JPH0421138B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のＬ−グルタミン酸の濃度測
定に用いられる酵素センサに関するものである。

（従来の技術） Ｌ−グルタミン酸の定量は、食品やアミノ酸工
業の分野での工程管理や製品分析に重要な項目の
一つである。また、臨床化学検査分野において、
特に肝機能及び心筋梗塞の診断に使われる血中の
グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ
（GOT）とグルタミン酸−ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（GPT）の活性測定では、生成するＬ
−グルタミン酸の簡便な定量法が要望されてい
る。

食品やアミノ酸工業の分野では、アミノ酸分析
機を代表とする液体クロマトグラフイを用いた機
器分析法による定量が主であるが、最近、酵素を
用いた定量用試薬の利用が注目されるようになつ
てきた。酵素を用いた定量用試薬での測定は、検
体の前処理が簡単で、かつ基質特異性に優れてい
るため、正確な定量が可能である。その酵素とし
ては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミ
ン酸オキシダーゼ、あるいはグルタミン酸デカル
ボキシラーゼなどが用いられている。その中で
も、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いた定量
用試薬が実用化されていた。また、臨床検査にお
ける重要な項目の一つであるGOTやGPTの活性
測定には、現在ではＬ−グルタミン酸を定量する
よりも、もう一方の生成物であるオキサロ酢酸あ
るいはピルビン酸を、それぞれリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼあるいは乳酸デヒドロゲナーゼを用いた
定量用試薬にて測定する方法が採用されている。
この方法は、検体の前処理が比較的簡単で、かつ
正確な定量が可能であるが、測定に時間を要する
こと、及び試薬溶液調製後の寿命が短いことが問
題とされている。

このため、基質特異性に優れた酵素と、簡便で
迅速な分析が可能である電極とからなる酵素セン
サが近年盛んに開発されており、Ｌ−グルタミン
酸測定用酵素センサとしては、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼとアンモニアイオン電極とを組み合
わせた酵素センサが提案されている。また、酵素
に代えて微生物と電極とからなる微生物センサの
研究も行われており、エシエリチア コリ
（Esche−richia coli）と炭酸ガス電極とからな
るＬ−グルタミン酸を定量する酵素センサが提案
されている（蛋白質 核酸 酵素、30巻、４号、
245〜298頁、1985年）。しかしながら、この酵素
センサや微生物センサは、寿命と測定対象物に対
する選択性が低いなどの問題があり、これを改良
するため、好熱菌由来のグルタミンシンテターゼ
とアンモニアガス電極とからなる酵素センサが提
案されている（DENKI KAGAKU、54、No.３
（1986）291〜292頁）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記の好熱菌由来のグルタミンシンテターゼと
アンモニアガス電極とからなる酵素センサは、寿
命が飛躍的に向上したが、低濃度のグルタミン酸
には応答性が十分ではなかつた。さらに、酵素セ
ンサはできるだけ微小であることが望まれている
が、一般のガラス製の各種電極を用いる場合に
は、微小化に限界があつた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決すべく
鋭意研究の結果、酵素としてグルタミンシンテタ
ーゼを用い、かつトランスデユーサとしてPHガラ
ス電極又はイオン感応性電界効果トランジスタ
（ISFET）を用いた酵素センサが、低濃度のグル
タミン酸に良好な応答性を示すとともに微小化で
きることを見い出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、基質に特異的に作用する
固定化酵素と、酵素反応によつて消費あるいは生
成する物質の濃度変化を電気信号に変えるトラン
スデユーサとからなる酵素センサにおいて、酵素
がグルタミンシンテターゼであり、トランスデユ
ーサがPHガラス電極又はイオン感応性電界効果ト
ランジスタであつて、該トランスデユーサの感応
部が該酵素の固定化膜で被覆されていることを特
徴とするグルタミン酸測定用酵素センサを要旨と
するものである。

本発明に用いられるPHガラス電極としては、例
えば、ガラス電極と比較電極とを組み合わせたも
の、複合型のものなどがあげられるが、微小化の
ためには複合型PHガラス電極が好ましい。また、
ISFETとしては、水素イオン濃度を測定するも
のであればどのようなものでもよいが、特に
SOS／ISFET（Silicon on Sapphire／ISFET）
が好ましい。

本発明に用いられるグルタミンシンテターゼと
しては、微生物由来のもの、動物由来のものな
ど、各種のものを使用することができる。中で
も、最適生育温度が50℃ないし85℃である微生物
の産出するものが好ましい。そのような微生物と
しては、例えば、バチルス・ステアロサーモフイ
ルス、バチルス・サーモプロテオリテイクス、バ
チルス・アシドカルダリウスなどのバチルス属、
サーモアクチノマイセス属、サーマス属、サーモ
ミクロビウム属などの微生物があげられる。これ
らの中でも特に好ましい微生物としては、バチル
ス・ステアロサーモフイルスであり、その具体例
としては、ATCC7933、7954、10194、12980、
NCA1503、UK563株（微工研菌寄第7275号、
FERMP−7275、昭和58年９月29日寄託）などが
ある。

本発明において、グルタミンシンテターゼとPH
ガラス電極又はISFETとから酵素センサを調製
するには、例えば、膜状の水不溶性担体にグルタ
ミンシンテターゼを固定化した状態で、PHガラス
電極又はISFETの感応面に直接被覆する方法が
用いられる。被覆膜は薄いほど応答時間が速くな
るため、例えば、１〜100μ、好ましくは10〜50μ
の厚さにすればよい。

本発明において、グルタミンシンテターゼを水
不溶性担体に固定化させるには、例えば、千畑一
郎著「固定化酵素」講談社（1975）に記載されて
いるような、従来より公知の共有結合法や吸着法
を採用することができるし、また、架橋化法ある
いは包括法など、いずれの方法も採用することが
できる。

共有結合法としては、例えば、アガロース膜や
デキストラン膜などを臭化シアンで活性化し、こ
れにグルタミンシンテターゼのアミノ基を結合さ
せるペプチド法、芳香族アミノ基を有する水不溶
性膜を亜硝酸塩によりジアソニウム塩とし、これ
にグルタミンシンテターゼのチロシン残基をカツ
プリングさせるジアゾ法、アミノ基を有する水不
溶性膜にグルタルアルデヒドを結合させ、これに
グルタミンシンテターゼのアミノ基を結合させる
シツフ塩基形成法などがあげられる。

吸着法としては、例えば、DEAE−セルロース
膜やフエノキシアセチルセルロース膜などの水不
溶性膜に、グルタミンシンテターゼをイオン結合
的あるいは物理的な力で固定する方法があげられ
る。

架橋化法としては、例えば、グルタミンシンテ
ターゼとアルプミンのアミノ基をグルタルアルデ
ヒドで架橋して固定化する方法があげられる。

包括法としては、例えば、アクリルアミドモノ
マに架橋剤であるＮ，N′−メチレンビスアクリ
ルアミド、重合開始剤であるリボフラビン、ペル
オキソ二硫酸塩、重合促進剤であるＮ，Ｎ，N′，
N′−テトラメチルエチレンジアミンなどをグル
タミンシンテターゼ溶液に加えて、窒素気流中で
光照射して重合させてグルタミンシンテターゼを
包括固定化する方法、コラーゲンフイブリル懸濁
液にグルタミンシンテターゼを加えて風乾する方
法などがあげられる。

本発明の酵素センサを用いてＬ−グルタミン酸
を測定するには、例えば、固定化グルタミンシン
テターゼをPHガラス電極又はISFET感応面に直
接被覆したものを、アンモニウムイオンを含む塩
とアデノシン−5′−三リン酸（ATP）とを溶解
した緩衝液に浸し、試料としてのＬ−グルタミン
酸溶液の添加により生ずるPH変化を測定すればよ
い。すなわち、次の反応 Ｌ−グルタミン酸＋NH₄ ⁺＋ATP グルタミンシンテターゼ ―――――――――――――→ Ｌ−グルタミン ＋ADP＋無機リン＋H⁺ により生ずるH⁺によるPH変化をPHガラス電極又
はISFETで測定すればよい。

測定用の溶液としては、例えば、ATPを0.1〜
30ｍＭ、好ましくは0.5〜10ｍＭ、アンモニウム
イオンを含む塩を0.5〜50ｍＭ、好ましくは２〜
20ｍＭ、マグネシウムを含む塩を２〜200ｍＭ、
好ましくは10〜100ｍＭとなるように、１〜200ｍ
Ｍ、好ましくは３〜100ｍＭのトリス−塩酸、イ
ミダゾール酢酸などの緩衝液（PH４〜10、好まし
くは5.5〜9.5）に溶解したものを用いればよい。

また、測定温度は５〜75℃、好ましくは15〜55
℃が用いられる。

（作用） 本発明の酵素センサは、次の反応 Ｌ−グルタミン酸＋NH₄ ⁺＋ATP グルタミンシンテターゼ ―――――――――――――→ Ｌ−グルタミン ＋ADP＋無機リン＋H⁺ により生ずるH⁺によるPH変化を、PHガラス電極
又はISFETで検出することにより構成されてい
る。

（実施例） 次に、本発明を実施例によつて具体的に説明す
る。

実施例 １ バチルス・ステアロサーモフイルス由来のグル
タミンシンテターゼ10μ（1.4ユニツト）と
25w／ｖ−％の牛血清アルブミン溶液5μ及び
1w／ｖ−％のグルタルアルデヒド溶液15μを混
合し、その混合液4μをISFETのゲート上に滴
下した。これを４℃で一昼夜反応させ、固定化膜
を形成させたのち、PH8.5の0.1Mグリシン−カ性
ソーダ緩衝液に15分間浸し、最後に蒸溜水で洗浄
することにより、グルタミンシンテターゼを固定
化したISFETを調製した。

次いで、PH7.0の10ｍＭトリス−塩酸緩衝液、
7.6ｍＭのATP、10ｍＭの塩化アンモニウム及び
50ｍＭの塩化マグネシウムからなる反応溶液25ml
に、グルタミンシンテターゼ固定化ISFET及び
対照としてグルタミンシンテターゼを固定化して
いないISFET（対照用ISFET）を浸し、さらに、
溶液の電位を一定に保つため、Ag／AgCl電極を
浸した。これらの各電極は、第１図に示した測定
回路を形成し、両ISFET１，２のソース・ドレ
イン間の電圧は3.0Vに、また、Ag／AgCl電極３
への印加電圧は6.5Vとした。これにＬ−グルタ
ミン酸溶液を添加すると、ISFET界面で反応が
起こり、局部的にPHが変化するので、２本の
ISFETの差動出力値として測定することができ
る。

なお、温度は30℃一定とし、また、反応液の撹
拌は200rpm一定にて行つた。

試料として用いたＬ−グルタミン酸溶液の濃度
を１、２、５、10、20、50ｍＭにて行い、それぞ
れ得られた差動出力との関係を第２図に示した。
このように、Ｌ−グルタミン酸濃度１〜50ｍＭの
範囲において、Ｌ−グルタミン酸濃度の対数と出
力との間に良好な直線関係が得られ、Ｌ−グルタ
ミン酸の定量が可能であることが判明した。

なお、応答時間は８分程度であつた。

比較例 １ グルタミンシンテターゼとアンモニアガス電極
とを組み合わせたグルタミン酸センサを、文献
（DENKI KAGAKU、54、No.３（1986）290〜291
頁）に従つて調製し、Ｌ−グルタミン酸が低濃度
領域での感度を調べた。

すなわち、0.04モルのジイソシアン酸トリレン
と0.01モルのポリエチレングリコールを混合し、
80℃で30分間反応させてウレタンプレポリマを合
成した。次に、１ｇの融解状態にしたウレタンプ
レポリマに1.5ml（15ユニツト）のグルタミンシ
ンテターゼ溶液を加えて室温でかきまぜた後、発
泡し、ウレタンプレポリマが生成したところで、
ガラス板上に広げて固定化膜を作成した。この固
定化膜をアンモニアガス電極（電気化学工業
7161−1P型）に装着し、PHメータ（電気化学工
業 HGC−10）を用いてグルタミン酸センサの
電位変化を30℃で測定した。グルタミン酸の定量
に用いた溶液の組成は、7.6ｍＭのATP、10ｍＭ
の塩化アンモニウム、50ｍＭの塩化マグネシウ
ム、50ｍＭのイミダゾール−塩酸、PH8.5であつ
た。試料として用いたＬ−グルタミン酸溶液は、
反応液中の濃度として１、２、５、10、20、50ｍ
Ｍであつた。Ｌ−グルタミン酸濃度と得られた電
位変化の関係を第３図に示した。

第３図より、10ｍＭ以下のＬ−グルタミン酸濃
度域においては、全く応答性を示さなかつた。

実施例 ２ 0.04モルのジイソシアン酸トリレンと0.01モル
のポリエチレングリコールを混合し、80℃で30分
間反応させてウレタンプレポリマを合成した。次
に、１ｇの融解状態にしたウレタンプレポリマに
1.5ml（15ユニツト）のグルタミンシンテターゼ
溶液を加えて室温でかきまぜた後、発泡し、ウレ
タンプレポリマが生成したところで、ガラス板上
に広げて固定化膜を作成した。この固定化膜を極
微量用複合型PHガラス電極（セントラル科学社
製、検体測定用SE−1600GC）に装着することに
より酵素センサを構築し、その電位変化を30℃で
測定した。

なお、グルタミン酸の定量に用いた溶液の組成
は、7.6ｍＭのATP、10ｍＭの塩化アンモニウ
ム、50ｍＭの塩化マグネシウム、10ｍＭのトリス
−塩酸緩衝液（PH7.0）であつた。試料として用
いたＬ−グルタミン酸溶液の濃度を１、２、５、
10、20、50ｍＭにて行い、Ｌ−グルタミン酸濃度
と得られた電位変化の関係を第４図に示した。

（発明の効果） 本発明の酵素センサは、微小化を可能にし、低
濃度のグルタミン酸の定量も可能にするという優
れた機能を有している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グルタミンシンテターゼ固定化
ISFET１、グルタミンシンテターゼを固定して
いないISFET２及びAg／AgCl電極３からなる測
定回路を示す図であり、第２図は、グルタミンシ
ンテターゼとISFETとを組み合わせた本発明の
酵素センサを用いた場合のグルタミン酸濃度と差
動出力との関係を示す図で、第３図は、グルタミ
ンシンテターゼとアンモニアガス電極とを組み合
わせた公知の酵素センサを用いた場合のグルタミ
ン酸濃度と差動出力との関係を示す図であり、第
４図は、グルタミンシンテターゼと複合型PHガラ
ス電極とを組み合わせた本発明の酵素センサを用
いた場合のグルタミン酸濃度と差動出力との関係
を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 基質に特異的に作用する固定化酵素と、酵素
   反応によつて消費あるいは生成する物質の濃度変
   化を電気信号に変えるトランスデユーサとからな
   る酵素センサにおいて、酵素がグルタミンシンテ
   ターゼであり、トランスデユーサがpHガラス電
   極又はイオン感応性電界効果トランジスタであつ
   て、該トランスデユーサの感応部が該酵素の固定
   化膜で被覆されていることを特徴とするグルタミ
   ン酸測定用酵素センサ。