JPS62235557A - 酵素電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、臨床検査又は薬品製造、食品加工等におい
て、被測定検体中の生化学物質濃度を酵素反応を利用し
て電気的に測定するための酵素電極に関する。

（ロ）従来の技術 現在、臨床検査等において、被測定検体中の生化学物質
濃度の測定手段として、酵素を利用して測定対象の生化
学物質を反応させ、その生成物の濃度を電気的に測定す
ることが行われる。

従来、上記測定のために使用される酵素電極としては、
作用電極及び対照電極よりなるものが知られている。こ
の作用電極は、白金よりなる下地電極に、測定対象とな
る生化学物質を基質とする酵素を固定化した高分子膜と
、この酵素による酵素反応の生成物の一つを選択して透
過する選択性透過膜とを形成してなるものである。

この作用電極は、対となる対照電極と共に、被測定検体
中に浸漬される。酵素電極と対照電極間には一定電圧を
印加し、両電極間に流れる電流を測定しくアンペロメト
リー）、その値より被検体中の生化学物Ｍ？７４度を定
量するものである。

例えば、被検体中のグルコース（ＧＪｃ）濃度測定には
、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、選択
性透過膜としては過酸化水素（ＨｔＯ□）選択性透過膜
が使用される。Ｇｌｃは、ＧＯＤにより、以下の反応式
に示す化学変化を受け、Ｇ　ｌ　ｃ　濃度に比例したＨ
２Ｏ２が生成する。

０Ｄ Ｇ１ｃ＋Ｏ２□グルコン酸中Ｈｚ　ＯｚこのＨ２Ｏ，が
下地電極と対照電極間に０．７Ｖの電圧が印加されると
、下地電極表面で酸化され、両電極間にＨ２０□濃度に
比例した電流が流れる。

この電流値により、間接的にグルコース濃度が決定され
る。なお、ＨｚＯ□選択性透過膜は、被検体中のアスコ
ルビン酸や尿酸等の干渉物質（これらは０．７Ｖ前後の
電圧で酸化還元反応を起こす）が下地電極表面に移動す
るのを防止する。これら干渉物質は、下地電極表面にお
いて酸化還元反応を起こし、測定誤差の原因となるもの
である。

上記従来の酵素電極は、電流測定（アンペロメリー）に
使用されるものであるが、一方、電位測定（ポテンショ
メトリー）に使用される酵素電極も提案されている。

この従来のポテンショメトリー用酵素電極は、内部に標
準液を入れた絶縁物質の管の下端にイオン選択性透過膜
を設け、さらに前記標準液中に電極を浸漬してなるもの
である。この酵素電極は、酵素反応に伴うイオン濃度変
化をイオン選択性透過膜を介しての被検体中と標準液中
のイオン濃度差で捉え、上記電極と対照電極間の電位差
として計測するものである。

（ハ）発明が解決しようとする問題点 上記従来のアンペロメトリー用の酵素電極は・電流測定
を行うものであるため、以下に列記する不都合があった
。

第１に、酵素電極の小型化・微小化が困難である不都合
があった。アンペロメトリーにおいては、作用電極に対
して対照電極が一定面積比以上に大きくなければ安定し
た電流変化が得られず、ＳＺＮ比が低下する。また、作
用電極及び対照電極の汚れによる電極面積の減少に対処
するためにも、ある程度の大きさが作用電極及び対照電
極に必要とされていた。

第２に、酵素電極が接続される測定回路が複雑なものと
なる不都合があった。これは、酵素固定化膜、電極抵抗
等の高インピーダンス部分を通して信号を取出している
ため、その信号が小さく、外来雑音や高入力抵抗による
障害を受けやすく、これら障害の除去手段が測定回路に
要求されるからである。また、測定回路は、両電極間に
印加電圧を加える機能も必要とされる。

第３に、作用電極に干渉物質の影響を排除するための選
択性透過膜が必要となり、作用電極の構造が複雑化し、
その製作が困難となる不都合があった、また、被測定検
体中の干渉物質濃度が高くなった場合には、選択性透過
膜の膜厚を大きくしても、その影響を完全に排除できな
い不都合があった。

第４に、生化学物質濃度の測定可能範囲が狭いという不
都合があった。

第５に、測定回路の電源を投入してから作用電極と対照
電極間の出力（バックグラウンド）が安定するのに要す
る時間（エージング）が長いという不都合があった。

一方、従来のポテンショメトリー用の酵素電極は、電位
測定によるため、測定回路を簡略化できるものの、以下
に列記する不都合を有している。

第１に、イオン選択性透過膜が必要であり、かつその外
側（被測定検体側）には酵素を固定化した高分子膜を設
けなければならないため、作用電極の構成が複雑で、製
造困難である不都合があった。

第２に、応答が遅く、また長時間使用すると電極出力の
ドリフトが生じる不都合があった。

第３に、作用電極の使用耐久性が低く、実用性に欠ける
不都合があった。

第４に、イオン選択性透過膜の拡散律速により、被測定
検体中の生化学物質の濃度測定範囲が狭いという不都合
があった。

この発明は、上記不都合に鑑みなされたもので、電極の
構成が簡略且つ小型化し、電位測定により測定回路を簡
略化し、干渉物質の影響を排除し、生化学物質濃度測定
範囲の拡張等を可能とする酵素電極の提供を目的として
いる。

（ニ）問題点を解決するための手段 上記不都合を解決するための手段として、この出願の第
１の発明の酵素電極は、下地電極表面に高分子膜を形成
し、この高分子膜中に、被検体中の測定対象生化学物質
に作用する酵素と、この酵素反応に伴い酸化又は還元さ
れる酸化還元物質とを固定化してなる作用電極と、この
作用電極と共に被検体中に浸漬される対照電極とよりな
るものである。

また、この出願の第２の発明の酵素電極は、前記高分子
膜中に、さらに前記酸化還元物質の酸化還元反応を促進
する第２の酵素を付加してなるものである。

（ホ）作用 この第１の発明の酵素電極は、以下に述べる作用を有す
る。

先ず、被検体中の測定対象物質が、前記高分子膜中の測
定対象生化学物質を基質する酵素により酵素反応を受け
る。この酵素反応の生成物のうち、酸化剤（又は還元剤
）たる生成物が同じく高分子膜中に固定化されている酸
化還元物質を酸化（又は還元）する、この時、作用電極
間と対照電極間に酸化（又は還元）された酸化還元物質
と、未反応の酸化還元物質の濃度差に比例した電位差、
すなわち酸化還元電位が生じる。この電位差は、酵素反
応に関与した測定対、衆生化学物質の量に比例し、これ
より被検体中の測定対象生化学物質濃度を定量すること
が可能となる。

また、この出願の第２の発明は、上記酵素による酵素反
応の生成物のうち、酸化剤（又は還元剤）たる生成物が
酸化還元物質を酸化（又は還元）する反応を、第２の酵
素又は触媒が促進し、作用電極及び対照電極間により速
く測定対象生化学物質に比例した電位差を生じさせるこ
とが可能となる。

（へ）実施例 本発明の第１の実施例を、第１図乃至第４図に基づいて
以下に説明する。

この実施例は、本発明の酵素電極をグルコース濃度測定
に適用したものであり、第２図は、この実施例における
作用電極１０の縦断面図である。

この作用電極１０は、下端が閉塞されているガラス管（
例えば試験管）１１の底１１ａに、白金よりなる下地電
極１２が貫通状態で装着・支持される。なお、下地電極
１２は白金に限定されず、他の金属でもよい、下地電極
１２上端にはリード１３が接続され、ガラス管１１の上
端開口部１１ｂより上方に引出される。さらにガラス管
１１内は、エポキシ樹脂等の合成樹脂１４が充填される
。

下地電極１２のガラス管１１底部１１ａより垂下する部
分の素面には、高分子膜１５が形成される。の高分子膜
１５は、ポリピロールよりなる黒あずき色の薄膜で、酵
素としてグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）及び必要に
応じてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）が、酸化還元物質と
してフェロセン（実際にはフェロセンカルボアルデヒド
）がそれぞれ固定化されている。

次に、この高分子膜１５の形成方法並びに高分子膜１５
にＣＯＤ　（ＰＯＤ）及びフェロセンを固定化する方法
を以下に説明する。

先ず、次のような組成の電解液を調整する。

０．１ｍｏｌ　：ピロール。

１％（Ｗ／Ｖ）：フェロセンカルボアルデヒド。

１０％（Ｖ／Ｖ）ニゲルタルアルデヒド。

０．１ｍｏｌ　ニホウフッ化・テトラ・ブチル・アンモ
ニウム。

これらを、アセトニトリルに溶解する。

この電解液中に、上記作用電極１０（高分子膜１５生成
前の状ａ）と、対照電極として塩化銀（Ａｇ　／　Ａ　
ｇ　Ｃｌ　）電極が設置され、両電極間に１．６■ボル
トを印加すると、作用電極１０の下地電極１２表面に、
フェロセンカルボアルデヒドを含んだ（フェロセンが固
定化された）ポリピロールの高分子膜１５が形成される
。

次に、この高分子膜１５には、ＣＯＤ　（及びＰＯＤ）
が固定化される。

高分子膜１５の形成された下地電極１２を、後述の酵素
液に浸し、冷蔵庫（４℃）内にて一昼夜静置する。この
酵素液は、０．１Ｍのリン酸緩衝液にＧ　ＯＤ５０．６
ユニツト／ｖｓｌｌの比率で溶解したものである。ＰＯ
Ｄをも固定化する場合には、さらに１０．１ユニツト／
ｌｌｌ１の比率でＰＯＤを溶解する。

一方、上記作用電極１０と対となる対照電極２０は、周
知の飽和カロメル（甘こう）電極である。

第１図は、この実施例に係る酵素電極１の使用例を説明
する図である。

２は恒温漕であり、０．１Ｍ、ＰＨ７，０のリン酸緩衝
液ＢＳが貯留され、一定温度に維持される。

また、恒温漕２内には回転子３が置かれる。この回転子
３は、恒温漕２下方に設けられるスターク−４により回
転駆動され、リン酸緩衝液ＢＳを攪拌する。

作用電極１０及び対照電極２０は、それぞれリード１３
及び２３により電位計５に接続される。

また、この電位計５にはレコーダ６が接続され、作用電
極１０と対照電極２０との間の電位差の変化が記録され
る。

上記恒温Ｗｉ２内のリン酸緩衝液ＢＳ中に、ＧＩＣを含
む被測定検体が注入される。この被測定検体は、マイク
ロピペットにより所定の量に計量されて注入される。

前記高分子膜１５では、先ずＣＯＤの作用により、ＧＩ
Ｃが次式で示される反応を起こす。

さらに、（１）式の反応の生成物ＨｔＯｇにより、フェ
ロセン（ＣｐｔＦｅ）の酸化反応が生じる。

Ｈｚ　Ｏｘ　＋２Ｃｐｔ　Ｆｅ＋２Ｈ”＝２　Ｃ９ｚ　
Ｆ　ｅ”　＋　２　Ｈｚ　Ｏ””（２）この酸化型Ｃ９
ｔ　Ｆｅ”の濃度と還元型Ｃｐ！Ｆｅの濃度差に比例し
て、作用電極１０と対照電極２０との間に電気差、すな
わち酸化還元電位が生じる。この電位差は、リン酸緩衝
液ＢＳ中のＧｌｃ濃度にも比例している。

作用電極１０と対照電極２０との間の電位差（以下電極
電位という）は、電位計５により検出され、レコーダ６
にその経時変化が記録される。

より速（Ｇ　ｌ　ｃ　ｔＪ１度測定を行う必要がある場
合には、高分子膜１５にＣＯＤと共にＰＯＤを固定化し
た作用電極１０を使用する。ＰＯＤは、上記（２）式の
反応速度を高める作用をする。

第３図は、フェロセンＣＯＤ及びＰＯＤを固定化した高
分子膜１５を有する作用電極１０を使用した場合の、異
なるＧｌｃ濃度に体する電極電位の経時変化を示すグラ
フである。

第４図は、測定開始時より所定時間経過後における電極
電位変化（ｍｖ／ｍ１ｎ）より、Ｇｌｃ濃度を求める検
量線を示している。ここで所定時間とは、測定開始時よ
り１０分経過後の電極電位変化（ｍｖ）を１０で割った
ものである。この検量線を用いることにより、未知検体
中のＧｊ！ｃ濃度を求めることができる。

なお、測定終了後の作用電極ｌＯは、以下に示す２つの
手段のうち、いずれかの手段により再生される。第１の
手段は、作用電極ｌＯと対照電極２０に印加電圧（０，
６Ｖ）を加えて、酸化型ＣｐＺＦｅ９を還元型ＣｐｔＦ
ｅに還元する。第２の手段は、作用電極１０をフェリシ
アン化カリ等の還元剤溶液に浸漬し、酸化型Ｃｐｔ　Ｆ
ｅ”を還元型ＣｐｔＦｅに還元する。

上記酵素電極１は、未知検体中の生化学物質濃度を知る
だけでなく、未知検体中の酵素活性度を測定ることにも
応用できる。以下、上記実施例において使用されるＣＯ
Ｄの酵素活性度測定への応用例を説明する。

この応用例に使用される作用電極１０”の高分子膜１５
゛中には、フェロセン及びＰＯＤ　（迅速な測定が要求
される場合には必要とされる）を固定化したものである
。この作用電極１０°は、前記対照電極２０と共に、恒
温潅２内のリン酸緩衝液ＢＳ中に、第１図に示すものと
同様に浸漬される。このリン酸緩衝液ＢＳ中には、マイ
クロピペットで一定量のＧｌｃ及びＣＯＤを含む被測定
検体が注入される。

被測定検体中には、ＣＯＤの作用により、（１）式の反
応で生成したＨｇ０ｚ（その濃度はＣＯＤ活性度に比例
している）が含まれているが、このＨ８０、が高分子膜
１５°中のフェロセン（ＣｐオＦｅ）を酸化する〔（２
）式〕、この時、作用電極１０゛間と対照電極２０間に
は、還元型ＣｐｔＦｅと酸化型Ｃｐｔ　Ｆｅ”の濃度差
に比例した電位差が生じる。

この電位差より、リン酸緩衝液ＢＳ中のＨｔＯ＊濃度、
さらには被測定検体中のＣＯＤ活性度を知ることができ
る。

第５図は、異なるＨｘＯｚ濃度に体する電極電位の経時
変化の様子を示す図である。電極電位変化測定開始時よ
りある程度時間が経過した後は、ＨｔＯ□濃度に対応す
る一定の値となる。第６図は、この関係を横軸にＨｔＯ
ｚ濃度（Ｍ）を、縦軸に電極電位変化値（ｍｖ）を取り
、示している。

この図を用いて、電極電位変化（ｍｖ）よりＨ２Ｏｔｇ
度を決定することができ、ひいては被測定検体中のＣＯ
Ｄ活性度を知ることができる。

なお、上記応用例は、直接的にはＨｘ　Ｏｌを測定して
いるものであるから、酵素反応により生成するＩ（！　
Ｏｆの濃度測定に限定されるものではなく、例えば食品
等の漂白・殺菌加工における反応液中のＨｔＯｚ残留量
検査等にも使用可能である。

上記実施例及び応用例においては、第１の酵素としてＣ
ＯＤを使用しているが、他の酵素（主にオキシダーゼに
属する酵素）を使用し、この酵素の基質となる生化学物
質の濃度を測定することが可能となる。また、酸化還元
物質としてフェロセンを用いているが、これに限定され
るものではなく、他のフェロ又はフェリ化合物等を使用
することが可能である。さらに、上記酸化還元物質の酸
化又は還元反応を促進するためにＰＯＤを使用している
が、他の酵素や触媒を使用することも可能であり、適宜
変更できる。

（ト）発明の効果 この出願の第１の発明の酵素電極は、下地電極表面に高
分子膜を形成し、この高分子膜中に、被測定検体中に含
まれる測定対象生化学物質を基質とする酵素と、この酵
素による反応に伴い酸化又は還元される酸化還元物質と
を固定化してなる作用電極と、この作用電極と共に被測
定検体中に浸漬される対照電極とよりなるものであり、
両電極間の電位差に基づき、被測定検体中に含まれる測
定対象生化学物質の濃度を測定するものである。

従って、以下の（ａ）〜（ｆ）項に列記する利点を有す
る。

（ａ）作用電極及び対照電極を小型化・微小化できる。

偽）電位測定であるため、測定回路が簡単となり、イン
テリジェント化も容易である。また、作用電極及び対照
電極を小型化できるため、測定回路にＦＥＴを使用する
ことが可能となる。

（Ｃｌイオン選択性（透過）膜が不要なため、電極の構
成が簡単で、製造が容易でかつ耐久性に優れている。

（ｄ）作用電極の下地電極表面のみに酵素及び酸化還元
物質を固定化する高分子膜を形成したものであるから、
応答が速く、また測定可能な濃度範囲が広い。

（ｅ）酸化還元性物質を電極表面に固定化しているため
、被測定検体中の他の酸化還元物質等の影響による誤差
が防止される。

ｉｎイオン濃度の変化による電位差計測ではないので、
測定精度が優れており、測定に要する時間（電極出力が
安定化するまでの時間も含む）が短い。

また、この出願の第２の発明は、前記高分子膜中に、前
記酸化還元物質の酸化又は還元反応の反応速度を高める
第２の酵素又は触媒を加えたものであり、酵素電極の電
極出力の応答が一層速くなり、測定に要する時間が一層
短縮される利点を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る酵素電橋の使用状
態を説明する図、第２図は、同酵素電極の作用電極の拡
大縦断面図、第３図は、同実施例における電極電位変化
と時間との関係を示す図、第４図は、同実施例における
単位時間当たりの電極電位変化とグルコース濃度との関
係を示す図、第５図は、この発明の応用例における電極
電位変化と時間との関係を示す図、第６図は、同応用例
における電極電位変化とＨ，Ｏ□濃度との関係を示す図
である。 １０：作用電極、　１２：下地電極、 １５：高分子膜、　２０：対照電極。 特許出願人　　　　　　　　立石電機株式会社代理人　
　　　　弁理士　　中　村　茂　信第１図 第３図 時晶（ｍｉｎ） デ／Ｌコース儂斥（Ｍ） 第５図 時間（ｍｉｎ） 第６図 Ｈ２Ｏ２遣／Ｔ（Ｍ） 手続補正書く自船。 昭和６１年　４月１８日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）下地電極表面に高分子膜を形成し、この高分子膜
   中に、被測定検体中に含まれる測定対象生化学物質を基
   質とする酵素と、この酵素による反応に伴い酸化又は還
   元される酸化還元物質とを固定化してなる作用電極と、
   この作用電極と共に被測定検体中に浸漬される対照電極
   とよりなる酵素電極。
2. （２）前記酵素は、グルコースを基質とするグルコース
   オキシダーゼである特許請求の範囲第１項記載の酵素電
   極。
3. （３）前記酸化還元物質は、フェロセンである特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の酵素電極。
4. （４）下地電極表面に高分子膜を形成し、この高分子膜
   中に被測定検体中に含まれる測定対象生化学物質を基質
   とする酵素と、この酵素による反応に伴い酸化又は還元
   される酸化還元物質と、この酸化還元反応の反応速度を
   高める第２の酵素又は触媒を固定化してなる作用電極と
   、この作用電極と共に被測定検体中に浸漬される対照電
   極とよりなる酵素電極。
5. （５）前記酵素は、グルコースを基質とするグルコース
   オキシダーゼである特許請求の範囲第４項記載の酵素電
   極。
6. （６）前記酸化還元物質は、フェロセンである特許請求
   の範囲第４項又は第５項記載の酵素電極。
7. （７）前記第２の酵素は、ペルオキシダーゼである特許
   請求の範囲第４項又は第５項又は第６項記載の酵素電極
   。