JPS6347649A - グルタミン酸測定用酵素センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のし一グルタミン酸の濃度測定に用い
られる酵素センサに関するものである。

（従来の技術） Ｌ−グルタミン酸の定量は２食品やアミノ酸工業の分野
での工程管理や製品分析に重要な項目の一つである。ま
た、臨床化学検査分野において。

特に肝機能及び心筋梗塞の診断に使われる血中のグルタ
ミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）と
グルタミン酸−ピルピン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ
）の活性測定では、生成するし一グルタミン酸の簡便な
定量法が要望されている。

食品やアミノ酸工業の分野では、アミノ酸分析機を代表
とする液体クロマトグラフィを用いた機器分析法による
定量が主であるが、最近、酵素を用いた定量用試薬の利
用が注目されるようになってきた。酵素を用いた定量用
試薬での測定は、検体の前処理が簡単で、かつ基質特異
性に優れているため、正確な定量が可能である。その酵
素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミ
ン酸オキシダーゼ、あるいはグルタミン酸デカルボキシ
ラーゼなどが用いられている。その中でも。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いた定量用試薬が実
用化されている。また、臨床検査における重要な項目の
一つであるＧＯＴやＧＰＴの活性測定には、現在ではＬ
−グルタミン酸を定量するよりも、もう一方の生成物で
あるオキサロ酢酸あるいはピルビン酸を、それぞれリン
ゴ酸デヒドロゲナーゼあるいは乳酸デヒドロゲナーゼを
用いた定量用試薬にて測定する方法が採用されている。

この方法は、検体の前処理が比較的簡単で、かつ正確な
定量が可能であるが、測定に時間を要すること、及び試
薬溶液調製後の寿命が短いことが問題とされている。

このため、基質特異性に優れた酵素と、筒便で迅速な分
析が可能である電極とからなる酵素センサが近年盛んに
開発されており、Ｌ−グルタミン酸測定用酵素センサと
しては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼとアンモニアイ
オン電極とを組み合わせた酵素センサが提案されている
。また、酵素に代えて微生物と電極とからなる微生物セ
ンサの研究も行われており、ニジエリチアコリ（Ｅｓｃ
ｈｅ−ｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）と炭酸ガス電極とか
らなるし一グルタミン酸を定量する酵素センサが提案さ
れている（蛋白質　核酸　酵素、３０巻、４号、２４５
〜２９８頁、　１９８５年）。しかしながら、この酵素
センサや微生物センサは、寿命と測定対象物に対する選
択性が低いなどの問題があり、これを改良するため、好
熱菌由来のグルタミンシンテターゼとアンモニアガス電
極とからなる酵素センサが提案されている（ＤＥＮ［Ｋ
ＡＧＡＸυ、　　５４．　Ｎ［Ｌ３　　（１９８６）２
９１〜２９２頁）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の好熱菌由来のグルタミンシンテターゼとアンモニ
アガス電極とからなる酵素センサは、寿命が飛躍的に向
上したが、低濃度のグルタミン酸には応答性が十分では
なかった。さらに、酵素センサはできるだけ微小である
ことが望まれているが、一般のガラス製の各種電極を用
いる場合には。

微小化に限界があった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決すべく鋭意研究
の結果、酵素としてグルタミンシンテターゼを用い、か
つトランスデユーサとしてｐ　Ｈガラス電極又はイオン
感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いた酵
素センサが、低濃度のグルタミン酸に良好な応答性を示
すとともに微小化できることを見い出し１本発明を完成
した。

すなわち１本発明は、基質に特異的に作用する固定化酵
素と、酵素反応によって消費あるいは生成する物質の濃
度変化又は熱量変化を電気信号に変えるトランスデユー
サとからなる酵素センサにおいて、酵素がグルタミンシ
ンテターゼであり。

トランスデユーサがｐＨガラス電極又はＩ　５ＦＥＴで
あることを特徴とするグルタミン酸測定用酵素センサを
要旨とするものである。

本発明に用いられるｐＨガラ°ス電極としては。

例えば、ガラス電極と比較電極とを組み合わせたもの、
複合型のものなどがあげられるが、微小化のためには複
合型ｐＨガラス電極が好ましい。また、ｌ５ＦＥＴとし
ては、水素イオン濃度を測定するものであればどのよう
なものでもよいが、特にＳ　ＯＳ　／　Ｉ　Ｓ　Ｆ　Ｅ
Ｔ（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｏｎ　５ａｐｐｈｉｒｅ／　ｌ５
ＦＥＴ）が好ましい。

本発明に用いられるグルタミンシンテターゼとしては５
微生物由来のもの、動物由来のものなど。

各種のものを使用することができる。中でも、最適生育
温度が５０℃ないし８５℃である微生物の産出するもの
が好ましい。そのような微生物としては２例えば、バチ
ルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サーモプロ
テオリテイクス、バチルス・アシドカルダリウスなどの
バチルス属、サーモアクチノマイセス属、サーマス属、
サーモミクロビウム属などの微生物があげられる。これ
らの中でも特に好ましい微生物としては、バチルス・ス
テアロサーモフィルスであり、その具体例としては、Ａ
ＴＣＣ？９３３，７９５４，１０１９４゜１２９８０、
ＮＣＡｌ３Ｏ３，ＵＫ５６３株（微工研菌寄第７２７５
号、ＦＥＲＭＰ−７２７５，昭和５８年９月２９日寄託
）などがある。

本発明において、グルタミンシンテターゼとｐＨガラス
電極又はｌ５ＦＥＴとから酵素センサを調製するには３
例えば、膜状の水不溶性担体にグルタミンシンテターゼ
を固定化した状態で。

ｐＨガラス電極又はｌ５ＦＥＴの感応面に直接被覆する
方法が用いられる。被覆膜は薄いほど応答時間が速くな
るため２例えば、１〜１００μ、好ましくは１０〜５０
μの厚さにすればよい。

本発明において、グルタミンシンテターゼを水不溶性担
体に固定化させるには１例えば、千畑一部著「固定化酵
素」講談社（１９７５）に記載されているような、従来
より公知の共有結合法や吸着法を採用することができる
し、また、架橋化法あるいは包括法など、いずれの方法
も採用することができる。

共有結合法としては１例えば、アガロース膜やデキスト
ラン膜などを臭化シアンで活性化し、これにグルタミン
シンテターゼのアミノ基を結合させるペプチド法、芳香
族アミノ基を有する水不溶性膜を亜硝酸塩によりジアゾ
ニウム塩とし、これにグルタミンシンテターゼのチロシ
ン残基をカップリングさせるジアゾ法、アミノ基を有す
る水不溶性膜にグルタルアルデヒドを結合させ、これに
グルタミンシンテターゼのアミノ基を結合させるシッフ
塩基形成法などがあげられる。

吸着法としては２例えば、ＤＥＡＥ−セルロース膜やフ
ェノキシアセチルセルロース膜などの水不溶性膜に、グ
ルタミンシンテターゼをイオン結合的あるいは物理的な
力で固定する方法があげられる。

架橋化法としては２例えば、グルタミンシンテターゼと
アルブミンのアミノ基をグルタルアルデヒドで架橋して
固定化する方法があげられる。

包括法としては１例えば、アクリルアミドモノマに架橋
剤であるＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、重合
開始剤であるリボフラビン、ベルオキソニ硫酸塩９重合
促進剤であるＮ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−テトラメチル
エチレンジアミンなどをグルタミンシンテターゼ溶液に
加えて、窒素気流中で光照射して重合させてグルタミン
シンテターゼを包括固定化する方法、コラーゲンフィブ
リル懸濁液にグルタミンシンテターゼを加えて風乾する
方法などがあげられる。

本発明の酵素センサを用いてＬ−グルタミン酸を測定す
るには５例えば、固定化グルタミンシンテターゼをｐＨ
ガラス電極又はｌ５ＦＥＴ感応面に直接被覆したものを
、アンモニウムイオンを含む塩とアデノシン−５′−三
リン酸（ＡＴＰ）とを溶解した緩衝液に浸し、試料とし
てのし一グルタミン酸溶液の添加により生ずるｐＨ変化
を測定すればよい。すなわち１次の反応 Ｌ−グルタミン酸十　ＮＨ４”＋Ａ’ｌ’ｐ−−−−−
−−−−−−→Ｌ−グルタミン＋ＡＤＰ　　十無機リン
＋Ｈ４により生ずるＨ４によるｐｉ−１変化をｐＨガラ
ス電極又はｌ５ＦＥＴで測定すればよい。

測定用の溶液としては２例えば、ＡＴＰを０．１〜３０
ｍＭ、好ましくは０．５〜１０ｍＭ、　　アンモニウム
イオンを含む塩を０．５〜５０ｍＭ、好ましくは２〜２
０ｍＭ、マグネシウムを含む塩を２〜２００ｍＭ、好ま
しくは１０〜１００ｍＭとなるように、１〜２００ｍＭ
、好ましくは３〜１００ｍＭのトリス−塩酸、イミダゾ
ール酢酸などの緩衝液（ｐＨ４〜１０．好ましくは５．
５〜９．５）に溶解したものを用いればよい。

また、測定温度は５〜７５℃、好ましくは１５〜５５℃
が用いられる。

（作　用） 本発明の酵素センサは５次の反応 Ｌ−グルタミン酸十ＮＨ４”＋ＡＴＰ −−−−−−−−−−−→Ｌ−グルタミシ＋ＡＤＰ　　
＋無七隻すン＋　Ｈｏにより生ずるＨ４によるｐＨ変化
を、ｐＨガラス電極又はｌ５ＦＥＴで検出することによ
り構成されている。

（実施例） 次に９本発明を実施例によって具体的に説明する。

実施例１ バチルス・ステアロサーモフィルス由来のグルタミンシ
ンテターゼ１０μ！！（１，４ユニツト）と２５ｔｍ／
ｖ−％の牛血清アルブミン溶液５μｌ及びＩＷ／Ｖ−％
のグルタルアルデヒド し．その混合液４μβをＩＳＦＥＴのゲート上に滴下し
た。これを４℃で一昼夜反応させ，固定化膜を形成させ
たのち、ｐＨ８，５の０．１　Ｍグリシンーカ性ソーダ
緩衝液に１５分間浸し、最後に蒸溜水で洗浄することに
より、グルタミンシンテターゼを固定化したｌ５ＦＥＴ
を調製した。

次いで、ｐＨ７，０の１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液、７
．６ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化アンモニウム及び５
０ｍＭの塩化マグネシウムからなる反応溶液２５ｍ！！
に、グルタミンシンテターゼ固定化ｌ５ＦＥＴ及び対照
としてグルタミンシンテターゼを固定化していないｌ５
ＦＥＴ（対照用ｌ５ＦＥＴ）を浸し、さらに、溶液の電
位の一定に保つため、Ａｇ／ＡｇＣε電極を漫した。こ
れらの各電極は、第１図に示した測定回路を形成し１両
ｌ５ＦＥＴＩ、２のソース・ドレイン間の電圧は３、Ｏ
Ｖに、また、Ａｇ／ＡｇＣｊ！電極３への印加電圧は６
．５Ｖとした。これにＬ−グルタミン酸溶液を添加する
と、ｌ５ＦＥＴ界面で反応が起こり。

局部的にｐＨが変化するので、２本のｌ５ＦＥＴの差動
出力値として測定することができる。

なお、温度は３０℃一定とし、また９反応液の攪拌は２
００ｒｐｍ一定にて行った。

試料として用いたし一グルタミン酸溶液の濃度を１．２
，５，１０．２０．５０ｍＭにて行い。

それぞれ得られた差動出力との関係を第２図に示した。

このように、Ｌ−グルタミン酸濃度１〜５０ｍＭの範囲
において、Ｌ−グルタミン酸濃度の対数と出力との間に
良好な直線関係が得られ。

Ｌ−グルタミン酸の定量が可能であることが判明した。

なお、応答時間は８分程度であった。

比較例１ グルタミンシンテターゼとアンモニアガス電極とを組み
合わせたグルタミン酸センサを２文献（ＤＥＮＫＩ　Ｋ
ＡＧＡＫＵ、　５４．　ｍ３　（１９８６）　２９０〜
２９１頁）に従って調製し、Ｌ−グルタミン酸が低濃度
領域での感度を調べた。

すなわち、０．０４モルのジイソシアン酸トリレンと０
．０１モルのポリエチレングリコールを混合し、８０℃
で３０分間反応させてウレタンプレポリマを合成した。

次に、１ｇの融解状態にしたウレタンプレポリマに１．
５ｍｊ！（１５ユニツト）のグルタミンシンテターゼ溶
液を加えて室温でかきまぜた後９発泡し、ウレタンプレ
ポリマが生成したところで、ガラス板上に広げて固定化
膜を作成した。この固定化膜をアンモニアガス電極（電
気化学工業　７１６１−ＩＰ型）に装着し、ｐＨメータ
（電気化学工業　ＨＧＣ−１０）を用いてグルタミン酸
センサの電位変化を３０℃で測定した。

グルタミン酸の定量に用いた溶液の組成は、７．６ｍＭ
のＡＴＰ、１０ｍＭの塩化アンモニウム、５０ｍＭの塩
化マグネシウム、５０ｍＭのイミダゾール−塩ａ、ｐＨ
ｓ、ｓであった。試料として用いたＬ−グルタミン酸溶
液は２反応液中の濃度として１．２，５．１０．２０．
５０ｍＭであった。Ｌ−グルタミン酸濃度ｔ度と得られ
た電位変化の関係を第３図に示した。

第３図より、１０ｍＭ以下のし一グルタミン酸濃度域に
おいては、全く応答性を示さなかった。

実施例２ ０．０４モルのジイソシアン酸トリレンと０．０１モル
のポリエチレングリコールを混合し、８０℃で３０分間
反応させてウレタンプレポリマを合成した。次に、１ｇ
の融解状態にしたウレタンプレポリマに１．５ｍｊ！（
１５ユニツト）のグルタミンシンテターゼ溶液を加えて
室温でかきまぜた後。

発泡し、ウレタンプレポリマが生成したところで。

ガラス板上に広げて固定化膜を作成した。この固定化膜
を極微量用複合型ｐＨガラス電極（セントラル科学社製
、検体測定用５Ｅ−１６０００Ｃ）に装着することによ
り酵素セン斗を構築し、その電位変化を３０℃で測定し
た。

なお、グルタミン酸の定量に用いた溶液の組成は＝７．
６ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの塩化アンモニウム、５０ｍ
Ｍの塩化マグネシウム、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，０）であった。試料として用いたし一グルタ
ミン酸溶液の濃度を１゜２．５，１０，２０．５０ｍＭ
にて行い、Ｌ−グルタミン酸濃度と得られた電位変化の
関係を第４図に示した。

（発明の効果） 本発明の酵素センサは、微小化を可能にし、低濃度のグ
ルタミン酸の定量も可能にするという優れた性能を有し
ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グルタミンシンテターゼ固定化ｌ５ＦＥＴＩ
、グルタミンシンテターゼを固定していないｌ５ＦＥＴ
２及びＡｇ／Ａｇ（ｌ電極３からなる測定回路を示す図
であり、第２図は、グルタミンシンテターゼとｌ５ＦＥ
Ｔとを組み合わせた本発明の酵素センサを用いた場合の
グルタミン酸濃度と差動出力との関係を示す図で、第３
図は。 グルタミンシンテターゼとアンモニアガス電極とを組み
合わせた公知の酵素センサを用いた場合のグルタミン酸
濃度と差動出力との関係を示す図であり、第４図は、グ
ルタミンシンテターゼと複合型ｐＨガラス電極とを組み
合わせた本発明の酵素センサを用いた場合のグルタミン
酸濃度と差動出力との関係を示す図である。 特許出願人　　二二亭力株式会社 矛３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）基質に特異的に作用する固定化酵素と、酵素反応
   によって消費あるいは生成する物質の濃度変化又は熱量
   変化を電気信号に変えるトランスデユーサとからなる酵
   素センサにおいて、酵素がグルタミンシンテターゼであ
   り。 トランスデユーサがｐＨガラス電極又はイオン感応性電
   界効果トランジスタであることを特徴とするグルタミン
   酸測定用酵素センサ。