JPH04330299A - 酵素活性測定用膜およびそれを用いる酵素活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、基質を固定化した酵素
活性測定用膜およびそれを用いる酵素活性測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】酵素は、生細胞により合成されるタンパ
ク質であり、その生体反応に対する触媒作用が生命の維
持に重要な役割を持つことが知られている。自然界には
、動植物または微生物起源の数百万種にのぼる酵素が存
在しているが、その中で単離された約　２，０００種の
酵素のうちのあるものは工業用酵素として食品や洗剤関
係に、また医療用酵素として酵素製剤や分析、臨床検査
用に、さらに近年は遺伝子工学用にと幅広く利用されて
いる。

【０００３】従来より酵素活性の測定は、基質の減少量
または生成物の増加量を分析することで行われてきたが
、その具体的方法としては反応後の基質の減少量を吸光
光度計を用いて吸光度で測定する方法、基質または生成
物を化学試薬で発色させて測定する方法、生成物をさら
に着色性の物質に転換して測定する方法等がある。これ
らの方法は酵素の種類により適宜用いられるが、総じて
言えることは測定に要する基質の量が多く試薬が高価と
なること、使用する試薬の種類が多いこと、測定に長時
間を要すること、測定技術に熟練を要すること、不純物
の影響を受け易く正確な値が得にくいこと等々の欠点を
有することである。

【０００４】これらの欠点に対応した工夫の一つとして
、液体クロマトグラフィーと組み合わせることにより、
酵素のカラムによる分離精製を行い、カラム溶出後、基
質溶液と接触させて基質の減少量を測定することがなさ
れたが、この方法も高価な基質溶液を連続して流し続け
る必要があるという経済的な問題点を有している。

【０００５】ここでさらに上記問題点を解決する、高感
度でしかも基質節約型の簡便な酵素活性測定方法として
、大量の基質をゲルに固定化した基質固定化ゲルを用い
る方法を本願出願人が特開平１−２９６９９７号公報で
提案している。

【０００６】

【　発明が解決しようとする課題　】しかしながら、上
記特開平１−２９６９９７号公報に記載してある発明は
ゲルの充填状態による性能の変動のチェックが必要であ
り、またゲル特有の形態から使用方法が限定されるので
改善する余地が残されていた。本発明の目的は、前記従
来の酵素活性測定方法の問題点を克服して、簡便、迅速
に酵素活性を測定する方法、およびその方法に用いる成
形可能で性能に変動の少ない基質固定化膜を提供するこ
とにある。

【０００７】

【　課題を解決するための手段　】本発明によって上記
目的を達成し得る酵素活性測定用膜およびそれを用いた
酵素活性の測定方法が提供される。即ち、本発明は、酵
素によって認識される基質を多孔質膜に固定化してなる
基質固定化膜に関する。また、本発明は、活性測定対象
酵素を酵素によって認識される基質を多孔質膜に固定化
してなる基質固定化膜に作用させ、得られる基質分解物
を検出することを特徴とする酵素活性測定方法に関する
。

【０００８】以下、本発明に於ける基質固定化膜、およ
びそれを用いる酵素活性の測定方法について説明する。

【０００９】本発明の基質固定化膜は、酵素によって認
識される基質を多孔質膜に固定化することによって調製
される。用いられる多孔質膜としては、基質を結合させ
るに必要な結合基導入基を有すること以外に特に制限は
ないが、一般的によく用いられているニトロセルロース
膜の他、多孔質膜を形成する代表的な適当な合成ポリマ
ーである、ポリオレフィン、ポリスチレンまたは置換ポ
リスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化
ビニリデンなどを含むフッ素化ポリマー、ポリスルホン
、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニト
リル、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレ
ート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、およびこ
れらの共重合体などからなる膜等を例示することができ
る。

【００１０】多孔質膜の大きさ、厚さなどの形状および
孔径は特に制限はないが、孔径については通常、約０．
００１〜１００μｍの、好ましくは約０．１〜５０μｍ
の大きさの平均孔径を有するものが望ましい。

【００１１】酵素によって認識される基質を結合させる
に際しては、まず上記多孔質膜が有する結合基導入基、
例えば水酸基に基質が共有結合可能な官能基を有する結
合基を結合させることが必要である。

【００１２】官能基としてはエポキシ基、ハロゲン原子
、アミノ基、ヒドラジノ基、カルボキシル基、ホルミル
基等が例示される。

【００１３】これらの官能基を有する結合基の膜への導
入は、公知の方法で適当な溶媒の存在下で容易に行うこ
とができる。例えばエポキシ基を有する結合基としては
エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン類、１，
４−ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジグ
リシジルエーテル類、１，７−オクタジエンジエポキシ
ドのような、ジエポキシド類等が挙げられるが、これら
は膜上の水酸基とアルカリ条件下で速やかに反応しエポ
キシ変性膜を与える。

【００１４】また、得られたエポキシ変性膜は、アンモ
ニア、ヒドラジン、あるいはプロパンジアミンのような
ジアミノアルカン類、ポリアスパラギン、ポリグルタミ
ンのような塩基性ポリアミノ酸、ポリビニルアミン、ポ
リエチレンイミンのようなポリアミン類等と反応させる
ことによりアミノ基を有するアミノ変性膜を、またアミ
ノ酪酸のようなアミノカルボン酸類、あるいはポリグル
タミン酸のような酸性ポリアミノ酸などと反応させるこ
とでカルボキシル変性膜を、また、エポキシ基を加水分
解し、過ヨウ素酸酸化を行うことでホルミル変性膜を与
える。

【００１５】また、アミノ変性膜は無水コハク酸のよう
な酸無水物、あるいは無水マレイン酸とそれと重合し得
るビニルモノマーから成る無水マレイン酸共重合体と反
応させることによりカルボキシル変性膜とすることもで
きる。本共重合体にエチレンジアミンなどのジアミン類
を反応させることで上記のアミノ変性膜を得ることも出
来る。なお、結合基の長さとしては、特に制限はないが
、原子数３〜５０００　が望ましい。

【００１６】これらの官能基を有する膜に酵素によって
認識される基質を結合させるに際しては、結合基が有す
る官能基に応じて必要であれば、適宜触媒や反応試薬等
を用いて適当な溶媒下で行うことができる。

【００１７】例えば触媒としては、塩酸や炭酸ナトリウ
ムまたは炭酸水素ナトリウムなどの酸、アルカリが主と
して官能基がエポキシ基の場合に用いられ、また、例え
ば反応試薬としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはカ
ルボニルジイミダゾールのような縮合剤が官能基がカル
ボキシル基またはアミノ基の場合に、また水素化シアノ
ホウ素ナトリウムのような還元剤が官能基がホルミル基
の場合に用いられる等々を例示することができる。

【００１８】また溶媒としては通常水が用いられるが必
要に応じてリン酸や酢酸緩衝液として用いることもでき
、また塩化ナトリウムなどの無機塩類を添加して用いる
ことも可能である。また、ジオキサン、ジメチルホルム
アミドまたはジメチルスルホキシドのような有機溶媒を
用いることもできる。

【００１９】官能基を有する膜に固定化させる酵素によ
って認識される基質は、対応する活性測定対象酵素との
接触により基質分解物を生じるものであればよく、特に
制限されない。基質の代表例としては、糖、糖タンパク
質、糖脂質、脂質、核酸、リン酸エステル、アミノ酸、
オリゴペプチド、ポリペプチド、アミン類、などの他フ
ェニルアラニルセリルアルギニンパラニトロアニリドの
ように、オリゴペプチドのＣ末端にパラニトロアニリド
基などの標識化合物が結合したもの、またはベンゾイル
アルギニンエチルエステルなどのような合成基質、さら
に、糖がメチルウンベリフェロンなどのような標識化合
物とグリコシド結合しているものなど前記引用公開公報
記載の基質例も含めて挙げることができる。

【００２０】上記のようにして得られた酵素によって認
識される基質を多孔質膜に固定化してなる酵素活性測定
用膜は、測定の方法に応じて適宜成形加工をし、または
複数枚の膜を同時に用いることができる。測定の方法に
特に制限はないが、例えばフィルタホルダーに膜を固定
し液体クロマトグラフィー装置に組み込み分解生成物を
ピークとして検出する方法、または酵素溶液中に該膜を
適当な形状に成形して添加し、溶液中に生成遊離する分
解物を定量する方法を例示することが出来る。前者の方
法は、カラムにビーズを充填するような特殊な技術が不
用であり、用途に応じた膜を適宜選択し交換することが
非常に容易である。また、後者の方法は酵素活性を測定
するための基質溶液を調製する必要がなく、常に一定量
の基質を溶液に添加できるという利点を有する。さらに
、マイクロプレート底部が該膜から成るプレートを用い
ることによって、多数の試料中から目的とする酵素活性
を含む試料を選別測定することも可能である。

【００２１】本発明によって得られた酵素活性測定用膜
を用いて酵素活性を測定するには、活性測定対象酵素を
膜に作用させ、得られる基質分解物を定量することによ
って行われる。即ち、酵素活性測定対象酵素が該膜と接
するに伴い、対象酵素の活性に対応した量の基質分解物
が生成されるが、これを紫外可視吸収、蛍光、屈折率、
化学発光等の検出器または電気化学検出器等を備えた液
体クロマトグラフィー装置または吸光光度計等を用いて
検出する他、可視の基質分解物に関しては、目視による
判定も可能である。測定温度は特に制限はないが、通常
は４〜６０℃の範囲が望ましい。活性測定対象酵素もま
た特に制限はなく、すべての酵素が適用できる。

【００２２】本発明に係る酵素および多孔質膜に固定化
された基質は、両者の接触により基質分解物を生じるも
のであればよい。例えば活性測定対象酵素としてオキシ
ドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、
リアーゼ等を適用した場合、これらの活性測定対象酵素
と基質の好ましい組み合わせおよびそれらを組み合わせ
た系から生じる基質分解物の検出方法が例示されるが、
その代表例としては、グルコースオキシダーゼ、コリン
オキシダーゼ、などのようなオキシダーゼに対応する基
質としては、それぞれグルコース、コリン等をあげるこ
とができる。これらの系で生じる基質分解物は、主とし
て過酸化水素であり、例えば電気化学的に容易に検出測
定することができる。

【００２３】また、ヒドロラーゼとしては、エステラー
ゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼなどがあるが、アセ
チルコリンエステラーゼ、　トリプシンまたはα−グル
コシダーゼ等に対応する基質としては、それぞれアセチ
ルコリン、アルギニンパラニトロアニリドまたはメチル
ウンベリフェリルグルコシド等を挙げることができ、こ
れらの系で生じる基質分解物はそれぞれコリン、パラニ
トロアニリンまたはメチルウンベリフェロンなどであり
これらは吸光スペクトルなどの検出で容易に検出するこ
とが出来る。その他前記引用公開公報にも多くの組合わ
せが記載されているがこれらを含めて例示することがで
きる。

【００２４】更に、本発明に於て同一基質固定化膜を用
いて測定可能な活性測定対象酵素類の活性比較を行うこ
とが可能である。このとき、酵素活性比較に用いる基質
固定化膜には特に制限はなく、基質分解産物を生じる全
ての基質固定化膜を用いることができる。例えば、アル
ギニンパラニトロアニリド（以下Ａｒｇ−ｐＮＡと記す
。）、　リジンパラニトロアニリド（以下Ｌｙｓ−ｐＮ
Ａと記す。）、あるいはこれらを含む合成基質であるイ
ソロイシルプロリルアルギニンパラニトロアニリド（以
下ＩＰＲ−ｐＮＡと記す。）またはバリルロイシルリジ
ルパラニトロアニリド（以下ＶＬＫ−ｐＮＡと記す。）
を　固定化基質として用いた場合、アルギニンまたはリ
ジンに対して特異的な作用を有する酵素は全て活性測定
対象酵素類として例示することができ、測定対象酵素類
の活性は各酵素活性に応じて生成する分解生成物である
パラニトロアニリンを検出することによって比較するこ
とができる。

【００２５】Ａｒｇ−ｐＮＡ　固定化膜による活性比較
対象酵素にはトロンビン、トリプシン、ＸＩａ　因子、
ＸＩＩａ因子、Ｘａ因子、カリクレイン、ウロキナーゼ
、などを挙げることができ、　　Ｌｙｓ−ｐＮＡ固定化
膜を用いた場合には、　プラスミンや、カリクレイン、
エンテロキナーゼなどの活性を比較することができる。 本比較法は、上記アルギニン、リジンに特異的な既知の
プロテアーゼにとどまらず、広範囲にわたる未知の、ま
たプロテアーゼ以外の様々な酵素に対して用い得ること
は言うまでもない。

【００２６】上述の活性測定対象酵素類は、精製した単
一標品の他、粗精製標品でもよく、また、生体試料中に
存在している一成分であってもよい。特に試料中にきょ
う雑タンパク質などの他物質が存在しているような場合
には、液体クロマトグラフィーに於いてゲルろ過、イオ
ン交換、疎水性クロマトグラフィーなどの分離カラムと
組合せ、酵素活性検出用膜をポストカラムリアクターと
して併用することもできる。こうしたポストカラムリア
クター法では、酵素活性検出と同時に、分離カラムによ
って分離されたピークのどの部分に活性が存在している
かを直ちに知ることができ、より少量の試料で感度よく
、短時間で容易に酵素活性を測定することができる。 さらに膜の成形性の良さから製品間のばらつきも少なく
、使用済みの膜は新たな膜と簡単に交換することが出来
るなどの利点も有している。

【００２７】

【実施例】以下に、本発明について代表的な例を示しさ
らに具体的に説明する。なお、これらは説明のための単
なる例示であって、本発明はこれらに何ら制限されるも
のでないことはいうまでもない。

【００２８】実施例１ 平均孔径が０．６５μｍのポリフッ化ビニリデン多孔質
膜の表面に活性基を有するアフィニティ膜（直径１３ｍ
ｍφ：ミリポア社製）１０枚にプロパンジアミン１．３
ｇを含む水５ｍｌを加え室温で２時間振とうさせた後、
２０ｍｌの水で洗浄しアミノ変性膜を得た。乾燥後、１
ｍｌのジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと記す。）を
加えてよく湿潤させ、さらに無水マレイン酸メチルビニ
ルエーテル共重合体（以下ＭＡＭＥＣと記す。：ＧＡＦ
社製）の２％ＤＭＦ溶液１０ｍｌを加え２５℃で２時間
振とうさせた。次いで膜をＤＭＦ３０ｍｌ、ジメチルス
ルホキシド（以下ＤＭＳＯと記す。）１０ｍｌで洗浄し
、ＭＡＭＥＣ化膜を得た。該ＭＡＭＥＣ化膜にＩＰＲ−
ｐＮＡ５０μｍｏｌを含むＤＭＳＯ３．０ｍｌを加え４
時間振とうさせ、ＤＭＳＯ３０ｍｌ、メタノール３０ｍ
ｌ、水１０ｍｌでよく洗浄し、次いで、１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．５）１５ｍｌを加え１時間振とうさせ
た。水洗して得られたＩＰＲ−ｐＮＡ固定化膜をトリプ
シン処理することにより、本ＩＰＲ−ｐＮＡ固定化膜１
枚当たり約６０ｎｍｏｌのＩＰＲ−ｐＮＡが固定化され
ていることが確かめられた。

【００２９】このようにして得られたＩＰＲ−ｐＮＡ固
定化膜をフィルターホルダにセットしてＩＰＲ−ｐＮＡ
固定化カセットとし、本カセットを高速液体クロマトグ
ラフィー装置に組み込んだ分析装置を作成しこの模式図
を図１に示した。本装置にトリプシン２を注入し、２５
℃の恒温槽５内でＩＰＲ−ｐＮＡ固定化カセット３を透
過させ、分解生成してくるパラニトロアニリンを検出器
４で検出することによりトリプシン活性の測定を試みた
。この結果のクロマトグラムを図２に示すが、パラニト
ロアニリンのピークが認められた。なお、クロマト条件
は以下に示す通りである。 溶出液：５０ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＋０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ 流速　　：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出　　：４０５ｎｍ 温度　　：２５℃ 試料　　：トリプシン（シグマ社製）１０μｇ／１０μ
ｌ

【００３０】

【実施例２】内径８ｍｍ、長さ３０ｃｍの市販ゲルろ過
分離カラム（商品名ＷＳ−８０３：昭和電工（株）製）
を２本連結し分離カラムとした。実施例１で得られたＩ
ＰＲ−ｐＮＡ固定化カセットを分離カラムに連結し、高
速液体クロマトグラフィー装置に組み込んだ装置を作成
しその模式図を図３に示した。本装置にチログロブリン
、トランスフェリン、トリプシンの３種類のたんぱく質
からなる混合物２を注入しまず分離カラム６により混合
物の分離を行い、次いで実施例１と同様に２５℃の恒温
槽５内でＩＰＲ−ｐＮＡ固定化カセット３を透過させ、
検出器４により、たんぱく質を２８０ｎｍ、また遊離す
るパラニトロアニリンを４０５ｎｍの吸収により検出し
た。

【００３１】この結果のクロマトグラムを図４に示すが
、図４中、（１）はたんぱく質の分離を示すクロマトグ
ラムである。ピークＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれチログロブリ
ン、トランスフェリン、トリプシンを示す。また、（２
）は遊離したパラニトロアラニンの検出を示すクロマト
グラムである。このように本装置により数種のたんぱく
質の分離とトリプシン活性の検出を同時に行うことが可
能であった。なお、クロマト条件は以下に示す通りであ
る。 溶出液：５０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．４
）＋０．１５Ｍ　　ＮａＣｌ 流速　　：１ｍｌ／ｍｉｎ 検出　　：２８０ｎｍ、４０５ｎｍ 測定温度：２５℃ 試料　　：チログロブリン（シグマ社製）トランスフェ
リン（シグマ社製） トリプシン（シグマ社製）

【００３２】

【発明の効果】本発明による酵素活性測定用膜は成形が
可能で性能に変動が少なく、これを用いることにより、
簡便、迅速な酵素活性測定方法が提供される。このよう
に、本発明は今後、酵素の分離精製に関わる様々な分野
において有用な手段を提供するものであるが、その中で
も特に不純物中に存在する酵素活性の検出などの、簡便
なスクリーニング方法に応用するために有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で用いた酵素活性測定装置の模式図で
ある。

【図２】実施例１で得られたクロマトグラムである。

【図３】実施例２で用いた酵素活性測定装置の模式図で
ある。

【図４】実施例２で得られたクロマトグラムである。

【符号の説明】

１　　ポンプ ２　　注入試料 ３　　ＩＰＲ−ｐＮＡ固定化カセット ４　　検出器 ５　　恒温槽 ６　　分離カラム

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　　　酵素によって認識される基質を多
   孔質膜に固定化してなることを特徴とする酵素活性測定
   用膜。
2. 【請求項２】　　　　活性測定対象酵素を請求項１記載
   の酵素活性測定用膜に接触させ、得られる基質分解物を
   検出することを特徴とする酵素活性測定方法。