JPH0285755A - 免疫センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術的分野］ 本発明は新規な免疫センサ、および希薄濃度の抗原また
は抗体を短時間で検出できる免疫反応検出方法に関する
。

［発明の背蹟１ 近年、被検体液中に含まれる微少量の抗原または抗体を
検出する種々の方法が提案されている。

それらは大別すると、標識剤を用いる方式と標識剤を用
いない方式とに分類される。標識方式の具体例としては
、酵素免疫法（ＥＩＡ＞、放射性同位元素標識免疫法（
ＲＩＡ）、蛍光色素標識免疫法（ＦＩＡ）などが知られ
ている。これらは一般に煩雑な操作手順や発色試薬また
は特殊な設備を必要とする欠点があった。

一方、非標識免疫法としてはこれまで、膜表面に抗体ま
たは抗原を固定化し、抗原抗体反応後の膜表面電位を測
定する膜電位方式（例えば、相沢。

銘木ら、Ｊ　、　Ｍ　ｅｍｂ、Ｓ　ｃｉ、、　２　（１
９７７）　　１２５参照）と金ＪＩ？ｉ電極表面に直接
または膜を介して抗体あるいは抗原を結合し、抗原抗体
反応に伴う電極電位の変動を電極電位測定法（例えば、
山水１埋村ら日本化学会誌、（１９８０）　１５６２参
照）とが提案されている。これらの免疫電極は抗原また
は抗体を直接、簡便に測定できるがいずれも応答時間が
３０分以上かかり、検出される電気信号の強度も一般に
低い。さらに具体的な問題点として、抗体や抗原が固定
された電極に被検体液を触れさせて抗原抗体反応を起こ
すに際して、上記電極を被検体液中に浸漬して撹拌する
と、必要とされる被検体量が多くなり、撹拌に伴う電気
信号ノイズやドリフトも発生しやすい。また、上記電極
上に少量の被検体液を滴下して検出を行う場合も、滴下
に伴う電気信号ノイズの発生が見られ再現性の良い安定
な検出を行うことが困難であった。

［発明の構成１ 本発明はかかる状況に鑑みてなされたものである。ずな
わら、本発明者らは抗原や抗体を直接、簡便に検出する
に当り、電気信号ノイズの発生を伴わないようにする方
法を鋭意検討の結果、本発明に到達したものである。す
なわち、本発明は１、　抗原または抗体を固定した電極
上に更にゲル状電解質層が設けられた作用電極を有する
免疫センサ。

２、　当該作用電極が、金属電極、およびその上に形成
されたごロール、アニリン、チオフェンおよびそれらの
誘導体から選ばれた化合物のポリマーから成る導電性高
分子、およびそのポリマーに包括固定された抗原または
抗体からなる上記免疫センサ。

３、　当該作用電極が、ＭＯＳＦＥＴのゲート領域に設
けられたピロール、アニリン、チオフェンおよびそれら
の誘導体から選ばれる化合物のポリマーから成る導電性
高分子、およびそのポリマーに包括固定された抗原また
は抗体からなる上記免疫センサ。

４、　当該作用電極がＭＯＳＦＥＴのゲート部分以外に
導電性配線を介して分離して設けられている上記１〜３
項記載の免疫センサ。

５、　比較電極が当該作用電極の抗体または抗原物質を
不活性化したものである上記１〜３項記載の免疫センサ
。

６、　当該作用電極と比較電極との間の電位差を増幅し
て、電圧、電流または電荷量として検出する手段を有す
る上記１〜５項記載の免疫センサ、および ７、　抗体または抗原を固定した作用電極と参照電極と
を抗原または抗体を含む被検体水溶液と接触させ、当該
作用電極上での抗原抗体反応に伴う電位変化を電位変化
、電流変化または電荷１変化とじて検出する免疫反応検
出方法 である。

本発明において用いられる作用電極としては数μＶ〜数
ｒｎ−Ｖの電位変化を検出でき、界面電位の安定したも
のであれば使用できる。具体的な例としては、白金、金
、パラジウム、ニッケル、カーボン、クロム、タンタル
、イリジウムなどが挙げられる。これらの金属電極の形
態は平板、多孔質体、フィラメントおよびスポンジなど
のいずれでも構わない。また、これらの金属は直接、作
用電極として用いることはもちろん、電界効果型トラン
ジスタ（ＦＥＴ）のソースおよびドレイン電極として用
いることも可能である。本発明の作用電極としては金お
よび白金が好ましい。また、ゲート部に金属を用いる場
合は金、白金以外にイリジラムも好適に用いられる。こ
れらのゲート金属はＦＥＴチップから分離されたいわゆ
る分離ゲート型ＦＥＴとして用いることも可能である。

本発明に用いられる比較電極用の金属としては、本質的
には上記作用電極に用いた金属が使用できる。好ましく
は、比較電極と作用電極の金属は同一である。作用電極
上には抗体または抗原が固定されており、比較電極上に
は活性を無くした上記の抗体Ｊ３よび抗原が固定される
。

次に、本発明に用いられる抗体や抗原物質は、免疫反応
に関わるものであって分子内にイオン性基を有し、１０
０μＶ以上、好ましくは１ｍＶ以上のＩＩＩ電位を示す
Ｉａ　Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ｌ（ｌ　Ｍ等の免疫グロブ
リンや滅毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）、ガン胎児性
抗原（ＣＥＡ）などが挙げられ、抗体としては、これら
の抗原に対するポリクローナル又はモノクローナルな抗
体が用いられる。

これらの抗原および抗体分子は、単独でまたは他の脂質
分子と組み合わせて薄膜状にしたのら前記の作用電極上
に固定される。該電極上への抗体および抗原の固定化法
としては、浸漬吸着法、流延法、ラングミュア・ブロー
ジェット法や導電性高分子の形成と同時に該高分子中に
包括固定する方法などが採用される。かくして、作用電
極上に抗体または抗原が固定された素子が、抗原または
抗体を含む被検体液と接触すると、該作用電極上での抗
原−抗体反応に伴って、その表面膜電位が変化する。そ
の結果、該膜電位変化量を直接、または電流に変換して
検出することにより抗原や抗体の検出が原理的には可能
となる。しかしながら、前述したとおりこの膜電位変化
を検出するに当り、ノイズやドリフトの発生が見られ、
特に微少信号の検出の際にはこのノイズ発生によるＳ／
Ｎ比の低下が問題であった。これを解決するために、上
記の作用電極上にゲル状電解質層を設けることが本発明
の特徴である。

すなわち、半固体状の電解質層を電極上に設けると、検
体液中のイオン濃度が低くてもスパイクノイズが発生し
ない。従って抗原・抗体反応ににり生じた膜の表面電位
変化が検体液中のイオンによって低減される、いわゆる
イオンシールド効果が押えられる結果、センサーとして
の感度の向上につながることが判明した。このゲル状層
を形成する物質とは、親水性高分子ゲルが代表的なもの
であり、具体的には寒天、アルギン酸ナトリウム。

グアーガム、カラギーナン、ゼラチンなどの天然高分子
化合物：およびポリアクリル酸イオン架橋゛体、グルタ
ルアルデヒドとポリアミンの架橋反応物、ポリアクリル
アミドゲル、塩基性ポリカチオンと強酸性ポリアニオン
とのポリイオンコンプレックスが挙げられる。これらは
ゲル化する前に作用電極上に塗布してゲル層を形成させ
る。このゲル層形成に先立って、上記ゲル層形成性物質
の水溶液中には、予め緩衝液成分や血清アルブミンが添
加される。該ゲル層の形成は通常、常温〜５０℃で３０
分以内に完了する。作用電極上に固定した抗体または抗
原の活性低下を避けるために、ゲルの形成条件はなるべ
く温和な方が良い。また、ゲル層の厚みはとくに制限さ
れないが、好ましくは０．１〜１０ｇｍ、さらに好まし
くは０．５〜５μｌｒＬの範囲が採用される。ゲル層の
厚みがこれ以上になると被検出成分の拡散が遅くなり、
検出に時間がかかる。また、ゲル層の厚みが０．１μｍ
未満になるとゲル層を設けた効果が観測されなくなる。

かくして、電解質を含んだゲル層が前記作用電極りに形
成される。このゲル層上で抗原抗体反応を行うと、後述
の実施例にも見られる様に電気信号ノイズが発生しにく
い。抗原抗体反応を該作用電極上で行うに際しては、被
検体液中に上記電極を挿入して検出を行うことも可能で
あるが、好ましくは少ｉの上記検体液を該作用電極上に
滴下して検出を行う方が効率的である。

かくして、本発明によれば実質的に１０〜１００μ文の
被検体液で検出を行うことも充分可能であり、その検出
感度領域も１０−９〜１０−３！？／−と極めて広い。

また、検出に要する時間も５〜３０分間と比較的短い。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

参考例１ （ヒトＩａＧとアラキン酸メヂルとの混合単分子膜およ
びラングミュア・ブロージェット膜の作成）テフロンコ
ートした水槽中に二回蒸留水を満たし、その表面にアラ
キン酸メチルのりＯロボルム溶液（０，５■／ＩＩ！ｌ
りを１００μ文展開し、単分子膜を形成した。その後、
水槽中にヒトＩｇＧを全体の温度が１０μ９／ｒｄにな
る様に注入したのら、上記単分子膜を１０ｍＮ／ｍに圧
縮した状態で１時間整地した。かくして水中にヒトＩ（
ＩＧの一部を上記単分子膜中に吸着固定した後、ラング
ミュア・ブロージェット法により該単分子膜を本発明の
電極基板上に転写した。

実流例１ スライドガラス基板上に白金を：ａ膜状にスパッタして
電極板とした。この上に、前記参考例１に示した方法に
よって作成したヒトＩ（ＩＧとアラキン酸メチルとの混
合単分子膜をラングミュア・ブロージェット法で二層累
積し、リン酸緩衝液で充分洗浄した。同一寸法の上記電
極を二枚作成し、一方の電極はそのまま作用電極用とし
て用い、もう一方の電極はその上に固定したヒトＩ（Ｉ
Ｇを紫外線照射により失活させた後、比較電極として用
いた。次に、２５ＩＩ＋ｊ！のリン酸緩衝液（ｐＨ６，
８）と牛血清アルブミンを混合した０、７ｉｉ１％の寒
天水溶液を上記作用電極用電極上に塗布したのち、室温
にて放置することによりゲル化させた。このゲル上に１
０−９モル／すの抗ヒトＩｑＧ溶液を５μ磨滴下したと
ころ、何らノイズ信号°の発生を伴わずに１０分後に１
ｍＶの表面電位変化が観測された。

比較例１ 実施例において寒天ゲルを用いる事なく、同一の実験を
行ったところ、非常に大きなスパイク状のノイズ信号が
発生し、抗１ｃ＋Ｇの検出は不可能であった。

実施例２ 実施例１において、ヒトＩ（ＩＧを混合単分子膜力で電
極−Ｌに固定する代わりに、ヒトＩ（ＩＧ（１０ｍｇ／
雇）、ピロール（０，５モル／９．）および塩化カリ（
０，１モル／交）を常法に従い定電位重合（０，６５Ｖ
、通電量０．２クローン／　ｃｉ　、重合温度２５°Ｃ
）を行うことにより、電極上に形成したポリピロール膜
中に固定した。この作用電極用電極上に実施例１と同様
に寒天ゲル層を設けて、抗ヒト１（ＩＧの検出を行った
ところ、ノイズ信号の発生を伴うことなく、１Ｑ−１０
モル／すの濃度まで検出可能であった。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の免疫センサの１例を示すものである。図
中、１はヒトＩ（ＩＧが固定された電極。 ２はゲル状電解質層、３は電極リード線、４は被検液体
である。 図１ ６−〜４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電極、その上又は中に形成された抗原又は抗体含有
   層及び更にその上に形成されたゲル状電解質層からなる
   作用電極を有する免疫センサ。 ２、当該電極が金属成形物及びその上に形成されたピロ
   ール、アニリン、チオフェンおよびそれらの誘導体から
   選ばれた化合物の重合体層からなり；かつ抗原又は抗体
   含有層が、上記重合体層が抗原又は抗体を含有せしめら
   れてなる層である請求項１の免疫センサ。 ３、当該作用電極がＭＯＳＦＥＴのゲート領域を構成し
   ている請求項１又は２の免疫センサ。 ４、当該作用電極がＭＯＳＦＥＴのゲート部分以外に導
   電性配線を介して分離して設けられている請求項１〜３
   記載のいずれかの免疫センサ。 ５、比較電極が当該作用電極の抗体または抗原物質を不
   活性化したものである請求項１〜４記載のいずれかの免
   疫センサ。 ６、当該作用電極と比較電極との間の電位差を増幅して
   、電圧、電流または電荷量として検出する手段を有する
   請求項１〜５記載のいずれかの免疫センサ。 ７、抗体または抗原を固定した作用電極と参照電極とを
   抗原または抗体を含む被検体水溶液と接触させ、当該作
   用電極上での抗原抗体反応に伴う電位変化を電位変化、
   電流変化または電荷量変化として検出する免疫反応検出
   方法。