JPS59159064A - クレアチニンの測定方法 - Google Patents
クレアチニンの測定方法Info
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- JPS59159064A JPS59159064A JP58034249A JP3424983A JPS59159064A JP S59159064 A JPS59159064 A JP S59159064A JP 58034249 A JP58034249 A JP 58034249A JP 3424983 A JP3424983 A JP 3424983A JP S59159064 A JPS59159064 A JP S59159064A
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- JP
- Japan
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- creatinine
- sample
- creatin
- concentration
- hydrogen peroxide
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- Pending
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
素を誘導し、生成した過酸化水素濃度を測定することで
試料中のクレアチニンを定量する方法に関する０ クレアチニンは生体における筋肉収縮のエネルギー源の
一つであるクレアチンリン酸より生じたクレアチンが非
酵素的に脱水して生成する蛋白質窒素の最終代謝物であ
る。この生成したクレアチニンは血液によって腎臓を通
り尿として排出される。腎不全など腎機能に疾患がある
ときには、クレアチニンの排出ができずに血液中のクレ
アチニン濃度を増加させる。このため、血液中のクレア
チニン濃度測定は腎機能を知るうえで重要な検査項目で
ある。
試料中のクレアチニンを定量する方法に関する０ クレアチニンは生体における筋肉収縮のエネルギー源の
一つであるクレアチンリン酸より生じたクレアチンが非
酵素的に脱水して生成する蛋白質窒素の最終代謝物であ
る。この生成したクレアチニンは血液によって腎臓を通
り尿として排出される。腎不全など腎機能に疾患がある
ときには、クレアチニンの排出ができずに血液中のクレ
アチニン濃度を増加させる。このため、血液中のクレア
チニン濃度測定は腎機能を知るうえで重要な検査項目で
ある。
従来から、クレアチニン測定方法としては、血液中のク
レアチニンとアルカリ性ピクリン酸との呈色反応を利用
するヤツフエ法が用いられてきたがヤツフエ法の呈色反
応は、クレアチニンに特異な反応ではなく、血清中のク
レアチニン濃度を測定する場合、血清中の他の共存物質
の妨害が問題となる。
レアチニンとアルカリ性ピクリン酸との呈色反応を利用
するヤツフエ法が用いられてきたがヤツフエ法の呈色反
応は、クレアチニンに特異な反応ではなく、血清中のク
レアチニン濃度を測定する場合、血清中の他の共存物質
の妨害が問題となる。
そこで、高い基質特異性をもつために他共存物質の存在
が問題となることの少ない酵素を用いるクレアチニン測
定方法が検討されてきた。
が問題となることの少ない酵素を用いるクレアチニン測
定方法が検討されてきた。
本発明で用いる酵素は、クレアチニンアミドヒドロラー
ゼ（以下クレアチニナーゼと略す）、タレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ （以下クレアチナーゼと略す）及びザ
ルコシンオキシダーゼ （以下ＳＯＤと略す）の正Ｐｉ
ｔ ’ｆｌＢであり、これらの酵素を中性付近の任意の
ＰＨに調製した電解質水溶液に溶解して用いる。
ゼ（以下クレアチニナーゼと略す）、タレアチンアミジ
ノヒドロラーゼ （以下クレアチナーゼと略す）及びザ
ルコシンオキシダーゼ （以下ＳＯＤと略す）の正Ｐｉ
ｔ ’ｆｌＢであり、これらの酵素を中性付近の任意の
ＰＨに調製した電解質水溶液に溶解して用いる。
以下にこれらの酵素が触媒する反応を示す。
クレアチニナーゼ
クレアチニン＋Ｉ（２０＼−−−− クレアチンクレア
チナーゼ クレアチン＋Ｈ２０□→ザルフシン＋尿素ＯＤ ザルコシン＋ＨＯ＋Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒド＋
Ｈ２Ｏ２以上の酵素反応によってクレアチニンより誘導
された過酸化水素は、電気化学的手段によって測定され
る。
チナーゼ クレアチン＋Ｈ２０□→ザルフシン＋尿素ＯＤ ザルコシン＋ＨＯ＋Ｏ→グリシン＋ホルムアルデヒド＋
Ｈ２Ｏ２以上の酵素反応によってクレアチニンより誘導
された過酸化水素は、電気化学的手段によって測定され
る。
この電気化学的手段としては、ポーラログラフインクな
過酸化水素電極を用いる。過酸化水素電極は、その作用
極上で過酸化水素が酸化されて流ねる電流が過酸化水素
の濃度と比例関係にあることを利用するもので、−過酸
化水素電極には、作用（ラフとして金、白金あるいはそ
の合金を、そして対極として銀あるいはその合金を用い
、過酸化水素の酸化に適し、更に他の反応が起こらない
印加電圧（対極に対して作用極を約＋〇、７■にする）
を外部回路によって加える電極、あるいは作用極及び対
極の材質を適当に選択することによって印加電圧を必要
としないガルバニ式電極、あるいは作用極、対極の他に
一般に電気化学的手法において用いられる参照電極を設
は作用極と参照電極間の電圧を一定にするようにした電
極がある０本発明で用いる酵素によってクレアチニンよ
り誘導した過酸化水素を過酸化水素電極で測定する測定
方法によって血液中のクレアチニンを測定する場合、酵
素反応の中間体であるクレアチンが生成するが、クレア
チンは血液中にも存在するためニ、血液中に存在したク
レアチンからも過酸化水素が誘導されて、測定において
正誤差となってあられれる。
過酸化水素電極を用いる。過酸化水素電極は、その作用
極上で過酸化水素が酸化されて流ねる電流が過酸化水素
の濃度と比例関係にあることを利用するもので、−過酸
化水素電極には、作用（ラフとして金、白金あるいはそ
の合金を、そして対極として銀あるいはその合金を用い
、過酸化水素の酸化に適し、更に他の反応が起こらない
印加電圧（対極に対して作用極を約＋〇、７■にする）
を外部回路によって加える電極、あるいは作用極及び対
極の材質を適当に選択することによって印加電圧を必要
としないガルバニ式電極、あるいは作用極、対極の他に
一般に電気化学的手法において用いられる参照電極を設
は作用極と参照電極間の電圧を一定にするようにした電
極がある０本発明で用いる酵素によってクレアチニンよ
り誘導した過酸化水素を過酸化水素電極で測定する測定
方法によって血液中のクレアチニンを測定する場合、酵
素反応の中間体であるクレアチンが生成するが、クレア
チンは血液中にも存在するためニ、血液中に存在したク
レアチンからも過酸化水素が誘導されて、測定において
正誤差となってあられれる。
本発明は、クレアチニンとクレアチンの酵素反応の速度
の違いを利用してクレアチンが存在することによる正誤
差を取り除いてクレアチニンのみを特異的に測定するこ
とを可能にした酵素的測定方法を提供することを目的と
する０ クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ及びＳＯＤの三酵素
を含む水溶液に過酸化水素を消費する酵素（カタラーゼ
）を加えてクレアチニン及びクレアチンを含む試料を酵
素水溶液に加えたときに生成する過酸化水素の濃度が濃
度ゼロの状態から緩やかに始めに増加しそののちに減少
するようにする。
の違いを利用してクレアチンが存在することによる正誤
差を取り除いてクレアチニンのみを特異的に測定するこ
とを可能にした酵素的測定方法を提供することを目的と
する０ クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ及びＳＯＤの三酵素
を含む水溶液に過酸化水素を消費する酵素（カタラーゼ
）を加えてクレアチニン及びクレアチンを含む試料を酵
素水溶液に加えたときに生成する過酸化水素の濃度が濃
度ゼロの状態から緩やかに始めに増加しそののちに減少
するようにする。
更に口のとき、過酸化水素電極に流れる電流の変化を微
分信号（以下、微分値と略す）として外部回路より出力
させる。
分信号（以下、微分値と略す）として外部回路より出力
させる。
クレアチンから過酸化水素を誘導する反応は、クレアチ
ニンからの反応に比較して一段階反応が少なく反応速度
が早い。そのためクレアチンを含有するときの過酸化水
素の濃度の変化はクレアチニンの場合より早くカタラー
ゼによる濃度の減少が起こり、減少を始める時点でその
微分値はゼロとなる。第１図の曲線（Ａ＞はクレアチン
のみを含む試料を酵素水溶液に加えたときの過酸化水素
電極に流ｆｉる電流の変化を示し、曲線（Ｅ）はその微
分値の変化を示している。クレアチニンの場合は、クレ
アチンの微分値がゼロに、なった時点でも過酸化水素濃
度の増加がみられる。曲線（Ｃ）はクレアチニンのみを
含む試料を加えたときの微分値の変化を示している。
ニンからの反応に比較して一段階反応が少なく反応速度
が早い。そのためクレアチンを含有するときの過酸化水
素の濃度の変化はクレアチニンの場合より早くカタラー
ゼによる濃度の減少が起こり、減少を始める時点でその
微分値はゼロとなる。第１図の曲線（Ａ＞はクレアチン
のみを含む試料を酵素水溶液に加えたときの過酸化水素
電極に流ｆｉる電流の変化を示し、曲線（Ｅ）はその微
分値の変化を示している。クレアチニンの場合は、クレ
アチンの微分値がゼロに、なった時点でも過酸化水素濃
度の増加がみられる。曲線（Ｃ）はクレアチニンのみを
含む試料を加えたときの微分値の変化を示している。
これらの曲線は、クレアチニン及びクレアチンの濃度が
変化しても絶対値が異なるだけで同じ時間的特性を示す
。クレアチンによる電流の微分値がゼロになった時点で
のクレアチニン及びクレアチンを共に含む試料による電
流の微分値（曲線（Ｄ））は、クレアチニンにのみ関係
している。カタラーゼによる過酸化水素の分解はゆるや
かであるので反応開始後９０〜７３０秒で当初から試料
中に存在したクレアチンに由来する溶液中における過酸
化水素濃度の増加がみられなくなるので、酵素水溶液に
クレアチニンを含む液を混合してから９０〜７３０秒経
過時の微分値を測定すればクレアチニン及びクレアチン
を同時に含む試料中のクレアチニン濃度測定が可能とな
る。
変化しても絶対値が異なるだけで同じ時間的特性を示す
。クレアチンによる電流の微分値がゼロになった時点で
のクレアチニン及びクレアチンを共に含む試料による電
流の微分値（曲線（Ｄ））は、クレアチニンにのみ関係
している。カタラーゼによる過酸化水素の分解はゆるや
かであるので反応開始後９０〜７３０秒で当初から試料
中に存在したクレアチンに由来する溶液中における過酸
化水素濃度の増加がみられなくなるので、酵素水溶液に
クレアチニンを含む液を混合してから９０〜７３０秒経
過時の微分値を測定すればクレアチニン及びクレアチン
を同時に含む試料中のクレアチニン濃度測定が可能とな
る。
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例／
酵素水溶液は、０．７Ｍ塩化カリウム及び０．０乙７Ｍ
リン酸二カリウムを含む水溶液と０．１Ｍ塩化カリウム
及び０．ＯＡ７Ｍリン酸−カリウムを含む水溶液を混合
してＰ Ｈ（、Ｑに調製したバッファーに、クレアチニ
ナーゼ（掘進製薬）左。ｕ／ｍ１％ クレアチナーゼ（
掘進製薬） ３０ｕ／Ｈ（３及びザルコシンオキシダー
ゼＣ盛進製薬） ｇ ｖ／ｍｌとなるように溶解した。
リン酸二カリウムを含む水溶液と０．１Ｍ塩化カリウム
及び０．ＯＡ７Ｍリン酸−カリウムを含む水溶液を混合
してＰ Ｈ（、Ｑに調製したバッファーに、クレアチニ
ナーゼ（掘進製薬）左。ｕ／ｍ１％ クレアチナーゼ（
掘進製薬） ３０ｕ／Ｈ（３及びザルコシンオキシダー
ゼＣ盛進製薬） ｇ ｖ／ｍｌとなるように溶解した。
カタラーゼは、約／３Ｕ／ｍｅとなるよう添加した。
測定で用いた装置の略図を第Ω図に示した。
酵素水溶液はタンク／よりポンプ２によって予熱部３で
３７′ｃに加熱された後、度応セルグに導入される。反
応セルは３７Ｃに保たれており、攪拌子汐によって攪拌
されている。導入された酵素水溶液は、ポンプ乙によっ
て定量され／ｍｌ！が反応セル内に保持される。試料は
反応セル上部よりり□μｌ注入され生成した過酸化水素
の濃度を過酸化水素電極７及び外部測定装Ｒｇによって
微分信号に変換して測定する。ｉ１１！ｌ定後の廃液は
ボンブタにより反応セル下部より排出される。
３７′ｃに加熱された後、度応セルグに導入される。反
応セルは３７Ｃに保たれており、攪拌子汐によって攪拌
されている。導入された酵素水溶液は、ポンプ乙によっ
て定量され／ｍｌ！が反応セル内に保持される。試料は
反応セル上部よりり□μｌ注入され生成した過酸化水素
の濃度を過酸化水素電極７及び外部測定装Ｒｇによって
微分信号に変換して測定する。ｉ１１！ｌ定後の廃液は
ボンブタにより反応セル下部より排出される。
クレアチニン及びクレアチンを含む試料とじて人の血清
を用いて、クレアチニンの測定を行なった０ クレアチニン濃度の測定はクレアチニンの影響がほぼな
くなる時点である酵素水溶液に試料添加後９０秒におけ
る微分出力及び試料としてクレアチニン標準液、２ ｍ
ｇ／ ｃｌｌを用いたときの試料添加後ｑＯ秒での微分
出力を比較することで算出し、ヤツフエ法によって求め
たクレアチニン濃度との相関より、本発明の有用性を示
す。
を用いて、クレアチニンの測定を行なった０ クレアチニン濃度の測定はクレアチニンの影響がほぼな
くなる時点である酵素水溶液に試料添加後９０秒におけ
る微分出力及び試料としてクレアチニン標準液、２ ｍ
ｇ／ ｃｌｌを用いたときの試料添加後ｑＯ秒での微分
出力を比較することで算出し、ヤツフエ法によって求め
たクレアチニン濃度との相関より、本発明の有用性を示
す。
クレアチンの影響のなくなる酵素水溶液に試料添加後９
０秒における微分出力を用いて求めたクレアチニン濃度
とヤツフエ法との相関を第３図に示す。この結果高い相
関を持ぢ、ヤツフエ法とほぼ同じ値を示した。
０秒における微分出力を用いて求めたクレアチニン濃度
とヤツフエ法との相関を第３図に示す。この結果高い相
関を持ぢ、ヤツフエ法とほぼ同じ値を示した。
実施例コ
測定条件、装置等は実施例／と同様である。
酵素反応によってクレアチンから生成する過酸化水素の
濃度が一定となり、微分信号がクレアチニンのみに関係
する時点での微分信号の出力をクレアチニン及びクレア
チン混合溶液を用いて測定した結果を示す。
濃度が一定となり、微分信号がクレアチニンのみに関係
する時点での微分信号の出力をクレアチニン及びクレア
チン混合溶液を用いて測定した結果を示す。
クレアチニンのみに関係する時点即ち酵素水溶液に試料
添加後１３０秒における微分出力を次表Ｇこ示す。
添加後１３０秒における微分出力を次表Ｇこ示す。
表では、クレアチンの濃度にほとんど関係なく、クレア
チニン濃度によってのみ値が定まっている。
チニン濃度によってのみ値が定まっている。
また、その値はクレアチニン濃度にほぼ比例しており、
本発明を用いることで酵素によって、クレアチンの影響
がなく、クレアチニンを測定できることを示している。
本発明を用いることで酵素によって、クレアチンの影響
がなく、クレアチニンを測定できることを示している。
表
血液中に存在するクレアチニン濃度は０〜２θ＋＋Ｉｇ
／ｄムクレアチン濃度はθ〜数ｔｒｕ）／ｄ、ｌである
。
／ｄムクレアチン濃度はθ〜数ｔｒｕ）／ｄ、ｌである
。
使用酵素濃度はクレアチニナーゼ、クレアチナーゼにつ
いてはコ０〜３０ ＴＪ／ｒｎムザルコシンオ−キシダ
ーゼについては／〜数Ｕ／ｍｅが通常用Ｑ）られ、でし
）る。
いてはコ０〜３０ ＴＪ／ｒｎムザルコシンオ−キシダ
ーゼについては／〜数Ｕ／ｍｅが通常用Ｑ）られ、でし
）る。
本発明法によれば、クレアチンの共存するクレアチニン
含有試料から容易にクレアチニンのみを定量できる。
含有試料から容易にクレアチニンのみを定量できる。
第１図は酵素水溶液にクレアチン及びクレアチニンを添
加したときの過酸化水素電極Ｇこ流れる電流及び電流の
微分値の時間による変化を示した図、第２図は実施例に
用いた測定装置の概略図、第３図は実施例／の結果とヤ
ツフエ法との相関図である０ （Ａ）・クレアチンのみを含む試料の電流の変化ｄＩＩ
線、（Ｂ）・・（蜀の微分値の変化曲線、（Ｃ）・・ク
レアチニンのみを含む試料の電流の微分値の変化曲線、
（Ｄ）・・クレアチニン及びクレアチンを含む試料の電
流の微分値の変化曲線。 ／ ・タンク、」、乙、９・・ポンプ、３・・予熱部、
り・・反応セル、５・・攪拌子、７・・過酸化水素電極
、ｇ・・外部測定装置。 第１図
加したときの過酸化水素電極Ｇこ流れる電流及び電流の
微分値の時間による変化を示した図、第２図は実施例に
用いた測定装置の概略図、第３図は実施例／の結果とヤ
ツフエ法との相関図である０ （Ａ）・クレアチンのみを含む試料の電流の変化ｄＩＩ
線、（Ｂ）・・（蜀の微分値の変化曲線、（Ｃ）・・ク
レアチニンのみを含む試料の電流の微分値の変化曲線、
（Ｄ）・・クレアチニン及びクレアチンを含む試料の電
流の微分値の変化曲線。 ／ ・タンク、」、乙、９・・ポンプ、３・・予熱部、
り・・反応セル、５・・攪拌子、７・・過酸化水素電極
、ｇ・・外部測定装置。 第１図
Claims (1)
- （旬 クレアチニンアミドヒドロラーゼ、タレアチン
アミジ７ヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ及びカ
タラーゼの四種の酵素を含有し中性付近のＰＨの電解質
の酵素水溶液と、クレアチニン及びクレアチン含有試料
とを混合反応せしめると同時に、該混合溶液中に過酸化
水素電極を浸漬し、混合後′？θ〜７３０秒後の過酸化
水素電極に流れる電流の微分値を測定して試料中のクレ
アチニンの含有量を測定することを特徴とするクレアチ
ニンの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58034249A JPS59159064A (ja) | 1983-03-01 | 1983-03-01 | クレアチニンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58034249A JPS59159064A (ja) | 1983-03-01 | 1983-03-01 | クレアチニンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59159064A true JPS59159064A (ja) | 1984-09-08 |
Family
ID=12408890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58034249A Pending JPS59159064A (ja) | 1983-03-01 | 1983-03-01 | クレアチニンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59159064A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003533679A (ja) * | 2000-05-16 | 2003-11-11 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | クレアチニン・バイオセンサー |
-
1983
- 1983-03-01 JP JP58034249A patent/JPS59159064A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003533679A (ja) * | 2000-05-16 | 2003-11-11 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | クレアチニン・バイオセンサー |
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