JPS5963554A - ウレア−ゼ固定化尿素電極およびその製造方法 - Google Patents

ウレア−ゼ固定化尿素電極およびその製造方法

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JPS5963554A
JPS5963554A JP57173226A JP17322682A JPS5963554A JP S5963554 A JPS5963554 A JP S5963554A JP 57173226 A JP57173226 A JP 57173226A JP 17322682 A JP17322682 A JP 17322682A JP S5963554 A JPS5963554 A JP S5963554A
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Kichiji Karasawa
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は溶液中に溶存する尿素を測定する酵素電極及び
その製造方法に係り、特に短時間で尿素を定量するのに
好ボな酵素電極及びその製造方法に関する。
〔従来技術〕
基質（測定対象物質）に対する反応特異性の高い酵素を
固定化し、これとイオン電極等とを組合せた酵素電極は
１ｏ数年前に開発され（Ｇ、Ｇ。
Ｑｕｉｌｂａｕｌｔ　　：　　”　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　
　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃハ Ｍｅｔｈｏｄ　　　ｏｆ　　　＠ｎａｌｙｓｉｓ　　”
　　へ４ａｒｃｅｉ　　　Ｄｅｋｋｅｒ　。
Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　（１９７６））近年その一部が実
用段階に違した。このような酵素電極の一つに、尿素を
測定対象物質とする尿素電極がある。尿素電極としてい
くつかの形式の異なるものがあるが、そのなかの一つに
、酵素として７レアーゼを用い、これを固定化した紛。
素膜をアンモニクムイオン選択電極に近接させた構造を
もつものがある。この形式の尿素電極は、１試料の測定
に要する時間が長いという問題点ケ有する。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、このような型式の尿素電極において、
■試料の測定に要する時間全短編し得る尿素電極及びそ
の製造方法を提供することにある。
〔発明の概要〕
従来の尿素電極本体の構造を模式的に第１図に示す。こ
の酵素電極による尿素の測定原理を簡単に述べると以下
になる。試料溶液５に含まれる尿素はウレアーゼ固定化
膜１で分解されアンモニウムイオンが生じる。生じたア
ンモニウムイオンの部をアンモニウムイオン感応膜２、
内部電解／Ｖｉ、３及び銀塩化銀電極４で構成されるア
ンモニウムイオン選択性電極で計測する。このような電
極は、例えばＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ、４９
．　１０６７　〜１０７８　（１９７７）などに記載さ
れている。
この電極において、測定所要時間はウレアーゼ固定化膜
の尿素及びアンモニウムイオン透過能に依存する。とく
に後者の影響が太きい。
発明者らは、ウレアーゼ固定化膜の構造が同じである場
合では、アンモニウムイオン透過能力ウレアーゼ固定化
膜の構造体表面の化学的性質により太きく左右されるこ
と、特に構造体表面にアミノ基の量が多いとアンモニウ
ムイオン透過能が高いことを、実験から新たに発見した
。
したがって、ウレアーゼ固定化膜の構造体表面にアミン
基を導入することにより、尿素電極の測定所要時間を短
縮できる。
本発明の要点は、アンモニウムイオンの透過能の高いウ
レアーゼ固定化膜を用いることにあり、アンモニウムイ
オン選択性電極に限らず、直接であれ間接であれアンモ
ニウムイオンを測定する電極であれは、本発明を適用で
きるのはもちろんのことである。そのような電極の一例
は、Ａｎａ　−１ｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍ、　４９．
１０６７〜１０７８（１９７７）などに記載されている
。
〔発明の実施例〕
以下、本発明の一実施例を詳細に説明する。
第２図は本実施例で用いた尿素電極の本体部分の構成図
である。図において、１３Ｕ酵素電極、１４は参照電極
、１５はアース電極、１はウレアーゼ固定化膜、２はア
ンモニウムイオン感応膜、６及び７はイオン透過膜、４
．８及び９は銀塩化銀電極、３．１０及び１１は電解質
液、１６は細管、１７は緩ｆＦＪ液、１８は緩衝液の流
れの方向を示す矢印である。
細管１６に緩衝液をキャリアとして血液等の試料を少量
（例えは１ｏμｔ）流してやると、試料中に含まれる尿
素は酵素電極１３のウレアーゼ固定化膜１に接したさい
に加水分解され、アンモニウムイオンが生じる。アンモ
ニウムイオンはアンモニウムイオン感応膜２の膜電位を
変化させ、その結果、酵素電極１３と参照電極１４の間
に試料中の尿素濃度に依存した電位変化が生じる。この
電位変化は、時間的に緩ｆｉＪ液のみを流した時をベー
スラインとした山型の変化として観測される。
山域変化の出初めからベースライ／に戻るまでを一試料
の測定に少する時間とみなすことができる。
ウレアーゼ固ｆ化膜１としては、ウレアーゼ（べ−リン
ガー製）　４０　ｍ　ｇとアルブミ／（ウシ、生化学工
業）　８０　ｍ　ｇ　ｋ　０．２　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）１ｍｔに溶解し、これに２．５％グルタル−
ｒルテヒド水溶ｇ、２８０μｔを適量加えたあと、ガラ
ス平板上に延展した後、１０分間以上静置してゲル化製
膜し、ガラス平板よりはく離したあと、塩酸で中和した
０、１〜１０％のエチレンジアミン水溶液中に３０秒〜
１ｏ分間浸漬処理したものを用いた。
このウレアーゼ固定化膜を用いると、エチレンジアミ／
水溶液で浸漬処理をしなかったウレアーゼ固定化膜ヲ用
いた場合に比べて、１０％以上測定７ｖＴ要時間が短縮
された、また異なる効果として′電極出力が５〜３０％
増大することも認められた。
さらに具体的に実施例を述べると、２％のエチレンジア
ミンで処理したとき、膜体積１ｃｎｎ３あたり１０１９
個のアミノ基衡有する膜が得られた。未処理のものは、
膜中の了ミノ基数が１０１７個／Ｃｒｎ３であり、未処
理膜で尿素窒素濃ｉ’ｌｏｏｍｇ／ｄｔの測定に７０秒
要したものが、処理膜では５５秒に短縮された。
エチレンジアミン水溶液に代えて、ポリリジン水溶液に
上記のフレアーゼゲル化膜を浸漬して、その効果を実験
的に横側した。ポリリジンとしては、その分子量範囲が
異なるものを各種用意して用いた。その結果、分子量３
０００以下のポＩＪ　ＩＪレジン溶液を用いた場合で、
エチレンジアミンと同様の短時間処理で、同様の効果を
認めた。特に良好であったのは、分子１ＪＯＯＯ以下の
ボＩＪ　ＩＪレジン用いた場合であった。
平均分子量１０００のポリリジンの０．５％溶液で処理
したとき、１０”ｆ［ｉＭ／ｃ−ｎ＋’　　のアミン基
を有する膜が得られ、尿素窒素濃度１００ｍｇ／ｄ２の
試料の測定に要する時間Ｖｊ、５０秒であバ未処理膜の
７０神に比べ著しく短縮された。
次に、ウレーｒ−ゼのゲル化膜のエチレンジアミン処理
時間を変えることによる付加したアミン基の個数の異な
る各種のウレ了−ゼ１１１走化１１Ｍを用意し、それぞ
れの１．尿素電極としての特性を検討した結果、膜の体
ｆ（ｉ　１　ｃｗ＋　３あたり１０’δ個以上のアミン
：Ｉ′ｉ−を有する膜で良好な特注を示した。なお、こ
れまで述べたアミ７基の数の計測は、膜をフルオレツセ
インイソチオンア２・−ト溶液に浸漬して螢光費色を行
ない、この螢光量ケ求めることによって行なった。アミ
ン基の数の標準試料としては、１情度の異なる各楡のア
ルブミン水溶液を熱硬化さ−「た膜を作り、これに同様
の螢光染色を行なったものを用いた。この方法によるア
ミン基の定量は、±２０％程度の誤差があり、正蒋な絶
対値を得るのは困難であるが、桁数は、正確に測定でき
る。
上記実施例では、エチレンシアミン、リジンなどの例を
述べたが、他にクアニジン等のような１分子中に２ヶ以
上のアミノ基を有する物質でウレアーゼ固定化膜の構造
体表面全般にわたってアミン基を付加するものはエチレ
ンジアミンと同様の用い方をすることによシ同様の効果
を示した。
〔発明の効果〕
本発明によれば、−試料の測定所要時間を短縮できるの
で、単、位時間内に多数の試料を測定できるという効果
がある。
さらに、本発明によれは、電極出力が増大されるので、
感度向上の効果がある。
【図面の簡単な説明】
第１図は尿素電極本体の構造を示す模式図、第２図は尿
素電極の構成を示す概念図である。 １・・・ウレアーゼ固定化膜、２・・・アンモニウムイ
オン感応膜、３，１０．１１・・・電解質液、４，８゜
９・・・銀塩化銀電池、６，７・・・イオン透過膜、１
３・・・酵素電極、１４・・・参照電極、１５・・・ア
ース電極、１６・・・細管。 Ｙ　１　図 某２図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　ウレアーゼ固定化膜とアンモニウムを定ｔｔ−る
    電極とから成る尿素電極において、ウレアーゼ固定化膜
    にアミン基を付加してなることを特徴とするウレアーゼ
    固定化尿素電極。 ２、上記アミン基を付加したウレアーゼ固定化膜は、膜
    の体積１ｃｒｎ３あたり１０１８個以上のアミン基を有
    するものである特許請求の範囲第１項記載の尿素電極。 ３、上記ウレアーゼ固定化膜は、グルタルアルデヒドで
    ウレアーゼを固定化した膜である特許請求の範囲第１項
    又は第１項記載の尿素電極。 ４、　ウレアーゼ固定化膜とアンモニウムを定量する電
    極とから成る尿素電極の製造方法において、上記ウレア
    ーゼ固定化膜を１分子中に２個以上のアミノ基を有する
    化合物の水溶液に浸漬することによりアミン基を付加し
    たことを特徴とする尿素電極の製造方法。 ５、上記アミノ基を有する化合物が、分子量３０００以
    下の化合物である特許請求の範囲第４項記載の尿素電極
    の製造方法。 ６、上記アミノ基を肩する化合物がエチレンジアミンで
    ある特許請求の範囲第４項記載の尿素電極の製造方法。 ７、上記アミン基を有する化合物がリジンである特許請
    求の範囲第４項記載の尿素電極の製造方法。
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