の維持に重要な役割
を持つことが知られている。自然界には、動、植物また
は微生物起源の数百方柱にのぼる酵素が存在しているが
、その中で単離された約２，０００種のうちのあるもの
は、工業用酵素として食品や洗剤関係にまた医薬用酵素
として酵素製剤や分析、臨床検査用に、さらに近年は遺
伝子工学用にと幅広く利用されている。酵素の活性を測
定することは、即ち酵素の触媒能を測ることであり、酵
素の機能を示す基本的な指標を得ることに他ならない。

従来より酵素活性の測定は、基質の減少量または生成物
の増加量を分析することで行われてきたが、その方法と
しては例えば酵素の種類により反応後の基質の減少量を
吸光光度計を用いて測定する方法、基質または生成物を
化学試薬で発色させて測定する方法、生成物をさらに石
色性の物質に転換して測定する方法等がしばしば用いら
れている。その他店質を放射性の元素で標識して検出す
る方法等いろいろあるが、総じて言えることは？＃Ｊ定
する酵素の量が多く試薬が高価となること、使用する試
薬の種類が多いこと、測定に長時間を要すること、測定
技術に熟練を要すること、不純物の影響を受は易く正確
な値が得にくいこと、等々の欠点を有することであった
。これらの欠点に対応した工夫の一つとして、液体クロ
マトグラフィーと組み合せることにより、酵素のカラム
による分離精製を行い、カラム溶出後、基質溶液と接触
させて基質の減少量を測定することがなされた〔エッチ
、ニー、チエイス：ジャーナル争オブ・ケミカルテクノ
ロジー・アンド・バイオテクノロジー、３６巻、３５１
頁、　１９８８年（Ｈ，Ａ、　Ｃｈａｓｅ　：　Ｊ、　
Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｅｈ、　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌ。

３６、３５１　（１９８６））および伊藤尚史ら：ジャ
ーナルφオブψりロマトグラフィー、４００巻、１６３
頁。

１９８７年（Ｎ、　Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ　；　Ｊ、　Ｃ
ｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒ、　４００゜１６３　　（１９Ｂ
？）））。しかし、この方法も高価な試薬を連続して流
し続ける必要があるこ゛とおよびそのためにポンプなど
新たな装置が必要となる等の点で必ずしも満足すべきも
のではない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、前記従来の酵素活性ｎ１定方法の欠点
を克服して、簡便、迅速でしかも精度の高い酵素活性の
測定が可能な、酵素活性測定用充填剤、それを充填した
カラムおよびそれを用いる酵素活性の測定方法を提供す
ることにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明によって上記目的を達成し得る酵素活性測定用充
填剤、それを充填したカラムおよびそれを用いる酵素活
性の測定方法が提供される。

即ち、本発明は、酵素によって認識される基質を水に不
溶性の支持体に固定化してなる酵素活性ＩｔＩｌｊ定用
充填剤に関する。

また、本発明は、酵素によって認識される基質を水に不
溶性の支持体に固定化してなる充填剤を中空管に充填せ
しめてなることを特徴とする酵素活性測定用カラムに関
する。

さらに、本発明は、活性測定対象酵素を、酵素によって
認識される基質を水に不溶性の支持体に固定化してなる
充填剤を中空管に充填せしめてなるカラムに導入し、得
られる基質分解物を定量することを特徴とする酵素活性
測定方法に関する。

以ド、本発明の酵素活性測定用充填剤、それを充填した
カラムおよびそれを用いる酵素活性の測定方法について
説明する。

本発明の酵素活性測定用充填剤は、酵素によって認識さ
れる基質を水に不溶性の支持体に固定化させることによ
って調製される。

用いられる水に不溶性の支持体としては、ポーラスまた
はノンポーラスのいずれであってもよく、従来しばしば
用いられてきたセルロース、アガロース、デキストラン
等の多糖体およびポリアクリルアミドのような所謂ソフ
トビーズ；シリカゲル；スチレン系重合体、ビニルアル
コール系重合体およびメタクリレート系重合体などのよ
うな合成高分子ビーズなどがあげられるが、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）として用いるために
はシリカゲルおよび合成高分子ビーズのような硬質ビー
ズが望ましい。粒径は特に制限はないが３〜１００　ｍ
の範囲が望ましい。

支持体に酵素によって認識される基質を結合させるに際
しては、まず上記支持体が有する結合基導入基、例えば
水酸基に基質が共有結合可能な官能基を有する結合基を
結合させることが必要である。

官能基としてはエポキシ基、アミノ基、ヒドラジノ話、
カルボキシル基、ホルミル基等が例示される。これらの
官能基ををする結合基の支持体への導入は、公知の方法
で適当な溶媒の存在下で容易に行うことができる。例え
ばエポキシ基を有する結合基としてはエビクロロヒドリ
ンのようなエピハロヒドリン類、■、４−ブタンジオー
ルジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテル
類、１．７−オクタジニンジエボキシドのようなジエポ
キシド類などがあげられるが、これらは支持体上の水酸
基とアルカリ条件下ですみやかに反応しエポキシ変性支
持体を与える。また、得られたエポキン変性支持体は、
アンモニア、ヒドラジン、あるいは１．３−プロパンジ
アミンのようなジアミノアルカン類などと反応させるこ
とによりアミノ基を存するアミノ変性支持体を、また４
−アミノ酪酸のようなアミノカルボン酸類と反応させる
ことでカルボキシル変性支持体を、また、エポキシ基を
加水分解し過ヨウ素酸酸化を行うことでホルミル変性支
持体を与える。また、アミノ変性支持体は無水コハク酸
のような酸無水物と反応させることによりカルボキシル
変性支持体とすることもできる。これらの官能基を有す
る支持体に酵素によって認識される基質を結合させるに
際しては、結合基が有する官能基に応じて必要であれば
、適宜触媒や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行な
うことができる。例えば触媒としては、塩酸や炭酸ナト
リウムまたは炭酸水素ナトリウムなどの酸、アルカリが
主として官能基がエポキシ基の場合に用いられ、また、
例えば反応試薬としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
、ジシクロへキシルカルボジイミドまたは１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの
ような縮合剤が官能基がカルボキシル基の場合に、また
水素化シアノホウ素ナトリウムのような還元剤が官能基
がホルミル基の場合に用いられる等々を例示することが
できる。また溶媒としては通常水が用いられるが必要に
応じてリン酸や酢酸緩衝液として用いることもでき、ま
た塩化ナトリウムなどの無機塩類を添加して用いること
も可能である。

なお、結合基の長さとしては、特に制限はないが、原子
数６〜３０が望ましい。

官能基を有する支持体に固定化させる酵素によって認識
される基質は、対応する活性測定対象酵素との接触によ
り基質分解物を生じるものであればよく、特に制限され
ない。基質の代表例としては、グルコース、コレステロ
ール、コリン、尿酸、ベンジルアミン、ヒスタミンなど
のアミン類、キサンチン、アセチルコリン、グルタチオ
ン、チミジン−５′−リン酸、コンドロイチン硫酸、（
デオキシ）リボ核酸、コレステロールエステル、ビスパ
ラニトロフェニルリン酸などのリン酸モノエステル、ア
ルギニン、リジン、チロシンなどのアミノ酸、フェニル
アラニルセリルアルギンのようにＣ末端に特異的なアミ
ノ酸を有するオリゴペプチドのＣ末端にパラニトロフェ
ニル基などの標識化合物が結合したもの、グリシルグル
タミン酸のようなオリゴペプチドがエステル結合したも
の、ベンゾイルアルギニンエチルエステルなどのような
合成基質、α−（β−）グルコース、α−（β−）ガラ
クトース、α−（β−）マンノース、β−フルクトース
、α、α−トレハロース、β−グルクロン酸、α−Ｌ−
フコースがグルコースなどの他の糖とあるいはメチルウ
ンベリフェロンなどのような標識化合物とグリコシド結
合しているもの、セルロース、キチン、デキストラン、
デンプン、ヘパリン、フルクトース−１，６−ビスリン
酸などがあげられる。

上記のようにして得られた酵素によって認識される基質
を水に不溶性の支持体に固定化してなる酵素活性測定用
充填剤は、通常は常法にしたがって中空管に充填され、
酵素活性の測定用カラムとして使用される。

酵素活性測定用充填剤を充填する中空管の祠質は、−船
釣にはガラス製、ステンレス製、テフロン製、ステンレ
スの内壁をテフロンで被覆したもの等が用いられる。中
空管のサイズは、目的に応じて適宜法めればよく、特に
制限はない。

酵素活性測定用充填剤の中空管への充填方法は、常方に
したがって行なわれ、特に制限はない。また、充填率は
適宜選択すればよい。

本発明によって得られた酵素活性ＤＩ定定力カラム用い
て酵素活性を測定するには、活性測定対象酵素をカラム
に導入し、得られる基質分解物を定量することによって
行なわれる。すなわち、酵素活性測定用カラムに、活性
測定対象酵素を注入すると、活性測定対象酵素が該カラ
ムを通過するに伴い、対象酵素の活性に対応した量の基
質分解物を生成し、生成した基質分解物を紫外吸収、螢
光吸収、屈折率などの検出器または電気化学検出器等を
用いて検出することができる。測定温度は、特に制限は
ないが、通常は４〜６０℃の範囲が望ましい。活性Ａｌ
ｌ定対象酵素は、特に制限はなく、すべての酵素が適用
できる。活性測定対象酵素は、精製した単一標品の他、
粗精製標品でもよく、また、生体試料中に存在している
一成分であってもよい。特に試料中に他の夾雑タンパク
質等の他物質が存在しているような場合には、ゲル濾過
、イオン交換、疎水クロマトグラフィーなどの分離カラ
ムと組み合わせ、酵素活性１Ｉｐ１定用カラムをポスト
カラムとして併用することができる。こうしたポストカ
ラム法では、酵素活性測定と同時に分離ゲルによって分
離されたピークのどの部分に活性が存在しているかをた
だちに知ることができる。

高速液体クロマトグラフィー装置に組み込むことにより
少量の試料で感度よく、短時間で容易に酵素活性を測定
することができ、また他の様々の分離カラムとの組み合
わせも有利となる。

本発明に係る酵素および支持体に固定化された基質は、
両者の接触により基質分解物を生じるものであればよい
。例えば活性測定対象酵素としてオキシダーゼ、ヒドロ
ラーゼ、リアーゼなどを適用した場合、これらの活性測
定対象酵素と基質の好ましい組み合わせおよびそれらを
組み合わせた系から生じる基質分解物の検出方法につい
て例示する。

まず、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、コリンオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アミ
ンオキシダーゼ、およびキサンチンオキシダーゼなどの
ようなオキシダーゼに対応する基質としては、それぞれ
グルコース、コレステロール、コリン、尿酸、ベンジル
アミン、ヒスタミンなどのアミン類、およびキサンチン
等をあげることができる。これらの系で生じる基質分解
物は、主として過酸化水素であり、例えば電気化学的に
容易に検出測定することができる。

また、ヒドロラーゼとしては、エステラーゼ、プロテア
ーゼ、グリコシダーゼなどがある。エステラーゼについ
ては、特に種類は問わないが、アセチルコリンエステラ
ーゼ、グルタチオンチオールエステルヒドラーゼ、ホス
ホジェステラーゼＩ５コンドロイチンスルファターゼ、
（デオキシ）リボヌクレアーゼＩ、Ｈのようなヌクレア
ーゼ、コレステロールエステラーゼ、アルカリホスファ
ターゼ等においては、それぞれに対応する基質としてア
セチルコリン、グルタチオン、チミジン−５′−リン酸
、コンドロイチン硫酸、（デオキシ）リボ核酸、コレス
テロールエステル、ビスパラニトロフェニルリン酸など
のリン酸モノエステルをあげることができる。これらの
系で生じる基質分解物は、コリングルタチオン、チミジ
ン、コンドロイチン、ヌクレオチド、コレステロール、
バラニトロフェノールなどであり、これらはいずれも紫
外吸収、螢光吸収あるいは屈折率等の変化により検出測
定することができる。

トリプシン、プラスシン、ウロキナーゼ、ブロメライン
、プロナーゼ、キモパパイン、ペプシン、キモトリプシ
ンなどのプロテアーゼにおいては、基質としてはアルギ
ニン、リジン、チロシンなどのような、対象酵素が特異
性をもつアミノ酸またはフェニルアラニルセリルアルキ
ジンのようにＣ末端に特異的なアミノ酸を有するオリゴ
ペプチドのＣ末端にパラニトロフェニル基などの標識化
合物が結合したもの（以下、（Ａ）という）、あるいは
グリシルグルタミン酸のようなオリゴペプチドがエステ
ル結合したもの（以下、（Ｂ）という）、あるいはベン
ゾイルアルギニンエチルエステルなどのような合成基質
（以下、（Ｃ）という）があげられる。これらプロテア
ーゼの場合、上記（Ａ）および（Ｂ）の系では、特異的
なアミノ酸に結合していた標識化合物またはオリゴペプ
チドが、また（Ｃ）の系では合成基質の分解生成物が生
成してくる。したがって、これら生成物の検出は生成化
合物の性質に応じて適宜選択することができる。生成物
が標識化合物の場合、バラニトロフェノール、バラニト
ロアニリンのような紫外吸収をもつ化合物は紫外分光光
度計により検出１１ＩＪ定する。また、４−アミノメチ
ルクマリンのような螢光吸収をもつ化合物の場合は、螢
光光度計により検出測定する。また、オリゴペプチドお
よびベンゾイル基またはダンシル基等を有する合成基質
分解生成物が生成してくる場合には、紫外分光光度計あ
るいは屈ｊＪｉ計を用いて検出測定することができる。

グリコシダーゼにおいては、α−（β−）グルコシダー
ゼ、α・　（β−）ガラクトシダーゼ、ａ−（β−）マ
ンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼ、α、α−トレハ
ラーゼ、β−グルクロニダーゼ、α−（Ｌ〜）フコシダ
ーゼなどがあり、それぞれ基質としてはα−（β−）グ
ルコース、α−（β−）ガラクトース、α−（β−）マ
ンノース、β−フルクトース、α、α−トレハロース、
β゛グルクロン酸α−Ｌ−フコースがグルコースなどの
他の糖とあるいはメチルウンベリフェロンなどのような
標識化合物とグリコシド結合しているものをあげること
ができる。また、セルラーゼ、キチナーゼ、デキストラ
ナーゼ、ジアスターゼ、ヘバリナーゼといった多糖に特
異性をもつグリコシダーゼに対する基質としては、セル
ロース、キチン、デキストラン、デンプン、ヘパリンを
あげることができる。

これらグリコシダーゼにおいて、分解生成物が糖である
場合には屈折計により、また紫外吸収あるいは螢光吸収
のある標識化合物である場合には、紫外分光光度計、螢
光光度計により検出測定することができる。

さらに、リアーゼにおいては、例えばフルクトースビス
リン酸アルドラーゼなどのアルドラーゼがあげられる。

基質としては、フルクトース−１、Ｂ−ビスリン酸など
を用い分解生成物であるジヒドロキシアセトンリン酸ま
たはグリセルアルデヒド−３−リン酸などを紫外分光光
度計あるいは示差屈折ｉｔを用いて検出測定することが
できる。

〔実　施　例〕

以下、本発明につい′ζ代表的な例を示しさらに具体的
に説明する。なお、これらは説明のための単なる例示で
あ−）で本発明はこれらに何ら制限されるものではない
ことはいうまでもない。

実施例　１ グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタ
クリレートから得られた水酸基変性ビーズに、ＩＭ　　
ＮａＯＨ中で１．４−ブタンジオールジグリシジルエー
テルを反応させエポキシ括を導入した後、さらにγ−ア
ミノ■■■■■■■Ｉブチリックアシドでカルボキシル
基を導入した。得られたビーズを無水ジオキサンで充分
洗浄し、カルボキシル基変性ビーズとした。カルボキシ
ル基変性ビーズに無水ジオキサン中でＮ−ヒドロキンコ
ハク酸イミドおよびシンクロヘキシルカルボジイミドを
加え、室温で１．５時間振盪反応した後ゲルを７戸数し
、無水ジオキサン、メタノールで素早く洗浄した。この
ゲル１ｇをアルギニンバラニトロアニリド（Ａ　ｒｇ−
ｐＮ　Ａ　）　３０＋ｎｇの０．０ＩＮ炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，４）の水３ｍｌに加え、室温で２時間振Ｒ反応後
、４℃で一晩放置した。次いでゲルを消取し、１Ｍ塩化
ナトリウム水溶液および水で洗浄した。

こうして得られたＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化ゲルは乾燥
ゲル１ｇあたりＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａを約１０μｍｏｌｅ
担持させていることが確かめられた。

得られたＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化ビーズを、内径４，
６關、長さ１．ｏｃｍのステンレス製カラムに充填し、
Ａ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化カラムとした。また、カルボ
キシル変性ビーズを内径４．Ｉ３＋ｏ１ｍｓ長さ３．５
ｃｍのステンレス製カラムに充填し、ボストカラムとし
た。

高速液体クロマトグラフ装置にＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定
化カラムおよびボストカラムを組み込み（図１）、トリ
プシンの活性Ｍ１定を行い本装置における４ｐ）定の検
出限界、直線性、および流速依存性について検討した。

（１）本装置におりるトリプシン活性の検出限界および
測定値の直線性 本装置に注入したトリプシン活性値の上昇に伴い、検出
される測定値は直線的に上昇し、よい相関を示した（図
２）。また、検出限界は０．０５ｎｋａｔであった。な
お、クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液　：　　５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，４
＋０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃ４）　　（溶離液Ａ）流速
：　１ｍｌ／ｌｌ１ｉｎ 検出：４０５０ｍ 試　料　：　トリプシン（ＳｉＨａ社製）　ＢＡＥＩＥ
（ペンゾイルアルギニンエチルエ ステル）　ｎｋａｔ／　３ｕＱ溶離液Ａ＋０．５ｍＭ　
Ｃａ　Ｃｊ？　ま ただし、トリプシンの活性は ＢＡＥＥに対する加水分解活性により 示し、Ｉ　ＢＡＥＥｎｋａｔは１秒間に１　ｎ１１ｏ１
ｃのＢＡＥＥを分解する酵素活性の量とした。

測定温度　：２５℃ （２）　７ｉｌｌＪ定値の流速依存性 一定量のトリプシンを本装置に注入し、流速に対する測
定値の依存性を図３に示した。

クロマトの条件は、流速を除いて（１）に準する。

その結果、図３に示した通り、流速の増加に反比例して
値が減少する傾向がみられた。

（３）　１ｌ）Ｊ定値の温度依存性 一定量のトリプシンを本装置に注入し、温度に対する測
定値の依存性を図４に示した。クロマトの条件は、温度
を除いＣ（１）に準する。その結果、図４に示した通り
、カラム温度４０℃前後において測定値が最高に達する
ことがわかった。

（４）測定値の塩濃度依存性 一定量のトリプシンを本装置に注入し、塩濃度に対する
４１１ｊ定値の依存性を図５に示した。クロマトの条件
は、塩濃度を除いて（１）に準する。

その結果、図５に示した通り、塩濃度の上昇に伴い、ａ
ｌｌ定値が減少する傾向がみられた。

実施例　２ 実施例１で得られたＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化ビーズを
、内径４．６ｎ＋ｍ、長さ１．Ｏｃｎ＋のステンレス製
カラムに充填し、Ａ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化カラムとし
た。また内径８．０市、長さ３０ｃｍの市販ゲル済過分
離カラム（ＷＳ−８０３，昭和電工■社製）を２本連結
し分離カラムとした。高速液体クロマトグラフ装置に、
分離カラムおよびＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化カラムを組
み込み（図６）、４種類のタンパク質（チログロブリン
、トランスフェリン、オボアルブミン、トリプシン）の
混合物を本装置に注入した。タンパク質の分離パターン
は２８Ｏｎｍ　ｓまたトリプシン活性は４０５ｎｎの吸
収により検出した。その結果、図７に示した通り、本装
置により、数種のタンパクの分離（図７−１）とトリプ
シン活性の検出（図７−２）が同時に行えることがわか
った。

なお、クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液　：　　５ｈＭ　　トリス−塩酸緩衝液ｐＨ７，
４＋０．１５Ｍ　　　Ｎ　ａ　ＣΩ流速：　１ｍｌ／ｗ
ｉｎ 検出：　４０５ｎｍ 試　料　：　チログロブリン （ウシ、　　ｔｙｐｅｌ、　Ｓｉｇｍａ社製）トランス
フェリン （ヒト・　Ｓｉｇｍａ社製） オボアルブミン（Ｓｉｇｏ＋ａ月製） トリプシン（ウシ膵臓、ｔｙｐｅｉｌＩ　）Ｍｊ定温度
＝２５℃ 実施例　３ 実施例１におけるアルギニンパラニトロアニリドの代り
にＤ−フェニルピペコリルアルギニンパラニトロアニリ
ドを用い、またトリプシンの代りにトロンビンを用いて
、その他は実施例１に準じて本装置におけるトロンビン
活性測定値のｃａ線性を検討したところ、本装置に注入
したトロンビン活性値の上昇に伴い、検出される測定値
は直線的に上昇し、よい相関を示した（図８）。なお、
クロマト条件は以下に示した通りである。

溶離液　：５０ＩＩＩＭトリスー塩酸緩衝液ｐＨ７，４
＋０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣΩ流速：　１ｍｌ／ｍｔｎ 検出：　４０５ｎｍ 試　料　：　トロンビン（Ｓｉｇｍａ社製、ヒト血漿）
２６０　ＮＩＨｕｎｉｔ／　５μｆｆ　５０ｍＭクエン
酸ナトリウム（ｐＨ８，５）＋０．１５ＭＮａＣΩ 測定温度　＝２５℃ 〔発明の効果〕 本発明による酵素活性測定方法は、前記従来の酵素活性
測定方法の欠点を克服した簡便、迅速で精度の高い方法
であり、今後、酵素の分離、精製に関わる様々な分野に
おいて何州な手段を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明による酵素活性測定装置の模式図である
。ただし、図中ノヨポンプ、■はトリプシン、■は恒温
槽、■はＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化ビーズ、■は検出器
を示す。 図２は、注入したトリプシンの活性値と得られたΔｐ＋
定値の相関を示したものである。図中、縦軸は分解生成
物であるｐＮＡ　（パラニトロアニリン）のピーク面積
（ＸＩＯ’ｐＮＡμｍｏｌｅ）を、横軸は注入したトリ
プシンの活性（ＢＡＥＥｎｋａｔ／３μＱ）を示す。 図３は、流速と測定値との関係を示したものである。図
中、縦軸はｐＮＡのピーク面積（Ｘ　１０’　−ｐ　Ｎ
　−Ａ　μｍｏｉｅ）　、横軸は流速（ｍｌ　／ｆｆ１
ｉ口）を示す。 図４は、温度と測定値との関係を示したものである。 図中、縦軸はｐＮＡのピーク面積（Ｘ　１Ｏ−４−ｐＮ
Ａμ口ｏｌｅ）　、横軸は温度（”Ｃ）を示す。 図５は、溶ｉ４液に含まれる塩化ナトリウム濃度と４ｐ
１定値との関係を示したものである。図中、縦軸はｐＮ
Ａのピーク面積（Ｘ　１Ｏ−４−ｐ　Ｎ　Ａ　ｔｔ　ｍ
ｏｌｅ）、横軸はモル濃度（Ｍ）を示す。 図６は、分離カラムを基質カラムと連結させて用いた場
合の酵素活性測定装置の模式図である。 ただし、図中、■はポンプ、■はトリプシン、■は恒温
槽、■は分離カラム、■はＡ　ｒｇ−ｐＮ　Ａ固定化カ
ラム、■は検出器を示す。 図７は、分離カラムを基質カラムと連結させて用いた場
合のクロマトグラムである。図７−１はタンパク質の分
離パターン（２８０ｎｍの吸収による）を示し、また図
７−２はトリプシンの活性（４０５ｎｉの吸収によるｐ
ＮＡのピーク）を示す。ただし、図中、■はチログロブ
リン、■はトランスフェリン、■はオボアルブミン、■
はトリプシンのピークを示す。 図８は、注入したトロンビンの活性値と得られた測定値
の相関を示したものである。図中、縦軸はｐＮＡのピー
ク面積を示し、横軸は注入したトロンビンの活性（Ｎ　
Ｉ　Ｈｕｎｉｔ　）を示す。 図２ 図３ ０　　　０．５　　　１．０　　　１．５図４ ０　　　　　　　　１０　　　　　　　２０　　　　　
　　３０　　　　　　　４０５０　　　″′Ｃ図５ ０　　　０．２５　　　０．５　　　０．７５　　　１
．０図７ 図８ Ｑ　　　　　Ｏ，１０，２ 手続辛市正書　（自発） 平成元年２月８　日 １．１■件の表示 昭和６３年特許願第２５０３４０号 ２、発明の名称 酵素活性ΔＩＩＪ定用充積用充填剤を充填したカラムお
よびそれを用いる酵素活性測定方法３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 住　所　　　東京都港区芝大門二丁目１０番］２号名称
　　（２００）昭和電工株式会社 代表者　　村　１）　　− ４、代　理　人　　（郵便番号１０５）居　所　　　東
京都港区芝大門二丁目１０番１２号昭和電工株式会社内 電　話　　　東京　４３２−５１１１番（大代表）氏　
名　　　（９４１７）弁理士　寺　１）　　實　　圃／
≦ｉ７≧＼　　　　　　　Ｌ ５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄および「図面の簡単
な説明」の欄 ６、補正の内容 （１）　　明細書第９頁第２行の「フェニルアラニルセ
リルアルギン」を「フェニルアラニルセリルアルギニン
」と補正する。 （２）同第１３頁第１９の「富力にしたがって行なわれ
、」を「常法にしたがって行なわれ、」と補正する。 （３）同第１３頁第１９行の「フェニルアラニルセリル
アルキジン」を「フェニルアラニルセリルアルギニン」
と補正する。 （４）同第１７頁第４行〜第５行の「カルボキシル基変
性ビーズ」をｒカルボキシル変性ビーズ」と補正する。 （５）同第１７頁第５行〜第６行の「カルボキシル基勇
度性ビーズ」を「カルｆキ／ル変性ヒーズ」と補正する
。 （６）第２３頁第４Ｏ行のｒ’２１３０Ｊを削除する。 （７）同第２３頁第４行の「ビーズ」をｒカラムとポス
トカラム」と補正する。 （８）同第２４頁第６行の「トリプシン」を「試料」と
補正する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素によって認識される基質を水に不溶性の支持
   体に固定化してなる酵素活性測定用充填剤。
2. （２）酵素によって認識される基質を水に不溶性の支持
   体に固定化してなる充填剤を中空管に充填せしめてなる
   ことを特徴とする酵素活性測定用カラム。
3. （３）活性測定対象酵素を、酵素によって認識される基
   質を水に不溶性の支持体に固定化してなる充填剤を中空
   管に充填せしめてなるカラムに導入し、得られる基質分
   解物を定量することを特徴とする酵素活性測定方法。