JP2530341B2 - グルコ―ス感応性fetセンサおよびその製造方法 - Google Patents
グルコ―ス感応性fetセンサおよびその製造方法Info
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- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/403—Cells and electrode assemblies
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- G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、高感度化および高速応答化されたグルコ
ース感応性FET(電界効果型トランジスタ)センサおよ
びその製造方法に関するものである。
ース感応性FET(電界効果型トランジスタ)センサおよ
びその製造方法に関するものである。
血液や尿等体液中の各有機物質の濃度測定は、臨床検
査上非常に重要であり、これまでに各種の定量法の開発
や改良が行なわれてきた。特に臨床検査用としては、試
料が微量なことや緊急を要することから、小形で迅速に
応答する定量法が要求されている。この要求を満たすも
のとして、半導体製造技術で微細加工が可能なイオンセ
ンサであるイオン感応性電界効果型トランジスタ(ISFE
T)と固定化酵素膜を組み合わせた酵素FETセンサが開発
されてきている。
査上非常に重要であり、これまでに各種の定量法の開発
や改良が行なわれてきた。特に臨床検査用としては、試
料が微量なことや緊急を要することから、小形で迅速に
応答する定量法が要求されている。この要求を満たすも
のとして、半導体製造技術で微細加工が可能なイオンセ
ンサであるイオン感応性電界効果型トランジスタ(ISFE
T)と固定化酵素膜を組み合わせた酵素FETセンサが開発
されてきている。
第4図は従来のグルコース感応性FETセンサを示す断
面図である。図において、ISFET素子(1)は、基板
(2)と、この基板(2)の表面に形成されたソース電
極(3)およびドレイン電極(4)と、これらソース電
極(3)およびドレイン電極(4)を覆つて基板(2)
の表面に設けられた水素イオン感応膜(5)とからな
る。この水素イオン感応膜(5)は絶縁膜の役割も兼ね
ているシリコン窒化膜である。この水素イオン感応膜
(5)の表面においてソース電極(3)およびドレイン
電極(4)間に形成されたイオン感応部(5a)に、グル
コースオキシダーゼ(6)を含んだ固定化酵素膜(7)
が設けられている。この固定化酵素膜(7)とISFET素
子(1)により、グルコース感応性FETセンサ(8)が
構成される。また、固定化酵素膜(7)の近傍には、水
溶液を介して半導体と水溶液との間にゲート電圧を印加
するための参照電極(9)が設けられている。
面図である。図において、ISFET素子(1)は、基板
(2)と、この基板(2)の表面に形成されたソース電
極(3)およびドレイン電極(4)と、これらソース電
極(3)およびドレイン電極(4)を覆つて基板(2)
の表面に設けられた水素イオン感応膜(5)とからな
る。この水素イオン感応膜(5)は絶縁膜の役割も兼ね
ているシリコン窒化膜である。この水素イオン感応膜
(5)の表面においてソース電極(3)およびドレイン
電極(4)間に形成されたイオン感応部(5a)に、グル
コースオキシダーゼ(6)を含んだ固定化酵素膜(7)
が設けられている。この固定化酵素膜(7)とISFET素
子(1)により、グルコース感応性FETセンサ(8)が
構成される。また、固定化酵素膜(7)の近傍には、水
溶液を介して半導体と水溶液との間にゲート電圧を印加
するための参照電極(9)が設けられている。
従来のグルコース感応性FETセンサ(8)は上述した
ように構成され、ISFET素子(1)は水溶液中の水素イ
オンに感応し、pH1〜10の範囲で約50mV/pHの応答を示
す。グルコースオキシダーゼ(6)は例えば刊行物「セ
ンサーズ・アンド・アクチユエータズ」(Sensors and
Actuators),1985年,第7巻,第233頁に示されるよう
に、β−D−グルコースを選択的に酸化する酵素で、こ
の酵素の働きにより下式に示すようにβ−D−グルコー
スを酵素共存のもとでD−グルコノ−δ−ラクトンに分
解する。生成したD−グルコノ−δ−ラクトンは水溶液
中で自然加水分解反応によりグルコン酸に変化する。
ように構成され、ISFET素子(1)は水溶液中の水素イ
オンに感応し、pH1〜10の範囲で約50mV/pHの応答を示
す。グルコースオキシダーゼ(6)は例えば刊行物「セ
ンサーズ・アンド・アクチユエータズ」(Sensors and
Actuators),1985年,第7巻,第233頁に示されるよう
に、β−D−グルコースを選択的に酸化する酵素で、こ
の酵素の働きにより下式に示すようにβ−D−グルコー
スを酵素共存のもとでD−グルコノ−δ−ラクトンに分
解する。生成したD−グルコノ−δ−ラクトンは水溶液
中で自然加水分解反応によりグルコン酸に変化する。
被測定溶液中にβ−D−グルコースが存在すると、グ
ルコースオキシダーゼ(6)を含んだ固定化酵素膜
(7)中で上式の酵素反応が生じてグルコン酸が生成す
るため、固定化酵素膜(7)中のpHが低下する。このpH
の変化を下地のISFET素子(1)が検知し、グルコース
濃度に応答するのである。
ルコースオキシダーゼ(6)を含んだ固定化酵素膜
(7)中で上式の酵素反応が生じてグルコン酸が生成す
るため、固定化酵素膜(7)中のpHが低下する。このpH
の変化を下地のISFET素子(1)が検知し、グルコース
濃度に応答するのである。
上述したようなグルコース感応性FETセンサ(8)で
は、酵素としてグルコースオキシダーゼを使用していた
ので、上式の反応でD−グルコノ−δ−ラクトンがD−
グルコン酸へ加水分解する反応が律速となつていた。従
つて、グルコース感応性FETセンサ(8)の感度および
速度がこの加水分解反応が遅いことにより抑制され、グ
ルコース感応性FETセンサ(8)の高感度化および高速
応答化が実現できないという問題点があつた。
は、酵素としてグルコースオキシダーゼを使用していた
ので、上式の反応でD−グルコノ−δ−ラクトンがD−
グルコン酸へ加水分解する反応が律速となつていた。従
つて、グルコース感応性FETセンサ(8)の感度および
速度がこの加水分解反応が遅いことにより抑制され、グ
ルコース感応性FETセンサ(8)の高感度化および高速
応答化が実現できないという問題点があつた。
この発明はこのような問題点を解決するためになされ
たもので、高感度でかつ高速で応答する安価なグルコー
ス感応性FETセンサおよびその製造方法を得ることを目
的とする。
たもので、高感度でかつ高速で応答する安価なグルコー
ス感応性FETセンサおよびその製造方法を得ることを目
的とする。
この発明に係るグルコース感応性FETセンサは、ISFET
素子の表面に、グルコースオキシダーゼおよびグルコノ
ラクトナーゼをそれらの活性比が、グルコースオキシダ
ーゼ:グルコノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10の範囲で含
む固定化酵素膜を設けたものである。
素子の表面に、グルコースオキシダーゼおよびグルコノ
ラクトナーゼをそれらの活性比が、グルコースオキシダ
ーゼ:グルコノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10の範囲で含
む固定化酵素膜を設けたものである。
また、この発明の別の発明に係るグルコース感応性FE
Tセンサの製造方法は、上述した割合のグルコースオキ
シダーゼおよびグルコノラクトナーゼを含む水溶性感光
樹脂水溶液を水素イオン感応膜の表面に塗布し、この水
溶性感光樹脂水溶液の所定部分に光照射して光架橋さ
せ、固定化酵素膜を薄膜として得るものである。
Tセンサの製造方法は、上述した割合のグルコースオキ
シダーゼおよびグルコノラクトナーゼを含む水溶性感光
樹脂水溶液を水素イオン感応膜の表面に塗布し、この水
溶性感光樹脂水溶液の所定部分に光照射して光架橋さ
せ、固定化酵素膜を薄膜として得るものである。
この発明におけるグルコノラクトナーゼは、上式の律
速段階であつたD−グルコノ−δ−ラクトンの加水分解
反応を酵素反応により加速することから、固定化酵素膜
中でβ−D−グルコースからD−グルコン酸が速やかに
生成される。すなわち、固定化酸素膜中のグルコン酸滞
溜量が増加することによりグルコース感応性FETセンサ
の感度が向上し、また、酸生成速度が速くなることによ
りセンサの応答が加速される。
速段階であつたD−グルコノ−δ−ラクトンの加水分解
反応を酵素反応により加速することから、固定化酵素膜
中でβ−D−グルコースからD−グルコン酸が速やかに
生成される。すなわち、固定化酸素膜中のグルコン酸滞
溜量が増加することによりグルコース感応性FETセンサ
の感度が向上し、また、酸生成速度が速くなることによ
りセンサの応答が加速される。
また、この発明の別の発明においては、水溶性感光樹
脂を用いて非常に薄い固定化酸素膜を形成できるので、
感度が高く、応答の速いセンサが得られる。
脂を用いて非常に薄い固定化酸素膜を形成できるので、
感度が高く、応答の速いセンサが得られる。
第1図はこの発明の一実施例を示す断面図であり、
(1)〜(6)、(9)は上述した従来のグルコース感
応性FETセンサ(8)におけるものと全く同一であり、
同様に動作する。ISFET素子(1)の水素イオン感応膜
(5)のイオン感応部(5a)には、グルコースオキシダ
ーゼ(6)およびグルコノラクトナーゼ(10)を含んだ
固定化酵素膜(7A)が設けられている。この固定化酵素
膜(7A)とISFET素子(1)とでグルコース感応性FETセ
ンサ(8A)が構成される。
(1)〜(6)、(9)は上述した従来のグルコース感
応性FETセンサ(8)におけるものと全く同一であり、
同様に動作する。ISFET素子(1)の水素イオン感応膜
(5)のイオン感応部(5a)には、グルコースオキシダ
ーゼ(6)およびグルコノラクトナーゼ(10)を含んだ
固定化酵素膜(7A)が設けられている。この固定化酵素
膜(7A)とISFET素子(1)とでグルコース感応性FETセ
ンサ(8A)が構成される。
上述したように構成されたグルコース感応性FETセン
サ(8A)を、以下のように製造した。例えば分子量約36
万のポリビニルピロリドンなどの水溶性樹脂20重量%水
溶液に、2,5−ビス(41−アジド−21−スルホベンザ
ル)シクロペンタノンナトリウム塩(東京応化工業株式
会社製)をポリビニルピロリドンに対して10%程度溶か
して水溶性感光樹脂を調製した。
サ(8A)を、以下のように製造した。例えば分子量約36
万のポリビニルピロリドンなどの水溶性樹脂20重量%水
溶液に、2,5−ビス(41−アジド−21−スルホベンザ
ル)シクロペンタノンナトリウム塩(東京応化工業株式
会社製)をポリビニルピロリドンに対して10%程度溶か
して水溶性感光樹脂を調製した。
グルコースオキシダーゼは、活性110U/mgのものを一
度水溶液に溶かし、濃縮して調製した。このグルコース
オキシダーゼ濃縮液のpH7.0における活性は約12,000U/m
lであつた。
度水溶液に溶かし、濃縮して調製した。このグルコース
オキシダーゼ濃縮液のpH7.0における活性は約12,000U/m
lであつた。
グルコノラクトナーゼは、黒カビから分離精製したも
のを濃縮して用いた。pH7.0におけるこのグルコノラク
トナーゼ濃縮液の活性は約60,000U/mlであつた。
のを濃縮して用いた。pH7.0におけるこのグルコノラク
トナーゼ濃縮液の活性は約60,000U/mlであつた。
上述したように調整したグルコースオキシダーゼ濃縮
液15μlに、グルコノラクトナーゼ濃縮液を適当に希釈
したもの15/μlを加え、これに上述したように調整し
た水溶性感光樹脂30μlを加えて混合し、酵素・水溶性
感光樹脂混合水溶液とした。この酵素・水溶性感光樹脂
混合水溶液を、ソース電極(3)とドレイン電極(4)
を備えたISFET素子(1)の水素イオン感応膜(5)を
覆うように広く塗布し、スピナーを用いて均一な膜にす
るとともに乾燥させた。その後、250Wの超高圧水銀灯を
用い、フオトマスクを介して酵素・水溶性感光樹脂混合
物に3秒間光照射し、蒸留水で現像することにより、パ
ターニングされた固定化酵素膜(7A)を得、グルコース
感応性FETセンサ(8A)を得た。
液15μlに、グルコノラクトナーゼ濃縮液を適当に希釈
したもの15/μlを加え、これに上述したように調整し
た水溶性感光樹脂30μlを加えて混合し、酵素・水溶性
感光樹脂混合水溶液とした。この酵素・水溶性感光樹脂
混合水溶液を、ソース電極(3)とドレイン電極(4)
を備えたISFET素子(1)の水素イオン感応膜(5)を
覆うように広く塗布し、スピナーを用いて均一な膜にす
るとともに乾燥させた。その後、250Wの超高圧水銀灯を
用い、フオトマスクを介して酵素・水溶性感光樹脂混合
物に3秒間光照射し、蒸留水で現像することにより、パ
ターニングされた固定化酵素膜(7A)を得、グルコース
感応性FETセンサ(8A)を得た。
次に、10mM PIPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を用い、30℃
で得られたグルコース感応性FETセンサ(8A)の特性を
測定した。
で得られたグルコース感応性FETセンサ(8A)の特性を
測定した。
第2図は、グルコースオキシダーゼの活性を一定に
し、グルコノラクトナーゼの活性を変化させた時のグル
コース感応性FETセンサ(8A)の応答量(mV)を示して
いる。このセンサ(8A)の応答は0.5mMのグルコースに
対するものである。この図から、活性比(グルコースオ
キシダーゼ活性):(グルコノラクトナーゼ活性)が1:
2までは、グルコノラクトナーゼ活性の増加に伴い応答
が上昇し、同活性比が1:2以上では応答が飽和に達する
ことがわかる。従つて、十分な感度を持つセンサ(8A)
を得るためには、先に述べた活性比において1:0.5以上
が必要であり、1:10までは感度が高いことがわかつた。
さらに、酵素試料はコストが高いという点を考え合わせ
ると、なるべく少ない量の酵素を使用することが有利で
あるので、望ましい組成比は活性比で1:2〜1:3の範囲で
ある。
し、グルコノラクトナーゼの活性を変化させた時のグル
コース感応性FETセンサ(8A)の応答量(mV)を示して
いる。このセンサ(8A)の応答は0.5mMのグルコースに
対するものである。この図から、活性比(グルコースオ
キシダーゼ活性):(グルコノラクトナーゼ活性)が1:
2までは、グルコノラクトナーゼ活性の増加に伴い応答
が上昇し、同活性比が1:2以上では応答が飽和に達する
ことがわかる。従つて、十分な感度を持つセンサ(8A)
を得るためには、先に述べた活性比において1:0.5以上
が必要であり、1:10までは感度が高いことがわかつた。
さらに、酵素試料はコストが高いという点を考え合わせ
ると、なるべく少ない量の酵素を使用することが有利で
あるので、望ましい組成比は活性比で1:2〜1:3の範囲で
ある。
第3図に活性比(グルコースオキシダーゼ活性):
(グルコノラクトナーゼ活性)=1:2の条件で製造した
グルコース感応性FETセンサ(8A)の検量線を示す。こ
のセンサ(8A)はグルコース濃度が2mMまで直線的に応
答し、感度も十分高いことが確かめられた。また、応答
時間も5秒と非常に速かつた。これは、水溶性感光樹脂
を用いて製造された固定化酵素膜(7A)の膜厚が、約1
μmと非常に薄い膜に形成できることによる。
(グルコノラクトナーゼ活性)=1:2の条件で製造した
グルコース感応性FETセンサ(8A)の検量線を示す。こ
のセンサ(8A)はグルコース濃度が2mMまで直線的に応
答し、感度も十分高いことが確かめられた。また、応答
時間も5秒と非常に速かつた。これは、水溶性感光樹脂
を用いて製造された固定化酵素膜(7A)の膜厚が、約1
μmと非常に薄い膜に形成できることによる。
なお、上述した実施例では、グルコノラクトナーゼと
して黒カビから得られるものを用いたが、黒カビ以外に
酵母、シユードモナスフルオレツセンス(Pseudomonas
Flurescens)、サツカロマイセスセルビジアエ(Saccha
ronyces Cerevisiae)、大腸菌、ブタ肝臓、牛肝臓など
に含まれているものから精製されたものを用いてもよ
く、上述と同様の効果を奏する。
して黒カビから得られるものを用いたが、黒カビ以外に
酵母、シユードモナスフルオレツセンス(Pseudomonas
Flurescens)、サツカロマイセスセルビジアエ(Saccha
ronyces Cerevisiae)、大腸菌、ブタ肝臓、牛肝臓など
に含まれているものから精製されたものを用いてもよ
く、上述と同様の効果を奏する。
また、上述した実施例では、酵素固定化法として光架
橋法によるものを示したが、安定に酵素を固定化でき、
しかも薄膜に形成できる方法であれば、どんな固定化法
でも同様に適用できる。
橋法によるものを示したが、安定に酵素を固定化でき、
しかも薄膜に形成できる方法であれば、どんな固定化法
でも同様に適用できる。
さらに、上述した実施例では、グルコースオキシダー
ゼとグルコノラクトナーゼを混合して酵素溶液とした
が、黒カビ起源のグルコースオキシダーゼの中にはグル
コノラクトナーゼが不純物として存在していることもあ
り、この場合pH7におけるグルコースオキシダーゼ活性
に対しグルコノラクトナーゼ活性が1:0.5〜1:10の範囲
内にあれば、この酵素をそのまま用いても上述した実施
例と同様の効果を奏する。
ゼとグルコノラクトナーゼを混合して酵素溶液とした
が、黒カビ起源のグルコースオキシダーゼの中にはグル
コノラクトナーゼが不純物として存在していることもあ
り、この場合pH7におけるグルコースオキシダーゼ活性
に対しグルコノラクトナーゼ活性が1:0.5〜1:10の範囲
内にあれば、この酵素をそのまま用いても上述した実施
例と同様の効果を奏する。
この発明は以上説明したとおり、ISFET素子の表面
に、グルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナー
ゼをそれらの活性比が、グルコースオキシダーゼ:グル
コノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10の範囲で含む固定化酵
素膜を設けたので、感度および応答速度の向上を図るこ
とができるとともに、酵素の無駄使いを抑えることによ
り、価格面でも有利なグルコース感応性FETセンサを得
ることができるという効果を奏する。
に、グルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナー
ゼをそれらの活性比が、グルコースオキシダーゼ:グル
コノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10の範囲で含む固定化酵
素膜を設けたので、感度および応答速度の向上を図るこ
とができるとともに、酵素の無駄使いを抑えることによ
り、価格面でも有利なグルコース感応性FETセンサを得
ることができるという効果を奏する。
また、この発明の別の発明に係るグルコース感応性FE
Tセンサの製造方法は、グルコースオキシダーゼおよび
グルコノラクトナーゼをそれらの活性比が、グルコース
オキシダーゼ:グルコノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10の
範囲で含む水溶性感光樹脂水溶液を水素イオン感応膜の
表面に塗布し、この水溶性感光樹脂水溶液の所定部分に
光照射して光硬化させ、固定化酵素膜を薄膜として形成
するので、感度が高く応答が速いグルコース感応性FET
センサを得ることができるという効果を奏する。
Tセンサの製造方法は、グルコースオキシダーゼおよび
グルコノラクトナーゼをそれらの活性比が、グルコース
オキシダーゼ:グルコノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10の
範囲で含む水溶性感光樹脂水溶液を水素イオン感応膜の
表面に塗布し、この水溶性感光樹脂水溶液の所定部分に
光照射して光硬化させ、固定化酵素膜を薄膜として形成
するので、感度が高く応答が速いグルコース感応性FET
センサを得ることができるという効果を奏する。
第1図はこの発明の一実施例を示す断面図、第2図はグ
ルコノラクトナーゼとグルコースオキシダーゼの活性比
に対する応答を示す線図、第3図はグルコース感応性FE
Tセンサの検量線を示す線図、第4図は従来のグルコー
ス感応性FETセンサを示す断面図である。 図において、(1)はISFET素子、(2)は基板、
(3)はソース電極、(4)はドレイン電極、(5)は
水素イオン感応膜、(5a)はイオン感応部、(6)はグ
ルコースオキシダーゼ、(7A)は固定化酵素膜、(8A)
はグルコース感応性FETセンサ、(10)はグルコノラク
トナーゼである。 なお、各図中、同一符号は同一または相当部分を示す。
ルコノラクトナーゼとグルコースオキシダーゼの活性比
に対する応答を示す線図、第3図はグルコース感応性FE
Tセンサの検量線を示す線図、第4図は従来のグルコー
ス感応性FETセンサを示す断面図である。 図において、(1)はISFET素子、(2)は基板、
(3)はソース電極、(4)はドレイン電極、(5)は
水素イオン感応膜、(5a)はイオン感応部、(6)はグ
ルコースオキシダーゼ、(7A)は固定化酵素膜、(8A)
はグルコース感応性FETセンサ、(10)はグルコノラク
トナーゼである。 なお、各図中、同一符号は同一または相当部分を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 塩野 悟 兵庫県尼崎市塚口本町8丁目1番1号 三菱電機株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭63−214662(JP,A)
Claims (4)
- 【請求項1】基板と、この基板に形成されたソース電極
およびドレイン電極と、前記ソース電極およびドレイン
電極を覆って前記基板上に設けられた水素イオン感応膜
と、この水素イオン感応膜上に設けられ、かつグルコー
スオキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼを含む固定
化酵素膜とからなり、前記グルコースオキシダーゼおよ
びグルコノラクトナーゼの活性比が、グルコースオキシ
ダーゼ:グルコノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10であるこ
とを特徴とするグルコース感応性FETセンサ。 - 【請求項2】グルコースオキシダーゼおよびグルコノラ
クトナーゼの活性比が、グルコースオキシダーゼ:グル
コノラクトナーゼ=1:2〜1:3であることを特徴とする特
許請求の範囲第1項記載のグルコース感応性FETセン
サ。 - 【請求項3】グルコースオキシダーゼおよびグルコノラ
クトナーゼをそれらの活性比がグルコースオキシダー
ゼ:グルコノラクトナーゼ=1:0.5〜1:10となるように
含む水溶性感光樹脂水溶液を調製し、この水溶性感光樹
脂水溶液を、基板に形成されているソース電極およびド
レイン電極を覆って設けられた水素イオン感応膜上に塗
布し、次いで塗布した水溶性感光樹脂水溶液の所定の部
分だけに光を照射して固定化酵素膜を薄膜として形成す
ることを特徴とするグルコース感応性FETセンサの製造
方法。 - 【請求項4】グルコースオキシダーゼおよびグルコノラ
クトナーゼの活性比が、グルコースオキシダーゼ:グル
コノラクトナーゼ=1:2〜1:3であることを特徴とする特
許請求の範囲第3項記載のグルコース感応性FETセンサ
の製造方法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62225342A JP2530341B2 (ja) | 1987-09-10 | 1987-09-10 | グルコ―ス感応性fetセンサおよびその製造方法 |
DE3806955A DE3806955A1 (de) | 1987-03-03 | 1988-03-03 | Glucoseempfindlicher fet-sensor und verfahren zu seiner herstellung |
US07/587,660 US5543024A (en) | 1987-03-03 | 1990-09-25 | Glucose sensitive FET sensor and method of making same |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62225342A JP2530341B2 (ja) | 1987-09-10 | 1987-09-10 | グルコ―ス感応性fetセンサおよびその製造方法 |
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