JPH0418624B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は感光性樹脂を用いて水素イオン感応性
電界効果型トランジスタ（PH−ISFET）のイオ
ン感応面上にグルコースオキシダーゼ固定化膜を
形成せしめた新規なグルコース測定用酵素センサ
の製造方法に関するものである。

血液や尿等体液中のグルコース濃度の測定は臨
床診断上非常に重要であり、これまで各種のグル
コース定量法の開発や改良が行なわれてきた。そ
の中でグルコースオキシダーゼ固定化膜と過酸化
水素電極等の各種電極を組合せて迅速かつ連続測
定の可能ないわゆる酵素センサが種々提案されて
いる。

グルコース測定用酵素センサのひとつとして提
案されているグルコース固定化膜と過酸化水素電
極とを組合せた方式のセンサについてその動作を
説明する。この酵素センサはグルコースオキシダ
ーゼを包括固定化した膜やグルタルアルデヒドで
架橋して固定化した膜を過酸化水素電極の感応部
に装着して製作することができるものである。試
料液中のグルコースは、グルコース固定化膜内で
次式(1)に従つてグルコノ−δ−ラクトンと過酸化
水素に分解され、前者はさらに グルコン酸に加水分解される。試料液中にグルコ
ースが含まれていると反応式(1)により過酸化水素
が生成するので、その過酸化水素を過酸化水素電
極で定量することによつてグルコース濃度の測定
が可能である。

この種のグルコースセンサについては小型化の
試みが種々に行われているが、下地電極を小型化
することが困難であるためグルコースセンサの小
型化は本来的に容易ではない。さらに１個のセン
サでグルコースとともに種々の基質を同時に測定
できるマルチセンサとすることは極めて困難であ
る。またグルコースオキシダーゼ固定化膜を別個
に調製後下地電極に装着する必要がある等製作法
が煩雑であり、さらに構造も複雑なものとなる等
の欠点があつた。

本発明は上記のような従来のものの欠点を除去
するためになされたもので、感光性樹脂を用いて
グルコースオキシダーゼ固定化膜をPH−ISFET
のイオン感応面に直接形成することにより、小型
化、マルチセンサ化が容易で、かつ簡便な製作法
で作ることができるグルコースセンサの製造方法
を提供することを目的としている。

本発明は、２つの水素イオン感応性電界効果型
トランジスタと参照電極とを１つの基板上に形成
し、次いで、上記一方の水素イオン感応性電界効
果型トランジスタのイオン感応面に、グルコース
オキシダーゼを含む感光性樹脂溶液を直接塗布、
硬化してグルコースオキシダーゼ固定化膜を形成
することを特徴とするグルコースセンサの製造方
法である。

また、本発明の別の発明は、２つの水素イオン
感応性電界効果型トランジスタと参照電極とを１
つの基板上に形成し、次いで、上記一方の水素イ
オン感応性電界効果型トランジスタのイオン感応
面に、グルコースオキシダーゼを含む感光性樹脂
溶液をフオトリゾグラフイー技術を用いてパター
ニングしてグルコースオキシダーゼ固定化膜を形
成することを特徴とするグルコースセンサの製造
方法である。

本発明では上記グルコースオキシダーゼ固定化
膜を、グルコースオキシダーゼを含む感光性樹脂
をPH−ISFETのイオン感応面に直接塗布硬化す
ることができ、またフオトリゾグラフイー技術に
よりPH−ISFETのイオン感応面にパターニング
することができる。

本発明では非常に小さい（数ミリ程度）PH−
ISFETを用い、そのイオン感応面に限定してグ
ルコースオキシダーゼ固定化膜を形成させるの
で、感光性樹脂を用いて光照射個所を限定するこ
とにより、必要な場所のみにグルコースオキシダ
ーゼ固定化膜を形成させることが可能である。

次に本発明の製造方法によるグルコースセンサ
を図によつて説明する。

第１図は本発明によるグルコースセンサの下地
電極としたPH−ISFET素子の斜視図である。下
地電極であるPH−ISFET素子１はソース２及び
４、ドレイン３及び５、擬似参照電極６、及びリ
ード線７を備える。このPH−ISFET素子はソー
ス２とドレイン３からなる１個のPH−ISFET
（Ａ）、ソース４及びドレイン５からなるもう１個
のPH−ISFET（Ｂ）並びに（擬似）参照電極６か
ら構成される複合型PH−ISFET素子である。こ
の素子は通常の金属酸化物型電界効果トランジス
タの製造法に準拠して製作できる。ここで擬似参
照電極６は金の蒸着膜である。PH−ISFET素子
を水溶液中で動作させるには、このPH−ISFET
素子の電位を水溶液に対して一定に保つ必要があ
るため、参照電極を用いる必要がある。このた
め、通常水溶液に対して安定な電位を示す飽和か
んこう電極や銀／塩化銀電極などがPH−ISFET
素子に対する参照電極として使用できる。しか
し、後述するように、本発明では２個の独立に作
用するPH−ISFET（第１図ではPH−ISFET（Ａ）
及び（Ｂ）を使用し、その間の差動出力を酵素セ
ンサの出力とするため、金や白金などの金属電極
例えば金属の蒸着膜を擬似参照電極として使用で
きる。なぜなら、これらの金属電極の水溶液に対
する電位の不安定性は、２個のPH−ISFETの差
動出力を取る方式のための相殺され、差動出力に
その不安定性に基づく雑音は実質上殆んど混入す
ることがないからである。さらに、金属電極を用
いることにより、通常の参照電極では困難な参照
電極自体の小型化が容易であり、また、金属蒸着
等の方式で作成できるため、PH−ISFET素子を
製造する半導体製造プロセスを用いて容易に製作
できるという利点も生じる。第１図に示したPH−
ISFET素子では、２個のPH−ISFET（Ａ）及び
（Ｂ）と共に、擬似参照電極としての金などの蒸
着膜を半導体製造プロセスで同時に製作したもの
である。このように、参照電極としては通常の飽
和かんこう電極等も使用することはできるが、上
記のような金属電極の方が好適に使用できる。PH
−ISFET（Ａ）及びPH−ISFET（Ｂ）は各々単独
で水素イオンに感応するもので、ソース・ドレイ
ン間に一定電圧をかけて両者の間を流れる電流を
測定するか、又はソース・ドレイン間に一定電流
を流すために必要なソース電圧を測定することに
よつて、溶液中のPH（水素イオン濃度）を測定す
ることが可能である。

次に、PH−ISFET（Ａ）の第２図８の部分にグ
ルコースオキシダーゼ固定化膜を装着し、もう一
方のPH−ISFET（Ｂ）にはそれを装着しない方式
でグルコースセンサを製作する。試料溶液中にグ
ルコースがあれば前記の式(1)に従つてグルコース
が分解され、グルコースオキシダーゼ固定化膜内
のPHは、グルコースオキシダーゼ固定化膜のない
PH−ISFET（Ｂ）でモニタされる試料溶液自体の
PHと差を生じることになる。従つて、このグルコ
ースセンサは、２個のPH−ISFET（Ａ）及び
（Ｂ）それぞれのソース・ドレイン間に一定電流
を流すために必要なソース電圧を測定し、両PH−
ISFETのソース電圧の差動出力を増幅すること
によつて、試料溶液中のグルコース濃度を測定す
ることができる。

以下に実施例を基づき本発明を説明する。

実施例 １ ポリビニルアルコールの水酸基にＮ−メチル−
ｐ−ホルミルスチリルピリジニウムメトサルフエ
ートを付加した（付加率はポリビニルアルコール
の水酸基に対して0.8モル％）感光性樹脂（市村、
特開昭56−5761号に記載）の５重量％水溶液を調
製した。この水溶液0.2mlにグルコースオキシダ
ーゼ５mlを溶解し均一な溶液とした。この酵素・
感光性樹脂混合水溶液を第２図中８の部分に示す
ようにソース２とドレイン３から成るPH−
ISFETのチヤンネル部分すなわちイオン感応面
を覆うように広く塗布し、スピナーを用いて均一
な膜にするとともに乾燥せしめた。その後、
340nm以下の液長の光をカツトした350Wの水銀
灯を用い、５分間酵素・感光性樹脂混合物を光照
射してグルコースオキシダーゼ固定化膜を形成し
た。

以上のようにして作製したグルコースオキシダ
ーゼセンサの応答特性を、0.02Mりん酸緩衝液
（PH5.1）を用いてグルコース濃度５〜1000mg／
の範囲で検討した。第３図にグルコース濃度200
mg／における本例グルコースセンサの応答曲線
を図示する。第４図中曲線Ａはこのグルコースセ
ンサの検量線を示す。第３図からわかるようにこ
のグルコースセンサの応答は迅速であり、かつ第
４図曲線Ａからわかるように５〜600mg／の範
囲のグルコース濃度に対して直線応答する。また
検出下限は５mg／であつた。またこのセンサの
寿命を評価したところ、１日10回測定するという
条件で25日経過後の出力低下は３％以下であり、
寿命も充分長いものであつた。

実施例 ２ 実施例１に述べた５重量％の感光性樹脂水溶液
0.2mlに20mgのグルコースオキシダーゼと20mgの
牛血清アルブミンを加え均一な溶液とした。この
溶液を実施例１と同様に第２図に示したようにソ
ース２とドレイン３から成るPH−ISFETのイオ
ン感応面上にグルコースオキシダーゼ固定化膜８
を成膜した。次にこのグルコースオキシダーゼ固
定化膜の機械的強度を増大させる操作を行なつ
た。すなわち、25％のグルタルアルデヒド水溶液
中にグルコースオキシダーゼ固定化膜を15分間浸
漬し、たん白質分子間を共有結合により相互架橋
した。このグルコースオキダーゼ固定化膜を充分
水洗し、さらに残存するグルタルアルデヒドを除
くために0.1モル％のグリシン水溶液に15分間浸
漬した。次いでこのグルコースセンサを水洗し
た。

このように製作したグルコースセンサの応答特
性を0.02Mのりん酸緩衝液（PH5.1）を用いて評
価した。第４図中曲線Ｂに示したものはこのセン
サの検量線である。直線応答域、検出下限は実施
例１とほぼ同等であつたが応答量は約2/3となつ
た。なお寿命についても実施例１のものと同等で
あつた。

実施例 ３ 実施例１に述べた５重量％の感光性樹脂水溶液
0.2mlに５mgのグルコースオキシダーゼを加え均
一な溶液とした。この溶液を実施例１と同様に第
２図に示したようにソース２とドレイン３からな
るPH−ISFETのイオン感応面を覆うように塗布
し、スピナーを用いて酵素・感光性樹脂混合物を
均一な膜にするとともに乾燥せしめた。次いで第
５図の９に示した部分にのみ光を照射するマスク
を用いて、イオン感応面およびその周辺のみグル
コースオキシダーゼ固定化膜を形成した。光照射
は実施例１で述べたものと同一の装置及び条件に
より行つた。

このようにしてイオン感応面にのみグルコース
オキシダーゼ固定化膜をパターンニングしたグル
コースセンサの応答特性や寿命は実施例１で述べ
たものと同等であつた。

以上の実施例では、感光性樹脂としてＮ−メチ
ル−ｐ−ホルミルスチリルピリジニウムメトサル
フエートをペンダントに有するポリビニルアルコ
ールを用いたが、グルコースオキシダーゼを失活
せずに固定化できる感光性のものであればいずれ
のものでも同様の効果を奏する。例えばポリエチ
レングリコールジメタクリレート（増感剤として
例えばベンゾインエチルエーテルを加えたもの）、
ポリビニルアルコール（架橋剤としてジアジド化
合物を混合したもの）が使用できる。またゲート
電圧を与えるものとして貴金属を用いたが、銀・
塩化銀電極等の安定な参照電極を用いても良い。

以上のように本発明によれば、感光性樹脂を用
いてPH−ISFET上に直接グルコースオキシダー
ゼ固定化膜を形成したので、小型化、マルチセン
サ化が容易でかつ製作法が簡便であり、さらに充
分な寿命を有するグルコースセンサが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるグルコースセンサの下地
電極であるPH−ISFET素子の斜視図、第２図は
本発明の一実施例によるグルコースセンサの斜視
図、第３図は第２図に示す本発明によるグルコー
スセンサの応答曲線を示す線図、第４図は実施例
１及び２におけるグルコースセンサの検量線を示
す線図、第５図は実施例３におけるグルコースセ
ンサの斜視図である。図中、 １……PH−ISFET素子、２，４……ソース、
３，５……ドレイン、６……（擬似）参照電極、
７……リード線、８，９……グルコースオキシダ
ーゼ固定化膜。なお、各図中同一符号は同一また
は相当部分を示すものとする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ２つの水素イオン感応性電界効果型トランジ
   スタと参照電極とを同一の基板上に形成し、次い
   で、 上記一方の水素イオン感応性電界効果型トラン
   ジスタのイオン感応面に、グルコースオキシダー
   ゼを含む感光性樹脂溶液を直接塗布、硬化してグ
   ルコースオキシダーゼ固定化膜を形成することを
   特徴とするグルコースセンサの製造方法。 ２ ２つの水素イオン感応性電界効果型トランジ
   スタと参照電極とを同一の基板上に形成し、次い
   で、 上記一方の水素イオン感応性電界効果型トラン
   ジスタのイオン感応面に、グルコースオキシダー
   ゼを含む感光性樹脂溶液をフオトリゾグラフイー
   技術を用いてパターニングしてグルコースオキシ
   ダーゼ固定化膜を形成することを特徴とするグル
   コースセンサの製造方法。