JPH0331224B2 - - Google Patents

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JPH0331224B2
JPH0331224B2 JP58084480A JP8448083A JPH0331224B2 JP H0331224 B2 JPH0331224 B2 JP H0331224B2 JP 58084480 A JP58084480 A JP 58084480A JP 8448083 A JP8448083 A JP 8448083A JP H0331224 B2 JPH0331224 B2 JP H0331224B2
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JP
Japan
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solution
triglyceride
enzyme
immobilized
isfet
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JPS59210356A (ja
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Masao Karube
Hideaki Matsuoka
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Kuraray Co Ltd
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Kuraray Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はPH感応性イオン選択的電界効果トラン
ジスタを用いたトリグリセライドセンサに関する
ものである。糖尿病、動脈硬化症、ネフローゼ症
候群、甲状腺機能低下症、家族性高脂血症等の患
者の血清中のトリグリセライド濃度は異常に高
く、これらの疾患の臨床に血清中のトリグリセラ
イド濃度の測定は欠かせない。従来よりかかる血
清トリグリセライドの濃度測定方法として(1)クロ
モトロープ酸を用いる方法、(2)アセチルアセトン
法、(3)酵素法、(4)ネフエロメーターを用いる方法
等が用いられている。しかし、これらの方法はい
ずれも煩雑な分析操作と長い分析時間を必要とす
るという問題があつた。
本発明者らは従来のトリグリセライド濃度の測
定方法の問題点を解消した新規な測定技術を提供
するため、まずトリグリセライドに選択性を有す
る酵素について検討したところ、グリセロールエ
ステル加水分解酵素がトリグリセライドの高い加
水分解能力と選択性を有していることを見出し、
かかるグリセロールエステル加水分解酵素を誘導
ノイズを捨いにくい入力インピーダンスの極めて
小さいPH電極と組み合せることにより、トリグリ
セライドを連続的に測定するトリグリセライドセ
ンサが製作可能であることに着目し、さらに鋭意
検討した結果本発明に到達したものである。すな
わち本発明はPH感応性イオン選択的電界効果トラ
ンジスタのゲート絶縁膜上に被覆された多孔質高
分子膜または親水性の均質高分子膜にグリセロー
ルエステル加水分解酵素を固定化したことを特徴
とするトリグリセライドセンサである。
本発明に用いるPH感応性イオン選択的電界効果
トランジスタ（以下PHISFETという）は、特開
昭51−139289号、同52−26292号等に開示されて
いる。かかるISFETは、IC技術を用いて作製さ
れた絶縁ゲート型電界効果トランジスタのゲート
部に、PH感応性の膜を形成した極めて小形なもの
で、このPH感応性の膜表面における電界質との界
面電位の変化を検出して、電界質中のPHを測定す
るものである。上記PH感応膜として、たとえば特
開昭54−66194には窒化ケイ素、特開昭55−24603
には酸化アルミニウムもしくは五酸化タンタル、
P.T.McBride、Anal.Chim.Acta101239（1978）
にはシリコーンゴム等が記載されている。この電
極はPH感応ガラス電極や固体電極などにくらべ入
力インピーダンスが極めて小さいため誘導ノイズ
を捨いにくく、シグナル／ノイズ比が大きくなつ
ている。そのために脂肪酸のような弱酸の生成を
とらえることが可能である。
PH ISFETのゲート絶縁膜上にグリセロール
エステル加水分解酵素を固定化するために被覆さ
れた高分子膜としてはトリアセチルセルロース、
架橋アルブミン、ポリヒドロキシエチルメチルメ
タクリレート、ポリビニルアルコール、エチレン
−ビニルアルコール共重合体、その他各種のもの
を用いることができる。これらの高分子膜に求め
られる条件は、(1)多孔質であるか、または(2)均質
膜である場合は親水性であることである。この条
件は加水分解反応によつて生成する水素イオン
（ヒドロニウムイオン）が測定溶液とISFET表面
（PH感応部）の間を自由に拡散することを可能と
するために必要な条件である。
PH ISFET上に多孔質高分子膜を形成させる
方法としてはたとえば(1)トリアセチルセルロース
ートリアミン−グルタルアルデヒドを用いる方
法、(2)ポリビニルアルコール、ポリエチレングリ
コール、ホウ酸、酢酸の混合水溶液をアルカリ溶
液中で凝固させた後グルタルアルデヒド等で架橋
する方法（特開昭52−21420）号、(3)エチレン−
ビニルアルコール共重合体のジメチルスルホキサ
イド溶液を水中で凝固させる方法（特開昭51−
145474号）等があげられる。またPH ISFET上
に親水性高分子の均質膜を作る方法としてはたと
えば、(4)ポリビニルアルコールの水溶液をグルタ
ルアルデヒドと硫酸ナトリウムを含む水溶液中で
凝固させる方法、(5)エチレン−ビニルアルコール
共重合体のエタノール水溶液を蒸発凝固させる方
法、(6)ポリ−ヒドロキシエチルメチルメタクリレ
ートのエタノール溶液を蒸発乾固させる方法等が
あげられる。
上記高分子膜に固定化されるグリセロールエス
テル加水分解酵素は別名リポプロテインリパーゼ
（あるいは単にリパーゼ）と称されているもので
ある。リポプロテインリパーゼとしては
Rhizopusarrhizus、Candida cylindracea、
Porcine pancreas、Pseudomonas species等を
抽出源としたものが市販されているが、とりわけ
Rhizopus arrhizusを抽出源としたものは比活性
が高く、純度も高いので本発明で用いる酵素とし
て適している。
かかるグリセロールエステル加水分解酵素は下
式で示される反応にしたがつてトリグリセライド
を加水分解し、脂肪酸とグリセロールとを生成す
る。
ここでR1、R2およびR3は飽和もしくは不飽和
アルキル基である。従つて、PH ISFETのゲー
ト絶縁膜に被覆した高分子膜にトリグリセライド
加水分解酵素を固定化すれば、上記の反応に伴う
PHの変化を測定することができる。
これらの高分子膜にグリセロールエステル加水
分解酵素を固定化する方法としてはいわゆる包括
法、担体結合法等を用いることができる。包括法
は酵素を親水性高分子膜の中に包み込む方法であ
る。この場合には高分子膜としては親水性の均質
膜が用いられる。包括法によつて酵素を固定化す
る方法としてはたとえば親水性高分子の原液中に
所定量の酵素を溶存させておき、あとは上述の(4)
〜(6)と同様の方法によつて凝固させることができ
る。一方担体結合法においては、いつたん上述の
(1)〜(6)の方法によつて高分子膜をPH ISFET上
に形成させた後、該高分子膜上に化学結合によつ
て酵素を固定化する。化学結合の方法としては、
例えば上述の(1)の方法で作られたトリアセチルセ
ルロース−トリアミン−グルタルアルデヒド系多
孔性膜の場合には、この膜をさらにグルタルアル
デヒドで処理した後、酵素溶液と反応させること
によつて酵素を固定化することができる。また上
記(2)〜(6)のように水酸基を有する高分子膜の場合
にはたとえばまずアミノアセトアルデヒドジメチ
ルアセタールで処理してアミノ基を導入し、次い
でこのアミノ基にグルタルアルデヒドを反応させ
てアルデヒド基を導入し、最後にこのアルデヒド
基に酸素を反応させることによつて酵素の固定化
をおこなうことができる。
かくして得られたトリグリセライドの酵素固定
化高分子膜の厚みは0.1〜100μｍが望ましい。厚
みが0.1μｍ以下では固定化酵素の量が不足し、且
つピンホールが生成しやすくなるために感度が低
くなる。一方厚みが100μｍ以上だと、高分子膜
中の反応物質や生成物質の拡散が遅くなり、その
ためにセンサの応答が遅くなる。
次に実施例によつて本発明のセンサの詳細につ
いて説明する。
実施例 第１図は実施例に用いたPH ISFETの構造を
示す平面図である。このISFET1は例えば巾0.4
mm、長さ5.5mmの長尺のもので一端部にゲート部
２を他端部にドレインおよびソースコンタクト３
および４を具えている。ゲート部２は第２図にＡ
−Ａ断面図を示すように、シリコン基板５にドレ
イン拡散領域６およびソース拡散領域７、８を形
成し、全体を1000〓の酸化膜９および1000〓の窒
化シリコン膜10で順次に被覆している。
まず、ISFETのゲート絶縁膜である窒化シリ
コンの表面をγ−アミノプロピルトリエトキシシ
ラン（γ−APTES）で化学修飾して官能基を導
入した後、γ−APTESの10％水溶液を塩酸を用
いてPH７に調整し、この中に素子のゲート部２を
浸漬して50℃で約１時間放置した後、水洗、乾燥
させた。次にこの素子の表面に以下に述べる方法
で酵素固定化膜を調整した。すなわち、トリアセ
チルセルロース250mgを10mlの塩化メチレンに溶
解させた後、これに50％グルタルアルデヒド
200μを加え、十分攪拌して分散させた。次に
１，８−ジアミノ−４−アミノメチルオクタン
1000μを添加して激しく攪拌し均一にさせた
後、γ−APTES処理したゲート部表面に薄く塗
布した。これを室温で風乾させながら２日間放置
し反応させた。反応後、素子を１％グルタルアル
デヒド中に浸漬し、１時間反応させて水洗した
後、酸素溶液（20mg．ml-1）に浸漬して室温で約
２時間、４℃で一晩反応させた。次に素子を
0.1Mグリシン溶液に浸漬し、室温で約１時間反
応させて未反応のアリデヒド基とグリシンを結合
させた。
PH ISFETは溶液中の水素イオン濃度により
窒化シリコン界面での界面電位が変化する。そこ
で、第３図に示す回路を用いてこの界面電位の変
化を測定した。この回路図から明らかなようにオ
ペアンプから成る帰還回路によつてISFET22に
は常に一定の電流が流れ、またソース・ドレイン
間には一定の電圧が加えられている。こため溶液
のPH変化によつて生ずる溶液一窒化シリコン界面
の界面電位変化が直接出力として得られる。この
出力電位をエレクトロメータ20を介して記録計21
で記録した。23は参照電極である。
基準液として１％Tritonx−100、0.15M
NaCl、5mM KClを含む２×10-4Mトリス塩酸
緩衝液（PH７）を用いた。トリグリセライドの標
準試料としてトリオレインを選び、均一な懸濁液
とした。すなわち、トリオレイン約500mgを
Tritonx−100、20mlと混合し、70℃で10分間加
熱した。これに70℃に加熱しておいた0.15M
NaCl溶液100mlを加え、室温まで冷却した後、容
量10mlの試験官に分注して3000ｇで５分間遠心分
離した。溶液の上層、下層約１mlを除いて中間層
部の溶液を標準試料溶液とした。これにKCl、ト
リス塩酸緩衝液を加えて、組成を測定用の基準液
と一致させた。この標準試料溶液のトリオレイン
濃度はトリグリセライド測定用、Triglyceride
Ｃ−Test Wakoで定量した。
半導体酵素センサー22を参照電極の銀−塩化銀
電極２３とともに基準液１ml中に浸漬して、出力
電位が安定した後、この溶液にPHをあらかじめ基
準液のPHに一致させたトリオレイン試料溶液１ml
を静かに加え、出力電位の変化を測定した。
基準液１mlに対してトリオレイン溶液１mlを加
え、Vgの経時変化を測定した結果を第４図に示
す。反応溶液は二重ビーカーを用いて温度を37℃
に保ち、攪拌を行なわずに測定した。トリオレイ
ン溶液添加後、Vgは急激に上昇しその後減少し、
再びゆるやかに上昇した。最初の急激な変化は、
溶液の流れによつて素子表面の界面二重層が乱さ
れたことと、温度変化によるものと思われる。実
際トリオレインを含まない溶液を添加した場合に
もこのような出力電位の変化が認められた。Vg
はその後１時間以上上昇を続けたが、これは酸素
反応によつて有機酸を生成し、PHが低下したため
と推定される。そこで、トリオレイン添加後５〜
15分の電位増加速度をこのセンサーの反応として
以下の測定を行なつた。
(1) 一般に酵素反応速度は反応溶液の濃度、PH等
によつて著しく影響を受ける。そこで温度のセ
ンサの反応値におよぼす影響について検討した
結果を第５図に示す。40℃付近で反応は最大値
を示した。これ以上の温度では逆に反応が減少
したがこれは酵素が失活したためと考えられ
る。このセンサはヒト血清中の中性脂質の定量
に応用することを目的としているため、測定は
37℃付近で行なうことが好ましい。
(2) 出力電位変化におよぼすPHの影響について検
討した結果を第６図に示す。PH８付近において
応答は最大値を示すことがわかつた。
(3) 種々の濃度のトリオレイン溶液を添加した場
合の応答値の変化を第７図に示す。トリオレイ
ン濃度の対数に対して出力電位上昇速度をプロ
ツトすると0.5ｍＭから2.0ｍＭの範囲で直接関
係が認められた。
以上のように本発明のトリグリセライドセンサ
は実用上血清中のトリグリセライドを連続的に測
定するに十分な感度、選択性を有しており、その
利用価値は極めて大きいものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で用いるISFETの平面図であ
り第２図は第１図のＡ−Ａ断面図である。第３図
は本発明のトリグリセライドセンサを用いた電気
回路図である。第４図〜第７図はトリグリセライ
ドセンサを用いた測定結果を示すグラフである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ PH感応質イオン選択的電界効果トランジスタ
    のゲート絶縁膜上に被覆された多孔性高分子膜ま
    たは親水性の均質高分子膜にグリセロールエステ
    ル加水分解酵素を固定化したことを特徴とするト
    リグリセライドセンサ。
JP58084480A 1983-05-13 1983-05-13 トリグリセライドセンサ Granted JPS59210356A (ja)

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JP58084480A JPS59210356A (ja) 1983-05-13 1983-05-13 トリグリセライドセンサ

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JP58084480A JPS59210356A (ja) 1983-05-13 1983-05-13 トリグリセライドセンサ

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JPS59210356A JPS59210356A (ja) 1984-11-29
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NL8400916A (nl) * 1984-03-22 1985-10-16 Stichting Ct Voor Micro Elektr Werkwijze voor het vervaardigen van een isfet en een aldus vervaardigde isfet.
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KR101226264B1 (ko) 2005-03-29 2013-01-25 유겐가이샤 얼티자임 인터내셔널 바이오센서

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