JP4940430B2 - グルタミン酸の定量方法及びグルタミン酸定量装置。 - Google Patents

Description

本発明は、グルタミン酸の定量方法及びグルタミン酸定量装置に関する。

グルタミン酸は、動物の体内において代謝に重要な役割を果たすものであるとともに、化学調味料であるグルタミン酸ナトリウムの中間原料としても製造、利用されている。

従来のグルタミン酸の定量に関する技術としては、例えば下記特許文献１に、イオンセンシティブ・電界効果トランジスタ（以下「ＩＳ・ＦＥＴ」という。）の表面にＬ−グルタメート・デカルボキシラーゼを固定化して参照電極とともにＫＣｌ溶液等の反応溶液中に装入し、その中に被検試料を注入した後、ｐＨ変化に応じたＩＳ・ＦＥＴの出力電圧の変化を所定時間測定し、その定常値から被検試料中のＬ−グルタミン酸の濃度を測定する技術が記載されている。
特開平８−２５６７９３号公報

しかしながら、上記技術においては、ＩＳ・ＦＥＴにＬ−グルタメート・デカルボキシラーゼを固定化しなければならず、手間がかかるといった課題がある。

そこで、本発明は上記課題を鑑み、より簡便にグルタミン酸を定量する方法及びその方法を実行可能なグルタミン酸定量装置を提供することを目的とする。

本発明者の発明者は、上記課題について鋭意検討を行ったところ、通常非線形現象であると考えられる振動反応を、グルタミン酸の定量に応用できることを発見し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明の第一の手段に係るグルタミン酸の定量方法は、振動反応を利用してなることを特徴とする。ここで本発明における「振動反応」とは、酵素と基質とをゆっくり混合させた場合において生成物の濃度が周期的な増減を示す反応をいう。また、ここで酵素としては、例えばカタラーゼであることが好ましく、基質としては、過酸化水素を用いることが好ましい。またここで「グルタミン酸」としては、Ｌ−グルタミン酸であっても、Ｄ−グルタミン酸であっても、これらを混合したものであってもよいが、化学調味料等用途の広いＬ−グルタミン酸の場合がより有用となる。

また、本手段において、限定されるわけではないが、振動反応は、過酸化水素及びグルタミン酸を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びグルタミン酸オキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させることにより行われる反応であることが好ましい。

また、本手段において、限定されるわけではないが、半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターであることが好ましい。

また、本手段において、限定されるわけではないが、第二の溶液は、カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上０．１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で含有し、前記グルタミン酸オキシダーゼを１×１０^−５ｍｇ／ｍｌ以上１×１０^−４ｍｇ／ｍｌの範囲内で含有することがより好ましく、第一の溶液は、前記グルタミン酸濃度を１×１０^−５ｍｏｌ／ｌ以上１×１０^−４ｍｏｌ／ｌ以下の範囲内で含有してなることがより好ましい。

また、上記課題を解決するための第二の手段として、本発明に係るグルタミン酸濃度の定量方法は、過酸化水素及びグルタミン酸を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びグルタミン酸オキシダーゼを含む第二の溶液と、を半透膜を介して混合させ、第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液に含まれるグルタミン酸の溶液に含まれるＬ−グルタミン酸濃度を算出することを含む。

また、本手段において、限定されるわけではないが、半透膜は、透析膜又はミリポアフィルターの少なくともいずれかを含むことが好ましい。

また、本手段において、限定されるわけではないが、第二の溶液は、カタラーゼを０．０１ｍｇ／ｍｌ以上０．１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で含有し、グルタミン酸オキシダーゼを１×１０^−５ｍｇ／ｍｌ以上１×１０^−４ｍｇ／ｍｌの範囲内で含有することが好ましく、第一の溶液は、グルタミン酸濃度を１×１０^−５ｍｏｌ／ｌ以上１×１０^−４ｍｏｌ／ｌ以下の範囲内で含有してなることを特徴とすることがより好ましい。

また、上記課題を解決するための第三の手段として、本発明に係るグルタミン酸定量装置は、溶存酸素濃度データ及び時刻データを順次記録していく溶存酸素データ取得手段と、時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段と、グルタミン酸の濃度と振動反応の周期との関係を記憶する周期−グルタミン酸関係記憶手段と、グルタミン酸の濃度と振動反応の周期との関係に基づいてグルタミン酸の定量を行うグルタミン酸定量手段と、を有する。

以上、本発明は、いわゆる振動反応をグルタミン酸を定量する方法として用いているため、上記従来技術のようにＩＳ・ＦＥＴにグルタメート・デカルボキシラーゼを固定化する等の煩雑な手続が不要となるため、より簡便なグルタミン酸を定量する方法となる。また、本方法は振動反応を利用するためその周期的な増減を測定するだけの一段階の測定で定量が可能であり、この点においてもより簡便な方法である。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。ただし、本発明は多くの異なる態様で実施することが可能であり、以下に示す実施形態に限定されるものではない。

本実施形態に係るグルタミン酸の定量方法（以下「本定量方法」ともいう。）は、振動反応を利用してなることを特徴の一つとする。具体的に説明すると、本定量方法は、過酸化水素及びグルタミン酸を含む第一の溶液と、カタラーゼ及びグルタミン酸オキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して浸透、混合させる方法であることが好ましい。グルタミン酸としては、Ｌ−グルタミン酸であっても、Ｄ−グルタミン酸であってもよく、これらを混合したものであってもよいが、上記のとおり、化学調味料等の用途の広いＬ−グルタミン酸であることが好ましい。

図１に、本実施形態における定量方法における振動反応について説明するための図を示す。図１で示すとおり、半透膜により区切られた容器内の空間の一方に過酸化水素水とグルタミン酸を含む第一の溶液をいれ、他方にカタラーゼ及びグルタミン酸オキシダーゼを入れた第二の溶液を入れる。すると、第一の溶液における過酸化水素水はゆっくりと半透膜を透過して第二の溶液側に移動する。第二の溶液側では過酸化水素水がカタラーゼと反応し、酸素を発生させる。そして酸素が発生するとグルタミン酸オキシダーゼがこの酵素を用いてグルタミン酸を酸化し、過酸化水素水を発生させる。すなわち、この一連の流れが循環過程となり、その過酸化水素水の濃度が振動する振動反応となる。そしてこの場合、第二の溶液中に溶存している酸素（以下「溶存酸素」という。）の濃度を測定すると、溶存酸素の濃度は周期的な振動を示している。特に、カタラーゼ等溶液中に存在する物質の濃度が好ましい範囲にある場合、振動周期がグルタミン酸の濃度と直線関係となり、この関係を用いてグルタミン酸の精度よい定量が可能となる。

本定量方法は、第一の溶液と第二の溶液との反応が十分進行し、周期的な振動となった期間における周期を測定し、予め求めてある周期−グルタミン酸濃度の関係に基づきグルタミン酸濃度を求めることで実現できる。周期については、様々な方法で求めることができ、限定されるわけではないが、本実施形態における反応においては周期的に溶存酸素のピークが現れるため（例えば後述する実験例の図５参照）、このピークの間隔がほぼ一定になったと思われる期間の周期又はその近傍の期間の平均を算出することで求めることができる。また、周期−グルタミン酸濃度の関係は、周期とグルタミン酸濃度を対応させたものであり、周期がわかればグルタミン酸濃度がわかるものであれば限定されるわけではないが、例えば検量線であってもよく、データのテーブルであってもよい。また、限定されるわけではないが、周期−グルタミン酸濃度の関係は、第一及び第二の溶液におけるカタラーゼ、グルタミン酸オキシダーゼの濃度の少なくともいずれかに応じて複数も受けられていることが精度を向上させる点においてより好ましい。

なお、第二の溶液において、カタラーゼの濃度は、限定されるわけではないが、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上１ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で含まれていることが好ましく、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ以上０．５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内である。また、第二の溶液におけるグルタミン酸オキシダーゼの濃度は、上記好ましい過酸化水素水の濃度範囲において１×１０^−５ｍｇ／ｍｌ以上１×１０^−４ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内で含まれていることが好ましく、より好ましくは２×１０^−５ｍｇ／ｍｌ以上８×１０^−５ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内である。カタラーゼおよびグルタミン酸オキシダーゼの濃度を上記望ましい範囲とすると、通常非線形的な反応である振動反応が良好な直線関係となり、グルタミン酸の精度より定量が簡便に可能となる。なお、第二の溶液における溶媒としては、上記振動反応が可能である限りにおいて限定されないが水であることが好ましい。

また第一の溶液において、過酸化水素水の濃度は、限定されるわけではないが０．５重量％以上１．０重量％以下の範囲内であることが好ましい。この範囲内にすることで、振動反応の周期をより規則的にすることができるとともに、一般的な溶存酸酸素計の測定可能範囲に収めることができる。また、グルタミン酸の濃度は、測定対象であって、限定されることがないのは当然であるが、概ね２．０×１０^−５ｍｏｌ／ｌより高く、１．０×１０^−３ｍｏｌ／ｌよりは低くすることが制度の観点から好ましく、より好ましくは１×１０^−５ｍｏｌ／ｌ以上１×１０^−４ｍｏｌ／ｌの範囲内である。仮に、測定時において測定対象となるグルタミン酸の濃度測定の結果において疑問が生じる場合、第一の溶液における溶媒の増量又は減量を行って希釈又は濃縮し、グルタミン酸の濃度を変化させ、測定後この補正を行うことは好ましい態様である。なおここで第一の溶液における溶媒としては、限定されるわけではないが水であることが好ましい。

ここで図２に、本実施形態におけるグルタミン酸の定量方法を実現する定量装置（以下「本定量装置」という。）の概略図を示す。図２で示すとおり、本定量装置は、第一の容器１と、第二の容器２と、第一及び第二の容器を接続する接続管３と、第一及容器及び第二の容器を仕切る半透膜４と、を有している。また、本定量装置は、第一の容器１及び第二の容器２に第一の溶液及び第二の溶液がそれぞれ充填され、振動反応が開始された場合にこの振動反応において存在する溶存酸素を測定するための酸素電極５及びこの酸素電極５に接続された溶存酸素計６と、溶存酸素計に接続された情報処理装置７と、を有して構成されている。

本実施形態における第一の容器１、第二の容器２としては、第一及び第二の溶液それぞれとは反応せず、それぞれ安定に保持することができる限りにおいて限定されないが、例えばガラスが好ましい。なお、本実施形態においては、第一の容器１と第二の容器２とを別の容器とし、接続管３で接続する構成としているが、例えば図３で示すような構成とすることも可能である。図３では、一つの容器を穴の開いた仕切板で仕切り、仕切板の穴を半透膜４で覆う構成としている。この結果、図３における定量装置においても第一の容器１と、第二の容器２と、第一及び第二の容器を仕切る半透膜４と、を有すると表現することができる。

半透膜４は、溶液における一部の成分は通すが他の成分は通さない性質を有する膜であって、限定されるわけではないが、透析膜、ミリポアフィルターの少なくともいずれかであることが好ましい。なお透析膜の場合、限定されるわけではないがセルロースを好ましく挙げることができる。

酸素電極５は溶存酸素を測定するために用いられるものであり、第二の溶液側に配置される。酸素電極５は、この電極上で溶存酸素が還元されて水になるときに発生する電子の量に応じ電位を発生させる。酸素電極５の構成は特に限定されず、一般に市販されている周知の酸素電極を用いることができる。

溶存酸素計６は、酸素電極５からの電位の発生を受け、溶存酸素の量を算出するものであり、この機能を有する限りにおいて限定はなく、一般に市販されている周知のものを採用することができる。

情報処理装置７は、溶存酸素計からの出力を受け、その出力から振動反応の周期を求め、この周期と予め求めてある周期−グルタミン酸の関係とを参照し、グルタミン酸の濃度を算出（定量）する。

情報処理装置７としては、上記機能を有する限りにおいて限定されるわけではないが、コンピュータのハードディスクなどの記憶媒体に記録されたプログラムを実行することで実現することができる。図４に、プログラムが実行された場合における情報処理装置７の機能ブロック図を示す。

図４で示すとおり、本情報処理装置７は、プログラムの実行により、溶存酸素計が測定する溶存酸素の濃度に対するデータ（以下「溶存酸素濃度データ」という。）を、その濃度を示した時刻のデータ（以下「時刻データ」という。）とともに順次記録していく溶存酸素データ取得手段７０１と、時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段７０２と、グルタミン酸の濃度と振動反応の周期との関係を予め記憶してある周期−グルタミン酸関係記憶手段７０３と、振動反応の周期とグルタミン酸の濃度と振動反応の周期との関係に基づいてグルタミン酸の定量を行うグルタミン酸定量手段７０４と、して機能する。なおこの場合において、上述のように、グルタミン酸の濃度と振動反応の周期は、カタラーゼやグルタミン酸オキシダーゼの濃度等によって直線の傾きや直線関係を示す範囲が異なってくるため、周期−グルタミン酸関係記憶手段７０３は、測定における条件の入力を受付、記憶する機能も有すること、更には、その入力に対応する条件に合致した振動の周期とグルタミン酸の濃度との関係を読み出せるようにすることが望ましい（もちろん、予め当該条件における関係を記憶しておくことが必要である）。なおこれにより、情報処理装置７は、グルタミン酸定量装置となる。

以上、本実施形態に係る方法により、より簡便にグルタミン酸を定量することができる。

（実験例１）
ここで、実際に検量線の作成を行い、上記実施形態に係る方法の有用性について確認した。以下詳細に説明する。

まず、図２で示す装置を用いて行った。第一の容器、第二の容器及び接続管３いずれもガラス製のものを用い、接続管３の内径は１ｃｍのものを用いた。半透膜４としては、αセルロース（分画分子量１２，０００〜１４，０００）の透析膜を用いた。

そして、上記第一の容器１に０．５％の過酸化水素水溶液２０ｍｌ、Ｌ−グルタミン酸溶液を含む第一の溶液を入れ全体で２０．１ｍｌとなるようにし、第二の容器２にカタラーゼ０．１ｍｇ及びグルタミン酸オキシダーゼ０．０７４ｍｇを含む第二の溶液２５ｍｌをそれぞれ入れた。なお、本実験例ではＬ−グルタミン酸の濃度を調整し、５種類の異なる第一の溶液を作成し、それぞれ反応させ、振動反応を確認した。溶液の番号（試料溶液番号）とＬ−グルタミン酸の濃度との関係は以下の表１に示すとおりである。

図５に、試料溶液番号２の溶存酸素濃度の時間変化を示す。なお図５において横軸は時間（分）を、縦軸は溶存酸素濃度（ｍｇ／ｌ）を示す。そして、この結果から周期を決定した。なおここで周期は、振動反応が開始してから十分な時間が経過し、周期がほぼ一定になった場合における値を採用した。この時間としては資料によって多少の誤差はあったが概ね３０分〜１時間程度であった。表１に各試料溶液における周期の結果を示し、図６にこの表の結果をグラフにしたものを示す。なお図６において横軸は周期を縦軸にＬ−グルタミン酸の濃度を示す。

この結果、振動の周期とＬ−グルタミン酸の濃度との関係は直線によって非常によく説明することができることを確認した。特に、本実験例によるとＬ−グルタミン酸の濃度は１．０×１０^−５ｍｏｌ／ｌ以上１．０×１０^−４ｍｏｌ／ｌ以下の範囲において非常によく説明できており、この範囲である場合は特に精度高く近似することができると考えられる。なお、Ｌ−グルタミン酸の濃度が２．０×１０^−５ｍｏｌ／ｌ以下の場合、１．０×１０^−４ｍｏｌ／ｌ以上の場合は直線として近似できにくかったため、Ｌ−グルタミン酸の範囲としては２．０×１０^−５ｍｏｌ／ｌより高く、２．０×１０^−４ｍｏｌ／ｌよりは低いことが望ましく、より望ましくは１．０×１０^−５ｍｏｌ／ｌ以上１．０×１０^−４ｍｏｌ／ｌ以下の範囲内であろうと推測された。

以上により、振動反応において、振動反応の周期とＬ−グルタミン酸の濃度との関係が密接に関係していることを確認し、振動反応の周期を求めることでＬ−グルタミン酸の濃度を定量化できることを確認した。

（実験例２）
振動反応において、より短い周期とすることは測定のアウトプットをあげる上で非常に重要である。そこで本実験例では反応容器を小さくし、電極も小さいものを用いることで周期を短くできるかについて検討を行った。なお、本実験例は以下に示す試料以外はほぼ実験例１と同様とした。小さな酸素電極および内径1ｃｍのガラスセルを用いた場合を次に示す。

上記第一の容器１に１．０％の過酸化水素水溶液１０ｍｌ、Ｌ−グルタミン酸溶液及び水を含む第一の溶液を全体で１０．１ｍｌとなるように入れ、第二の容器２にカタラーゼ０．１ｍｇ及びグルタミン酸オキシダーゼ０．０７４ｍｇを含む第二の溶液１０ｍｌをそれぞれ入れた。なお、本実験例ではＬ−グルタミン酸の濃度を調整し、４種類の異なる第一の溶液を作成し、それぞれ反応させ、振動反応を確認した。溶液の番号（試料溶液番号）とＬ−グルタミン酸の濃度との関係は以下の表２に示すとおりである。

なお、上記各試料溶液に対しても上記同様周期を測定し、周期とＬ−グルタミン酸の濃度との関係を求めた。この結果を図７に示す。この結果、上記実験例と同様の精度よい直線関係を確認することができた。なお、本実験例においては、周期が短くなっていることが確認できただけでなく、周期がほぼ一定になるまでの時間も２０分程度と大幅に短縮できたことを確認した。

以上、上記実験結果により、本発明の有効性を確認することができた。

本発明は、Ｌ−グルタミン酸の定量方法として産業上の利用可能性がある。また、これを実現するためのＬ−グルタミン酸定量装置としても、産業上の利用可能性がある。

実施形態に係るグルタミン酸の定量方法における振動反応について説明するための図である。 実施形態に係るグルタミン酸定量装置を説明するための図である。 グルタミン酸定量装置の他の例を示す図である。 実施形態に係るグルタミン酸定量装置における情報処理装置の機能ブロックを示す図である。 実施例１における溶存酸素濃度の時間変化の一例を示す図である。 実施例１により求められる周期−グルタミン酸濃度の関係を示す図である。 実施例２により求められる周期−グルタミン酸濃度の関係を示す図である。

符号の説明

１…第一の容器、２…第二の容器、３…接続管、４…半透膜、５…酸素電極、６…溶存酸素計、７…情報処理装置。

Claims (3)

1. ０．５重量％以上１．０重量％以下の過酸化水素水及び１×１０ ^−５ ｍｏｌ／ｌ以上１×１０ ^−４ ｍｏｌ／ｌ以下のグルタミン酸を含む第一の溶液と、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上０．１ｍｇ／ｍｌ以下のカタラーゼ及び１×１０ ^−５ ｍｇ／ｍｌ以上１×１０ ^−４ ｍｇ／ｍｌ以下のグルタミン酸オキシダーゼを含む第二の溶液を、半透膜を介して混合させて振動反応を起こし、前記第二の溶液における溶存酸素の濃度変化に基づいて、前記第二の溶液に含まれるグルタミン酸の溶液に含まれるグルタミン酸濃度を算出するグルタミン酸の定量方法。
2. 前記半透膜は、透析膜である請求項１記載のグルタミン酸の定量方法。
3. ０．５重量％以上１．０重量％以下の過酸化水素及び１×１０ ^−５ ｍｏｌ／ｌ以上１×１０ ^−４ ｍｏｌ／ｌ以下のグルタミン酸を含む第一の溶液を保持する第一の容器と、０．０１ｍｇ／ｍｌ以上０．１ｍｇ／ｍｌ以下のカタラーゼ及び１×１０ ^−５ ｍｇ／ｍｌ以上１×１０ ^−４ ｍｇ／ｍｌ以下のグルタミン酸オキシダーゼを含む第二の溶液を保持する第二の容器と、前記第一の容器と第二の容器との間に配置され、前記第一の溶液を前記第二の溶液に浸透させる半透膜と、前記第二の溶液に浸されるよう配置される酸素電極と、前記酸素電極に接続される溶存酸素計と、前記溶存酸素計に接続される情報処理装置と、を有し、
   前記情報処理装置は、溶存酸素濃度データ及び時刻データを順次記録していく溶存酸素データ取得手段と、
   時刻データと溶存酸素濃度データとの関係に基づいて振動反応の周期を判断する周期判断手段と、
   グルタミン酸の濃度と振動反応の周期との関係を記録する周期−グルタミン酸関係記憶手段と、
   前記グルタミン酸の濃度と振動反応の周期との関係に基づいてグルタミン酸の定量を行うグルタミン酸の定量装置。