JP4796731B2

JP4796731B2 - クレアチニン・バイオセンサー

Info

Publication number: JP4796731B2
Application number: JP2001583768A
Authority: JP
Inventors: シヤフアー，ベルンハルト・ペーター・ハラルト
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-14
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2021-05-14
Also published as: US20030027239A1; DE50105205D1; EP1282417B1; US6861232B2; AT408662B; JP2003533679A; ATA8532000A; EP1282417A1; WO2001087300A1

Description

【０００１】
本発明は少なくとも２種の酵素から成るバイオセンサーの製造法、および酵素を作用電極上で固定化し、酵素により分解し得る物質を生体液中において電流滴定法(amperometric determination)により定量する方法に関する。さらに本発明はバイオセンサー、特にクレアチニンを定量するためのバイオセンサーに関する。
【０００２】
酵素で分解し得る物質、例えばクレアチニン、グルコース等を、生体液、例えば血液、尿、血漿および髄液中においてセンサーにより定量するには、固定化された酵素を含むバイオセンサーにより行うことが好ましい。文献によれば、これらの物質を決定するいくつかの電気化学的方法および光度測定による方法が知られている。
【０００３】
このようにして例えば酵素のクレアチニン・デイミナーゼにより電位滴定法でクレアチニンを定量することができるが、この場合後でアンモニウム含量を決定する過程が含まれる。他の方法では、酵素のクレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびサクロシン・オキシダーゼを用いる酵素カスケード法によりクレアチニンの濃度を決定するが、この場合には最後に電流測定法（以下、電流滴定法ということもある）の電極の所で過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）を測定する。
【０００４】
本発明は、上記の最後に挙げた原理に従って機能するバイオセンサーを製造する方法に関する。これを行う場合、酵素を一緒に固定化し、クレアチニンを電流滴定法により検出し得る分子の過酸化水素に変えなければならない。クレアチニンの過酸化水素への変化は下記の反応過程によって行われる。
【０００５】

電位滴定法における電極の所で過酸化水素は−３５０ｍＶにおいてＡｇ／ＡｇＣｌに対して酸化される。この場合に流れる電流はクレアチニンの濃度に比例する。
【０００６】
Ｈ₂Ｏ₂ −３５０ｍＶ → ２個のプロトン＋２個の電子＋Ｏ₂
電極反応で回収された酸素は次にサクロシンの酸化に使用される。
【０００７】
当業界の現状においては、この３種の酵素を固定化する種々の方法が知られている。Ｔ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．ＹｏｄａのＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．誌、２９／１、５１頁（１９８３年）の論文によれば、これら３種の酵素はすべてグルタルアルデヒドで架橋させられる。
【０００８】
しかしこの固定化の方法は次のような欠点をもっている。即ちこの方法で固定化されたサクロシン・オキシダーゼはその全体的な活性を殆ど失っているから、このような方法でつくられたセンサーを用いた場合、低い信号の高さしか得られない、即ち僅かな電流の変化しか確認できない。しかし、特にクレアチニンの定量の場合には、最大可能な信号の高さが特に重要である。何故ならクレアチニンの濃度は非常に低く、血液中では特にそうであり（約５０μＭ）、またクレアチナーゼは非常に小さい比活性度（最大２０ｉｕ／ｍｇ）のものしか得られないからである。さらにこのような方法で固定化されたセンサーは長い応答時間を示す。
【０００９】
米国特許Ａ−５，４６６，５７５号においては、光で誘起されて架橋をつくり得る魚のゼラチン中でサクロシン・オキシダーゼおよびクレアチニナーゼを固定化し、次いでフィルム生成可能なポリ酢酸ビニル／ビニルアルコール共重合体ラテックス中でクレアチナーゼを重ね合わせる方法が記載されている。
【００１０】
しかしこの点に関しては、複雑な光誘起性の架橋反応のためにバイオセンサーを簡単に製造することが妨げられるという欠点がある。
【００１１】
本発明の目的は、上記の欠点および難点を克服する冒頭に述べた種類の方法を提供することである。特に、本発明方法では短い応答時間および大きな信号の高さが得られるバイオセンサーの簡単な製造法が提供される。特に室温で酵素を固定化することが可能である。
【００１２】
本発明に従えば上記目的は、水溶液中において酵素を１種またはそれ以上の表面活性剤と一緒に作用電極に供給して乾燥させ、それ以後の工程において少なくとも第２の酵素をその上に化学的に固定化することによって達成される。
【００１３】
本発明の説明および特許請求の範囲の目的に対しては、「表面活性剤(surface active substances)」という言葉は表面活性をもった物質、例えば洗剤およびアルコール、例えばグリセリンを包含するものとする。
【００１４】
本発明においては、これらの添加剤を加えるにより、３種の同じように固定化された酵素を含むバイオセンサーに比べ、測定される電流は約４０倍程度増加する。
【００１５】
少なくとも第２の酵素は架橋、共有結合またはマトリックス包接法によって固定化することが適当である。固定化はグルタルアルデヒドを用いて行うことが好ましい。
【００１６】
好適具体化例においては、酵素を固定化した後に保護膜を適用する。このような膜は例えばナフィオン、ＰＶＣ共重合体または酢酸セルロースから成り、センサーの直線性を有利に増加させ、また妨害効果を減少させる。
【００１７】
本発明のバイオセンサーは作用電極、基準電極および対向電極から成り、その酵素は本発明方法によって固定化されており、基準電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極、対向電極は炭素電極であり、作用電極は炭素、金属、金属酸化物または炭素と金属または金属酸化物との混合物から成り、これらの電極は非伝導性の基板(substrate)の上に適用されていることを特徴している。
【００１８】
特に、クレアチニン定量用の本発明のバイオセンサーは作用電極上にサルコシン・オキシダーゼか吸着され、クレアチニナーゼおよびクレアチナーゼがその上に固定化されていることを特徴としている。
【００１９】
好適な具体化例においては、このバイオセンサーは二つの三電極系からつくられ、第１の電極系は酵素のクレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびサルコシン・オキシダーゼを含んでいてクレアチニンとクレアチンの和の定量に用いられ、第２の電極系は酵素のクレアチナーゼおよびサルコシン・オキシダーゼを含みクレアチンの定量に用いられる。クレアチニンの定量を行うには第２の電極系の結果を第１の電極系の結果から差し引く。
【００２０】
本発明のバイオセンサーはさらに電気化学的な妨害を除去するのに用いられるさらに他の電極系を含んでいることが有利である。
【００２１】
次に下記実施例を用いて本発明をさらに例示する。
【００２２】
実施例１
実施例１は、本発明に従って表面活性剤を添加すると、従来法とは反対にサルコシン・オキシダーゼの活性の増加によって信号の高さが改善されることを示す。
【００２３】
水の中（従来法）、並びに水溶性の表面活性成分（この場合はグリセリン並びに３種の非イオン性テンサイド(Tenside)）を含む水の中に溶解したサルコシン・オキシダーゼを電流滴定用のベースセンサーの上に滴下し室温で乾燥させる。電極を分極させ１ｍＭのサルコシンについて電流を測定した。測定結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
１ｍＭのサルコシンに関する電流は洗剤またはグリセリンによってそれぞれ約４０倍増加していることが見出された。
【００２６】
明らかに、乾燥中添加剤によって酵素が最良の方法で保護され、また添加剤の表面活性特性により過酸化水素電極の多孔性をもった組織に対し良好且つ緊密な結合が生じたため、電流がこのように著しく増加したのである。
【００２７】
実施例２
実施例２は、従来法で製造されたバイオセンサー（Ｔ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ）に比べ、本発明のバイオセンサーでは信号の高さが改善され、応答時間が短縮されることを示す。
【００２８】
二つの完成したクレアチン・センサーをつくったが、第１のセンサーの場合には３種のすべての酵素をグルタルアルデヒドで一緒に架橋させ、第２のセンサーの場合には先ずベース電極にサルコシン・オキシダーゼをＴｗｅｅｎ２０と共に被覆した後、その上にグルタルアルデヒドを用いてクレアチニナーゼおよびクレアチナーゼを固定化した。クレアチニン並びにサルコシンを定量するための得られた電流および応答時間をそれぞれ表２に掲げる。
【００２９】
【表２】

【００３０】
本発明に従って酵素を固定化することにより、遥かに強い電流が測定された。また本発明によってつくられたセンサーの応答時間は従来公知のセンサーよりも明らかに短かった。
【００３１】
実施例３
実施例３では本発明のクレアチニン・バイオセンサーの製造法を説明する。
【００３２】
セリグラフィー（ｓｅｒｉｇｒａｐｈｙ）の手法により、基準電極、対向電極および作用電極に対するＡｇ片の伝導体を合成材料またはセラミックス材料からつくられた非電気伝導体の基板の上にプリントする。基準電極は少なくともセンサーの区域の中でＡｇ／ＡｇＣｌペーストからつくる。測定区域の内部で対向電極の上に炭素のペーストの層をプリントする。同じ炭素のペーストを用い作用電極のＡｇ片の電導体を測定区域の中へと延長する。作用電極の測定区域において炭素のペーストの中に５％の二酸化マンガンを含む混合物を作用電極としてプリントする。次に後で液と接触する電極の場所および信号の取出し口（タップ）として作用する伝導体の細片以外の全体の系を繰り返し絶縁ワニスで被覆する。その後でＴｗｅｅｎ２０溶液中に含まれたサルコシンを作用電極の上に滴下し、乾燥させる。しかる後他の酵素をグルタルアルデヒドで固定化する。直線性を増加し妨害効果を減少させるために保護膜を適用する。
【００３３】
妨害なしにクレアチニンを定量するためには、少なくとも二つの三電極系が必要であり、その一つの系はクレアチニンおよびクレアチンを定量するための酵素であるクレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびサルコシン・オキシダーゼを含み、他の系はクレアチンを定量するための酵素のクレアチナーゼおよびサルコシン・オキシダーゼを含んでいる。クレアチンは血液中で阻害物質として作用するから、測定されたクレアチンの値をクレアチンおよびクレアチニンから成るクレアチニン電極の測定値から差し引かなければならない。
【００３４】
さらに他の電気化学的な妨害を除去するためには、サルコシン・オキシダーゼだけを固定化した第３の電極系を使用する（クレアチンは例えばアルブミンのような不活性な蛋白質で置き換える）。

Claims

生体液中において酵素を作用電極上に固定化しクレアチニンを電流測定法により定量するための、少なくともサルコシン・オキシダーゼ、クレアチニナーゼおよびクレアチナーゼを含んで成るバイオセンサーの製造法において、サルコシン・オキシダーゼを水溶液中に含まれる１種またはそれ以上の表面活性物質と共に作用電極に被覆して乾燥させ、次の工程においてクレアチニナーゼおよびクレアチナーゼをその上に化学的に固定化することを特徴とする方法。
表面活性物質として多価アルコール及び／または洗剤を使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
洗剤が非イオン性のテンサイドであることを特徴とする請求項２記載の方法。
クレアチニナーゼおよびクレアチナーゼは架橋、共有結合またはマトリックス包接法によって固定化することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１記載の方法。
クレアチニナーゼおよびクレアチナーゼはグルタルアルデヒドによって固定化することを特徴とする請求項４記載の方法。
固定化の後で保護膜を適用することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１記載の方法。
請求項１〜６のいずれか１記載の方法によってつくられた作用電極、基準電極および対向電極を含むバイオセンサーにおいて、基準電極はＡｇ／ＡｇＣｌ電極であり、対向電極は炭素電極であり、作用電極は炭素、金属、金属酸化物、または炭素と金属または金属酸化物との混合物から成り、電極は非伝導性の基板上に適用されていることを特徴とするバイオセンサー。
二つの三電極系からつくられ、第１の電極系は酵素のクレアチニナーゼ、クレアチナーゼおよびサルコシン・オキシダーゼを含んでいてクレアチニンおよびクレアチンの和を定量する役目をし、第２の電極系は酵素のクレアチナーゼおよびサルコシン・オキシダーゼを含みクレアチンの定量に用いられ、この二つの結果を差し引いてクレアチニンの定量を行うことを特徴とする請求項７記載のバイオセンサー。
電気化学的妨害を除去するさらなる電極系を含んでいることを特徴とする請求項８記載のバイオセンサー。