JPH02179461A - 酵素免疫センサ用膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１Δ且１上Ｉ 本発明は、高感度の酵素免疫センサおよびその製法に関
する。さらに詳細には、測定すべき抗原または抗体を電
極表面で識別し、酵素標識抗原または酵素標識抗体を用
いて、同時に起こる酵素反応を電極電流として測定する
ことが可能なポリチラミン膜を用いた高感度酵素免疫セ
ンサ並びにその製法に関する。

臨床医学の分野において、免疫反応、すなわち抗原−抗
体反応を利用して病気の予防や診断・治療を行うことは
最近では極めて一般化されており、臨床検査においても
、沈降・凝集反応、蛍光抗体法、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）法、エンザイムイムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ
＞法等の方法がすでに確立されている。しかしながら、
これらの方法は、高価な機器を必要としたり、取り扱い
が煩雑である等の難点があり、これら既存の方法による
生体物質の検知、定量を日常的に容易に、例えば、各家
庭で行うことは極めて困難とされている。このような状
況から、近年では、新しい手法を用いた生体物質の検出
法が試みられている。

例えば、Ｇｉａｅｖｅｒらは、ガラス板上のインジウム
微細粒子よりなる薄膜上での抗原抗体反応が起こると光
透過度が著しく変化することを見いだした［Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｉ＋＊ｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１１０　ｐＬ
４２４　（１９７３）］。

Ｄｅ、Ｉ　Ｇａ５ｔｉｌｌｏらは脂質二分子膜上で抗原
抗体反応が起こると膜の電気抵抗が減少することを報告
している［５ｃｉｅｎｃｅ、　１５３　ｐ１８３　（１
９６Ｑ］、　　給水・和訳らは、抗原ないし抗体を酢酸
セルロース膜に固定し、膜電位変化を測定することによ
り生体ｅＡＨの検出を行っている［　Ｊ、　Ｍｅ＠ｂｒ
ａｎｃｅ　Ｓｃ　ｉ、　、　２ｐ１２５　（１９７７）
１．　　また５　山本・埋材らは、抗原または抗体を固
定化した化学修飾電極を用いて、免疫反応による電極電
位の変化から測定生体物質の検出が可能なことを示して
いる［日本化学会誌１５６２　（１９８０）］、　　こ
のようにして、抗体の抗原識別機能と抗原結合反応を巧
みに利用することによって提案されたのが免疫センサで
ある。

免疫センサは、上述のごとく、免疫測定法の原理を基本
として構成され、一般に標識剤を用いない非ＩＩ識法と
標識剤を用いる標識法に分類される。

非標識法は、レセプター表面で抗原抗体複合体を形成さ
せ、その際誘起される物理的変化を直接電気信号に変換
するものであり、これまでに、（１）膜表面に抗体（ま
たは抗原）を結合させレセプターとし、抗原抗体反応前
後の膜電位を測定する膜電位方式と、（２）金属電極表
面に直接または膜を介して抗体（または抗Ｍ）を結合し
レセプターとし、抗原抗体反応にともなう電極電位の変
動を測定する電極電位方式の２種類が提案されている。

ａ、あるいは電極表面に固定化された抗体は、対応する
抗原を識別して安定な複合体を形成する。ＷＡあるいは
電極表面に形成された抗原抗体複合体は、膜電位あるい
は電極電位の変動を１！４起する。しかしながら、この
ような非＋１１１ｆｆｉ法は、酵素等を利用した標識法
の免疫センサと較べて一最に感度が低く実用化までには
さらに改良が必要とされている。

一方、標識法の免疫センサとしては、酵素、発光体、蛍
光体等の標識剤を用い、それぞれの最終変化を電気化学
トランデューサーで電気信号に変換するという巧妙な測
定デバイスが考案されている。これらの標識免疫センナ
の中でも、ＦＩＡ識剤として最も多く用いられているの
は酵素であり、このようなセンサは酵素免疫センサとし
て広く研究されている。このような酵素免疫センサの多
くは、酵素電極の技術を基本としているため、酵素反応
により生成もしくは消費した物質を電気化学的に検出す
る電流応答型のセンサである。電極の先端部に抗体固定
膜を装着した形が一般的であり、この電極上でＥＩＡ法
と同様に免疫反応を行わせ、酵素に対する基質を添加し
た際のセンサの出力変化から抗原濃度を測定することが
できる。このような、酵素免疫センサでは、電極ＷＡ自
体の反応性を高めるべく、種々の物質を用いた電極膜の
開発が進められているが、これまでに報告されているも
のは、トリアセチルセルロースやポリビニルクロライド
等の絶縁膜を用いたものが主であり、電解重合高分子か
らなる膜を用いた酵素免疫センナ用電極展の研究例は数
少ない。

先１立且１ 本発明者らは、このような酵素免疫センサに用いる高感
度の電極の開発と目的として研究を重ねた結果、ポリチ
ラミン膜を用いた電極が高感度の酵素免疫電極として潰
れていることを見いだした。

さらに本発明者らは、ポリチラミン膜を用いた酵素免疫
電極をより高感度なものへと改良するすべく、を極膜の
重合条１′＋等の検討を行った結果、ある特定の重合条
件下においてポリチラミン膜を二重に修飾し、この膜に
抗原または抗体を固定化した電極が、電極電流測定方式
の酵素免疫センサとして測定感度が非常に優れているこ
とを見いだし本発明を完成するに至った。すなわち、本
発明は、特定の抗原または抗体を測定することを目的と
したポリチラミン膜を用いた高感度の電極電流測定型の
酵素免疫センナ及びその製法を提供することを目的とす
る。

ｏ　　　　　　　　　　　−。

本発明の酵素免疫センサは、チラミン：口１１ ｔ、Ｉ霊２しｌｌ２ＮＩ＋２ を電解重合させた膜を使用することを特徴とする。

このようなチラミンのモノマーは、市販されており容易
に入手することが可能である。チラミンの電解重合に際
しては、白金電極（Ｐｔ）を直接チラミン溶液に浸し電
解重合反応させることにより白金電極上に均一なポリチ
ラミン膜を形成させることができる。この重合反応にお
いては、電着条件すなわち電着方法、電解溶液等を選択
することによって電気化学的性質および膜ｆｉ１ｍの異
なる膜を基板電極の形状、サイズ等を問題とせず容易に
作製でき、また、重合時の通電量を変化させることによ
り所望とする任意の膜厚とすることが可能であることも
、免疫センサ調製の際に大きな利点となる。

本発明のように、目的の抗原・抗体を測定する酵素免疫
センサを調製する場合には、これに対応する抗体または
抗原を電極膜上に結合させることが必要となるが、本発
明のポリチラミンからなる作用膜においては、抗原・抗
体に結合しやすい官能基であるアミノ基がチラミン１分
子当り１つ存在するために、免疫電極として必要な抗体
または抗原を配向性をもたせ免疫反応に有利に、しかも
極めて高密度に効率よく結合固定化することが可能とな
る。

チラミンの電解重合に際しては、通常の方法、例えばａ
）定電流電解法、ｂ）定電位電解法、Ｃ）電位掃引法（
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｓｃａｎｎｉｎｇ法）で行い得る
。すなわち、チラミンを含む電解重合用溶液を調製し、
これに電解重合用の作用電極と対電極を浸漬し適当な電
解重合条件下に定電流、定電位または電位ｔφ引法にて
通電することによって重合膜を得る。

特に本発明の好ましい免疫センサ用膜は、ａ）定電流電
解法によりチラミンを重金することにより所望とする性
質を持った電極膜を調製することが可能となる。

チラミンを電解重合用溶媒に溶解することによって電解
重合用溶液を調製する際に用いられる電解重合用溶媒は
、チラミンのモノマーは溶解するが電解重合で得られる
ポリマーは溶解しない、−般に電気化学的操作に用いら
れる極性溶媒である。

好ましい一例としては、硫酸、塩酸等のような酸類、メ
タノール、エタノールのようなアルコール類または水等
が挙げられる０重合時の溶液中のチラミンモノマー濃度
は、−ａに２０〜２００ミリ（ル／Ｉｔもあれば十分で
あり、水のように溶解度が１（ル／Ｉｔ以下の比較的小
さいものでの十分使用できる。

本発明者らによれば、チラミンの重合に際しては、酸性
溶媒を用いることにより多孔性のポリチラミン膜が得ら
れ、この多孔性膜は非特異反応も多少高いものの酵素免
疫センサに用いた場合出力電流が大きく、感度的に有利
であることが確認された。一方、アルカリ−メタノール
溶液等を用いて調製したポリチラミン膜は、出力電流値
が、酸性溶媒を用いて酸化重合させた膜と比較して低い
が非特異反応が極めて小さいことが確認された。さらに
この結果を踏まえた本発明の酵素免疫センサの最も好ま
しい態様として、酸性溶媒を用いて酸化重合した多孔性
で大きな表面積を有するポリチラミン電極膜上に、さら
にアルカリ−メタノール溶液を用いてポリチラミンを酸
化重合させた二重修飾電極を調製すれば、上記のそれぞ
れの電極膜の長所のみを有する、すなわち非特異反応も
なく、センサとしての出力電流も高い高感度の酵素免疫
センサ用膜を得ることが可能となることを見いだした。

ポリチラミンの電解重合に使用できる電極としては、バ
イオセンサの作用電極として通常使用される材料、例え
ば白金、アルミニウム、金等の金属電極材料、酸化スズ
、酸化チタン等の金属酸化物材料、シリコン、ヒラ化ガ
リウム等の半導体材料、グラファイト、グラジ−カーボ
ン等の炭素電極材料からなり通常の電極形状を有するも
のである。

上記のごとくして電極本体上に形成させたポリチラミン
膜は、士１分に洗浄したのち、各種抗原または抗体を含
む溶液、例えばｐＨ７，０に調製されたリン酸緩衝液中
に浸漬して抗原または抗体を膜中に結合させる。あるい
は、この際に縮合試薬を用いることも可能である。更に
、測定時に非特異物質の吸着による誤差が生じないよう
、即ち、測定時に膜上で測定すべき抗原−抗体反応以外
の反応が生じないように膜自体あるいは残余の官能基へ
の非特異吸着を、界面活性剤やＢＳＡ等で処理すること
によって防止することができる。

本発明で得られたポリチラミンの官能基に結合させる抗
原または抗体はいかなるものでも可能であり、例えば各
種免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）、抗免疫
グロブリン、アルブミン、ｈＣＧ等を挙げることができ
る。

以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明する。

夾」Ｌ区」− 直径０．５ｍ、　　長さ５ＩＩｌｌの白金電極上にチラ
ミンを定電流電解により酸化重合させ、ポリチラミン（
以下、ＰＴｙと略す）修ｆＩａ電極とした。　　ＰＴｙ
ｌｌｉｆｉｆｌｌ電極は下記の３つの異なる条件下で作
製した。また、電着の際には、第３図中に示したそれぞ
れ通電量にて行った。

（＆）　ｐ’ｒｙ　（ｌ１２ｓＯａ）　：ｏ、　１Ｍチ
ラミンを含む０．１Ｍ　ｌ１ｅＳＯａ水溶液（ｐｌ（１
以下） （ｂ）　ＰＴｙ（ＮａＯＨ）；　０．１Ｍチラミンを含
む０．２Ｍ　Ｎａ０ＩＩ水溶液 （ｃ）　ＰＴｙ　（ＮａＯＩＩ／Ｍｅ０１１）　：　０
．　Ｉ　Ｍチラミンを含む０．３ＭＮユ０１１−メタノ
ール溶液 次に、抗体く１００μｇ／ｍｌ）を縮合試薬であるカル
ボジイミド（３０ｍｇ／脂ｌ）を用いて、リン酸緩衝溶
液（ＰＲ，ｐｔ！７．０＞中でポリチラミン膜のアミノ
基と抗体のカルボキシル基をペプチド結合させることに
より　ＰＴｙ［極上に抗体を固定化した。

最後に、抗体固定化ＰＴＹ修飾を極を０．５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０とｌχｉｔｓ＾を含むリン酸ｕ街液（ｐｌ＋７．
０　）で処理した。

１定去韮（第１図、第２図参照） 測定は、ＰＴＹ修飾電極上の抗体と、抗原及び酵素ＩＩ
識抗原との間の競合反応に基づいた。今回は、抗原−抗
体系としてｈｕｍａｎ−ＩｇＧ　（ＩｇＧ）とヤギ抗血
清よりえた　ａｎｔｉ−ＩｇＧを用い、また漂識酵素と
してグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）を用いＧＯＤ標
識ＩｇＧ　（ＧＯＤ−１ｇ（Ｅ）を作製した。　まず、
ａｎｔｉ−ＩｇＧ固定化ＰＴｙ修飾電極を種々の濃度の
ＩｇＧと一定量のＣＯＤ−ＩｇＧを含むＰＢ　（ｐａ７
．０　）溶液中で３７℃、１時間（または、室温で２時
間）反応させ、電極を洗浄後測定セルに移した。ＩｇＧ
と　Ｃ０Ｄ−ＩｇＧは競合的にＰＴｙ＊飾電極上電極上
化抗体と反応し、固定化抗体と結合したａＯＤ−ＩｇＧ
のＣＯＤ活性は、０．６５Ｖ　（ｖｓ、　Ａｇ／ＡｇＣ
１）に電位をかけ電流が定常値になった後で１Ｍグルコ
ース（２００ＪＡ）を滴下し、酵素反応で生成した過酸
化水素（１１２０２）の酸化に基づく電流を直接免疫電
極で測定し、ＩｇＧ量を評価した。

上記の（＆）〜（ｃ）のそれぞれの条件にて作製した各
種ＰＴｙ電極作製時の通電量と、これにより得られる酵
素免疫センサの出力電流の関係を第３図に示した。

この図かられかるようにＰｒｙ（Ｈ２ＳＯ４＞修飾電極
は、ＰＴｙ（ＮａＯＩＯｌＰＴｙ（ＮａＯＨ／ＭｅＯＨ
）修飾電極に比べ酵素反応で生成した＋１２０２に対し
非常に大きい電流応答を示した。また、ＰＴｙ（ＮａＯ
［（）、ＰＴｙ　（ＮａＯ［（／）４ｅＯＩＩ）修飾電
極はほぼ同等の応答を示した。いずれの電極も約５０〜
２００ミリクーロン［■ｃｏｕｌｏ謙ｂｌ（白金電極単
位表面積あたり：　　０．６２５〜２．５クーロン／Ｃ
鵬２）の電気量で電着したときが最も大きい応答を示し
た。

次に、上述の各種免疫センサを、ＧＯＤ−ＩｇＧのみと
十分に反応させその電極にグルコースを滴下したときの
応答曲線を第４図に示した［　ａ：ＰＴｙ（ｌ１２ｓＯ
ａ）。

ｃ：ＰＴｙ（ＮａＯＨ／Ｍｅ０１１）、　ｄ：ＰＴｙ（
ＮａＯＩｌ）］、いずれの電極でも酵素反応で生成した
Ｈ２（ｈに対し１０秒以内で定常状態に達し、酵素免疫
センサ用電極として使用できることがわかった。

これらのＰＴｙ修飾電極を走査型電子顕微鏡（ＳＥＸ）
で観察したところｐ’ｒｙ　（ｆｈｓＯ４）膜はＰＴｙ
（ＮａＯＩＩ）、ＰＴｙ　（Ｎａ０１１／Ｍｅ０１１）
　Ｈに比べ非常に凹凸が激しく多孔性で表面積が大きか
った。従って、’Ｔｙ　（Ｈ２ＳＯ４）膜は、多くの量
のａｎｔｉ−１１Ｇを固定化することができ、電流応答
が大きくなったと思われる。一方、　ＰＴＹ（Ｎａ０１
１）、ＰＴｙ　（ＮａＯＦｌ／ＭｅＯＨ）は、表面がち
密で凹凸の少ない膜であった。　　ｐ’ｒｙ　（ＩＩ２
ＳＯａ）、ＰＴｙ（ＮａＯＩｌ）及びＰＴｙ　（ＮａＯ
ＦＩ／ＭｅＯＩＩ）膜の表面状態を示すＳＥＸ写真をそ
れぞれ第５ａ図、第５ｂ図および第５ｃ図に示した。

丈ｊ口１２ 下記に示された条件で定電流電解重合法によりＰＴｙ　
（ＮａＯｆｌ／ＭｅＯＨ）修飾ｔｆｌを調製し、酵素免
疫センサ用ｔＩｉｉを作製しな。

作用型１ｆ＋：　　直径０．５１１Ｉ１１．長さ５鵬腸
の白金線対　ｆｆ＋：　　白金（ｐｔ）プレート溶　媒
　：　メタノール （１７−濃度：　　Ｑ、ＩＭ 電解質　：　　ＯｊＭ　Ｎａ０ＩＩ 電　　流　：　　　５０ｍ＾ 通電量　＝１８０■Ｃ（ミリクーロン）このようにして
作製した　ＩｇＧセンサの応答曲線を第６図に示す、こ
の図からＩｇＧｊＬに応じ、酵素反応で生成した）１２
Ｇ２に対する電流応答の大きさに差が生じａｎｔｉ−１
１Ｇ固定化電極上でＩｇＧとＣＯＤ−ＩｇＧ七の間で競
合反応が生じていることがわかる。また、Ｔｗｅｅｎ−
２０等の界面活性剤や牛血清アルブミン（８３＾）を用
いることでＰＴｙ修飾電極へのＣ０Ｄ−ＩｇＧの直接的
な非特異吸着をかなり抑制できた。　　ＰＴｙ（Ｍａｉ
ｌ（／Ｍｅａｌ（）修飾電極を用いてＩｇＧを測定した
ときの検量線を第７図（口、−）に示した。ＰＴｙ　（
ＮａＯ［Ｉ／ＭｅＯＨ）修飾電極を用いて出力電流は小
さいが　ｉｏｏｐｇ／＋１以上のＩｇＧを検出すること
が可能な酵素免疫センサが得られた。

支胤■ユ 実施例２に示された電解条件のうち溶媒を水に、電解質
を０．　ＩＮ！Ｉ２９Ｏａに変えることにより　ＰＴ７
（＋１２８０４）修飾電極を調製しな。

Ｐｒｙ（ＩＩ＊５Ｏ４）修飾電極を用いた場合は出力電
流が大きかったく第４図：＾参照）が、これはＣＯＤ−
ＩｇＧのみのＰＴ７（ｌｈｓＯ４＞膜への直接的な非特
異吸着による応答も含まれていた（第４図：ｅ）、また
、この非特異吸着はＴｗｅｅｎ−２０，８Ｓ八等のブロ
ッキング試薬を用いても抑えることはできなかった。ま
た、ＰＴ７（８２８０ｍ）修飾電極を用いて種々の濃度
のＩｇＧを上記の方法で測定したところ、ＰＴｙｏｌａ
Ｏ［１／Ｍｅｎ■）の検出感度に較べて低く、その検出
感度は約ｌμｇ／ｓｌテあッｆ、：、　　ＰＴｙ　（ｌ
１２ＳＯａ　）修ａ１電極を用イテ１ｇＧを測定したと
きの検量線を第８図示した。

実施例４ 実施例２．３で述べたように種々の条件で作製したＰＴ
ｙ修＃電極を用いて酵素免疫センサを作製することがで
きた。　しかし、ＰＴｙ　（１１２３０４）修飾電極を
用いた場合は大きな出力電流が得られるが、ＧＯＤ−Ｉ
ｇＧのＰＴｙ膜への直接的な非特異吸着を完全に抑制で
きなかった。一方、ＰＴｙ　（ＮａＯＨ／ＭｅＯ［０修
飾電極を用いた場合は大きな出力電流は得られないが、
ＣＯＤ−ＩｇＧのＰＴｙｌｌへの直接的な非特異吸着は
Ｔｗｅｅｎ−２０やＢＳ八等を用いることで抑制でき、
感度的にも良好な酵素免疫センサができた。

そこで、より高感度のＩｇＧセンサを作製するために、
まずＰＴｙ　（ｌ１２ＳＯａ　）膜を白金電極上に作製
し、引き続きＰＴｙ　（ＮａＯｆｌ／ＭｅＯ！０７５１
をその上から電着させたｐＴｙ二重修飾電極［ＰＴｙ（
１（２ｓＯ，）−ＰＴｙ　（ＮａＯＨ／ＭｅＯ［Ｉ）　
］を作製した。このａｎｔｉ−１１Ｇ固定化ＰＴ７二重
修飾電極を用いて種々の濃度のＩｇＧを測定したときの
検量線を第７図（０，・）に示した。この図かられかる
ように１０ｐｇ／ｍ１以上のＩｇＧを測定できる高感度
の酵素免疫センサができた。これは、下地のＰＴｙ（ｌ
Ｉｚ３０ｍ）膜が大きな表面積を保ち、非特異吸着の少
ないＰＴｙ　（ＮａＯ［１／１４ｅｏｌＩ）膜でさらに
覆っているために、固定化抗体量が多くしかもＣＯＤ−
ＩｇＧの非特異吸着が少なくなり検出感度が上昇したも
のと思われる。尚、このようにして得られたポリチラミ
ンニ重修ｍｕの表面状態を示すＳＥＸ写真を第５ｄ図に
示した。

このように電着条件を変えることで電解重合高分子膜の
性質の異なるポリチラミン膜を得ることができ、ポリチ
ラミン修飾電極を用いた高感度酵素免疫センサが作製す
ることができた。また、種々の条件を検討することで、
このポリチラミン膜を利用した免疫センサの高機能化が
可能であることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の酵素免疫センサの測定原理を示す。 第２図は、本発明の酵素免疫センサの測定装置の一例を
示す。 第３図は、実施例１において作製した各種ＰＴｙ電極作
製時の通電量とこれにより得られる酵素免疫センサの出
力電流との関係を示したものである第４図は、実施例で
調製した各種ａｎｔｉ−１ｇＧ固定化ＰＴｙｔ　ｆｉを
用いてＣＯＤ−ＩｇＧを測定した場合の応答曲線を示す
、ただし、図中ｅ：はＰＴｙ　（＋ｈ　ＳＯ４）膜自体
のＣＯＤ−１ｇ（ｉ非特異吸着による応答電流を示す。 第５ａ図、第５ｂ図、第５ｃ図及び第５ｄ図は、それぞ
れ実施例で調製したＰＴｙ（Ｈ２ＳＯ４＞、ＰＴｙ（Ｎ
ａＯＩＩ＞、ＰＴｙ　（Ｎａ０１１／Ｍｅ０１１）及び
ｐｒｙ二重修飾電極［ｐＴｙ　（ｌｈｓＯ４）ｐＴｙ　
（ＮａＯＩｌ／ＭｅＯＨ）　］　ＷＡの粒子構造を示す
ＳＥＸ写真である。 第６図は、実施例２で調製したＰＴｙ　（ＮａＯＩＩ／
ＭｅＯＩＩ）修飾電極を用いてＩｇＧを測定した場合の
応答曲線を示す。 第７図は、ａｎｔｉ−１ｇＧ固定化ＰＴｙ　（ＮａＯＩ
Ｉ／ＭｃＯ旧およびＰＴｙ二重修ｆ＃　［ＰＴｙ（Ｈ２
ＳＯａ）−ＰＴｙ（ＮａＯ１ｌ／ＭｅＯＨ）コミ極を用
いてＩｇＧを測定した場合の検量線をそれぞれ口、■お
よび○、・で示ず。 第８図は、ａｎｔｉ−１ｇＧ固定化ＰＴｙ　（１１２Ｓ
Ｏ４＞修＃ｊ電極を用いてＩｇＧを測定した場合の検量
線を示す。 第２図 リン酸緩衝溶１（ｐｌ（７，０，３ｍｌ　）第３図 通電ｌ〈ミリクーロン） 第４０召 時間（秒） 第５ｃ図 第’：：＞　、−ｊ、［′７？１ 第　！）　１ン　１之１ 第６図 匂 時間（分） 第７図 抗原（ＩｇＧ）　４４　（ｌｏｇ（［１ｇＧ］／ｎｇ／
ｍｌ＞）第８図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原または抗体を固定したポリチラミン膜からな
   る酵素免疫センサ用膜。
2. （２）チラミンを含むアルカリ−メタノール溶液を用い
   て酸化重合することにより電極にポリチラミン膜を電着
   させ、これに抗原または抗体を直接結合させた前記第（
   １）項記載の酵素免疫センサ用膜。
3. （３）チラミンを含むｐＨ１以下の強酸性溶液を用いて
   酸化重合することにより電極にポリチラミン膜を電着さ
   せ、この膜上にさらにチラミンを含むアルカリ−メタノ
   ール溶液を用いて酸化重合することによりポリチラミン
   膜を電着させた二重修飾膜により覆われることを特徴と
   し、さらにこの膜上に抗原または抗体を直接結合させた
   前記第（１）項記載の酵素免疫センサ用膜。