JPH0363018B2 - - Google Patents

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JPH0363018B2
JPH0363018B2 JP57173226A JP17322682A JPH0363018B2 JP H0363018 B2 JPH0363018 B2 JP H0363018B2 JP 57173226 A JP57173226 A JP 57173226A JP 17322682 A JP17322682 A JP 17322682A JP H0363018 B2 JPH0363018 B2 JP H0363018B2
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membrane
urease
immobilized
urea
electrode
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Daizo Tokinaga
Teruaki Kobayashi
Akiko Katori
Kichiji Karasawa
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Hitachi Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/817—Enzyme or microbe electrode

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は溶液中に溶存する尿素を測定する酵素
電極及びその製造方法に係り、特に短時間で尿素
を定量するのに好適な酵素電極及びその製造方法
に関する。
〔従来技術〕
基質（測定対象物質）に対する反応特異性の高
い酵素を固定化し、これとイオン電極等とを組合
せた酵素電極は10数年前に開発され（G.G.
Guilbault ：“Handbook of Enzymatic
Method of Analysis“Marcel Dekker，New
YorK（1976）近年その一部が実用段階に達した。
このような酵素電極の一つに、尿素を測定対象物
質とする尿素電極がある。尿素電極としていくつ
かの形式の異なるものがあるが、、そのなかの一
つに、酵素としてウレアーゼを用い、これを固定
化した酵素膜をアンモニウムイオン選択電極に近
接させた構造をもつものがある。この形式の尿素
電極は、１試料の測定に要する時間が長いという
問題点を有する。
〔発明の目的〕
本発明の目的は、このような型式の尿素電極に
おいて、１試料の測定に要する時間を短縮し得る
尿素電極及びその製造方法を提供することにあ
る。
〔発明の概要〕
従来の尿素電極本体の構造を模式的に第１図に
示す。この酵素電極による尿素の測定原理を簡単
に述べると以下になる。試料溶液５に含まれる尿
素はウレアーゼ固定化膜１で分解されアンモニウ
ムイオンが生じる。生じたアンモニウムイオンの
量をアンモニウムイオン感応膜２、内部電解液３
及び銀塩化銀電極４で構成されるアンモニウムイ
オン選択性電極で計測する。このような電極は、
例えばAnalytical Chem.49，1067〜1078（1977）
などに記載されている。
この電極において、測定所要時間はウレアーゼ
固定化膜の尿素及びアンモニウムイオン透過能に
依存する。とくに後者の影響が大きい。
発明者らは、ウレアーゼ固定化膜の構造が同じ
である場合では、アンモニウムイオン透過能がウ
レアーゼ固定化膜の構造体表面の化学的性質によ
り大きく左右されること、特に構造体表面にアミ
ノ基の量が多いとアンモニウムイオン透過能が高
いことを、実験から新たに発見した。
したがつて、ウレアーゼ固定化膜の構造体表面
にアミノ基を導入することにより、尿素電極の測
定所要時間を短縮できる。
本発明の要点は、アンモニウムイオンの透過能
の高いウレアーゼ固定化膜を用いることにあり、
アンモニウムイオン選択性電極に限らず、直接で
あれアンモニウムイオンを測定する電極であれ
ば、本発明を適用できるのはもちろんのことであ
る。そのような電極の一例は、Analytical
Chem.49，1067〜1078（1977）などに記載されて
いる。
〔発明の実施例〕
以下、本発明の一実施例を詳細に説明する。
第２図は本実施例で用いた尿素電極の本体部分
の構成図である。図において、１３は尿素電極、
１４は参照電極、１５はアース電極、１はウレア
ーゼ固定化膜、２はアンモニウムイオン感応膜、
６及び７はイオン透過能、４，８及び９は銀塩化
銀電極３，１０及び１１は電解質液、１６は細
管、１７は緩衝液、１８は緩衝液の流れの方向を
示す矢印である。
細管１６に緩衝液をキヤリアとして血液等の試
料を少量（例えば10μ）流してやると、試料中
に含まれる尿素は酵素電極１３のウレアーゼ固定
化膜１に接したさいに加水分解され、アンモニウ
ムイオンが生じる。アンモニウムイオンはアンモ
ニウムイオン感応膜２の膜電位を変化させ、その
結果、酵素電極１３と参照電極１４の間に試料中
の尿素濃度に依存した電位変化が生じる。この電
位変化は、時間的に緩衝液のみを流した時をベー
スラインとした山型の変化として観測される。山
型変化の出初めからベースラインに戻るまでを一
試料の測定に要する時間とみなすことができる。
ウレアーゼ固定化膜１としては、ウレアーゼ（ベ
ーリンガー製）40mgとアルブミン（（ウシ、生化
学工業）80mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH7.4）１ml
に溶解し、これに2.5％グルタルアルデヒド水溶
液280μを適量加えたあと、ガラス平板上に延
展した後、10分間以上静置してゲル化製膜し、ガ
ラス平板よりはく離したあと、塩酸で中和した
0.1〜10％のエチレンジアミン水溶液中に30秒〜
10分間浸漬処理したものを用いた。
このウレアーゼ固定化膜を用いると、エチレン
ジアミン水溶液で浸漬処理をしなかつたウレアー
ゼ固定化膜を用いた場合に比べて、10％以上測定
所要時間が短縮された、また異なる効果として電
極出力が５〜30％増大することも認められた。
さらに具体的に実施例を述べると、２％のエチ
レンジアミンで処理したとき、膜体積１cm3あたり
1019個のアミノ基を有する膜が得られた。未処理
のものは、膜中のアミノ基数が1017個／cm3であ
り、未処理膜で尿素窒素濃度100mg／dlの測定に
70秒要したものが、処理膜では55秒に短縮され
た。
エチレンジアミン水溶液に代えて、ポリリジン
水溶液に上記のウレアーゼゲル化膜を浸漬して、
その効果を実験的に検討した。ポリリジンとして
は、その分子量範囲が異なるものを各種用意して
用いた。その結果、分子量3000以下のポリリジン
水溶液を用いた場合で、エチレンジアミンと同様
の短時間処理で、同様の効果を認めた。特に良好
であつたのは、分子量1000以下のポリリジンを用
いた場合であつた。
平均分子量1000のポリリジンの0.5％溶液で処
理したとき、1019個／cm3のアミノ基を有する膜が
得られ、尿素窒素濃度100mg／dlの試料の測定に
要する時間は50秒であり、未処理膜の70秒に比べ
著しく短縮された。
次に、ウレアーゼのゲル化膜のエチレンジアミ
ン処理時間を変えることによる付加したアミノ基
の個数の異なる各種のウレアーゼ固定化膜を用意
し、それぞれの尿素電極としての特性を検討した
結果、膜の体積１cm3あたり118個以上のアミノ基
を有する膜で良好な特性を示した。なお、これま
で述べたアミノ基の数の計測は、膜をフルオレツ
セインイソチオシアネート溶液に浸漬して螢光染
色を行ない、この螢光量を求めることによつて行
なつた。アミノ基の数の標準試料としては、濃度
の異なる各種のアルブミン水溶液を熱硬化させた
膜を作り、これに同様の螢光染色を行なつたもの
を用いた。この方法によるアミノ基の定量は、±
20％程度の誤差があり、正確な絶対値を得るのは
困難であるが、桁数は、正確に測定できる。
上記実施例では、エチレンジアミン、リジンな
どの例を述べたが、他にグアニジン等のような１
分子中に２ケ以上のアミノ基を有する物質でウレ
アーゼ固定化膜の構造体表面全般にわたつてアミ
ノ基を付加するものはエチレンジアミンと同様の
用い方をすることにより同様の効果を示した。
〔発明の効果〕
本発明によれば、一試料の測定所要時間を短縮
できるので、単位時間内に多数の試料を測定でき
るという効果がある。
さらに、本発明によれば、電極出力が増大され
るので、感度向上の効果がある。
【図面の簡単な説明】
第１図は尿素電極本体の構造を示す模式図、第
２図は尿素電極の構成を示す概念図である。 １…ウレアーゼ固定化膜、２…アンモニウムイ
オン感応膜、３，１０，１１…電解質液、４，
８，９…銀塩化銀電池、６，７…イオン透過膜、
１３…酵素電極、１４…参照電極、１５…アース
電極、１６…細管。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ウレアーゼ固定化膜とアンモニウムイオン感
    応膜とが近接して配置されて成り、尿素が上記ウ
    レアーゼ固定化膜に接して加水分解され生じるア
    ンモニウムイオンを定量する尿素電極において、
    上記ウレアーゼ固定化膜はウレアーゼが固定化さ
    れた膜にさらにアミノ基が付加されて成ることを
    特徴とするウレアーゼ固定化尿素電極。 ２ 上記アミノ基を付加したウレアーゼ固定化膜
    は、膜の体積１cm3あたり1018個以上のアミノ基を
    有するものである特許請求の範囲第１項記載の尿
    素電極。 ３ 上記ウレアーゼ固定化膜は、グルタルアルデ
    ヒドでウレアーゼを固定化した膜である特許請求
    の範囲第１項又は第２項記載の尿素電極。 ４ ウレアーゼ固定化膜とアンモニウムイオン感
    応膜とが近接して配置されて成る尿素電極の製造
    方法において、上記ウレアーゼ固定化膜の製造工
    程はグルタルアルデヒドでウレアーゼを固定化し
    たゲル化膜を形成する工程と、１分子中に２個以
    上のアミノ基を有する化合物の水溶液に上記ゲル
    化膜を浸漬することにより上記ゲル化膜にアミノ
    基を付加する工程を有することを特徴とする尿素
    電極の製造方法。 ５ 上記アミノ基を有する化合物が、分子量3000
    以下の化合物である特許請求の範囲第４項記載の
    尿素電極の製造方法。 ６ 上記アミノ基を有する化合物の水溶液は0.1
    〜10％のエチレンジアミン水溶液である特許請求
    の範囲第４項記載の尿素電極の製造方法。 ７ 上記アミノ基を有する化合物がエチレンジア
    ミン、ポリリジン、グアニジンのいずれか一つで
    ある特許請求の範囲第４項記載の尿素電極の製造
    方法。
JP57173226A 1982-10-04 1982-10-04 ウレア−ゼ固定化尿素電極およびその製造方法 Granted JPS5963554A (ja)

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