JP3514025B2 - タンパク質量の測定方法 - Google Patents
タンパク質量の測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質量の測
定方法に関する。更に詳しくは、タンパク質バイオセン
サを用いたフロー・インジェクション・アナリシス法に
よるタンパク質量の測定方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】タンパク質バイオセンサなどの電気化学
的センサを用いてタンパク質を検出しようとする場合に
は、センサ自体に選択性がないため、測定サンプルであ
る混合物中のタンパク質のみを検出することは一般に困
難である。そのため、タンパク質のみを検出せんとする
場合には、測定サンプルの前処理を必要とし、操作が煩
雑であるといった欠点がみられる。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質バイオセンサを用いたフロー・インジェクション
・アナリシス法によるタンパク質量の測定方法におい
て、タンパク質以外の他の成分の影響を排除し、しかも
簡便なる測定方法を提供することにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
タンパク質のフロー・インジェクション・アナリシス法
において、タンパク質バイオセンサと測定サンプル注入
部とを別流路に設け、注入された測定サンプルを分離膜
と接触させ、タンパク質以外の成分を分離した後、ニッ
ケル薄膜を形成させたタンパク質バイオセンサと接触さ
せるタンパク質量の測定方法によって達成される。 【０００５】 【発明の実施の形態】本発明方法を、図１に示される態
様に従って説明する。この態様においては、タンパク質
バイオセンサ１１と測定サンプル注入部１２とが別流路
に設けられており、これらは切替バルブ１３，１４を介
してキャリア用ポンプ１５と、また切替バルブ１６を介
して分離膜１７とそれぞれ連結されており、分離膜１７
は切替バルブ１８を介してキャリア用ポンプ１９とも連
結されている。 【０００６】このようなシステムを用いてのタンパク質
量の測定は、次のようにして行われる。 【０００７】まず、測定サンプル注入部１２から測定サ
ンプルが注入され、切替バルブ１６によって分離膜１７
方向へのみ測定サンプルが流れるようにする。測定サン
プルの全量が切替バルブ１６を通過した時点で、切替バ
ルブ１４，１３および１６を操作して、タンパク質バイ
オセンサ１１内をキャリア用ポンプ１５からのキャリア
が流れるようにする。これは、キャリアが常時流れてい
ないとセンサの性能が低下し、ノイズが発生するのを防
止するためである。 【０００８】測定サンプル中のタンパク質は、分離膜１
７によってそれの通過が阻止され、それ以下の分子量の
物質は膜を透過し、切替バルブ１８およびライン２０に
よって廃棄される。このような形で廃棄される物質とし
ては、例えばアミノ酸、グルコース、尿素、尿酸、アン
モニア、クレアチニン、アスコルビン酸等が挙げられ
る。 【０００９】一方、通過を阻止されたタンパク質は、分
離膜１７の膜面に保持された状態になっているので、逆
洗をかけてタンパク質バイオセンサ１１へ移送させる。
逆洗は、逆洗前に用いられたキャリアと同等もしくはそ
れ以上に出力が高められたキャリアをキャリア用ポンプ
１９側から切替バルブ１８を通して送ることによって行
われ、膜面に保持されていたタンパク質はそこから溶出
し、切替バルブ１６を通ってセンサ１１に到達する。こ
こで用いられたキァリアは、切替バルブ１３および１４
を通って、ライン２１から排出される。 【００１０】このような一連の操作によって、タンパク
質のみの出力を電気化学的にタンパク質バイオセンサに
よって測定することができ、また逆洗も行われることか
ら、分離膜のファウリング防止の効果も期待される。 【００１１】分離膜としては、ポリスルホン、銅アンモ
ニアセルロース、脱酢酸セルロースアセテート、アクリ
ロニトリル共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリ
ビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん
化物、芳香族ポリアミド、カーボネート-エチレンオキ
シド共重合体、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、
ポリプロピレン、セラミックス等の平膜状、中空糸状、
チューブ状、スパイラル状などの多孔質体よりなる精密
ロ過膜や限外ロ過膜などが用いられる。これらの分離膜
は、例えば分子量約70000のヒト血清アルブミンを含有
する測定サンプルについていえば、それ以下の分画分子
量、例えば分画分子量約50000のものを用いることによ
り、ヒト血清アルブミンは透過させず、分子量約50000
以下の物質のみを透過させる。 【００１２】タンパク質バイオセンサとしては、作用極
リード電極上にタンパク質感応性金属薄膜としてのニッ
ケル薄膜をスパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷
法、メッキ法などによって、一般に約1000〜10000Å、
好ましくは約1000〜6000Åの膜厚で形成させたものが用
いられる。更に、対極および参照極も設けられ、対極は
白金、金、銀、カーボン等から形成され、また参照極と
しては、参照極リード電極上に銀/塩化銀電極を形成さ
せたものが用いられる。 【００１３】測定サンプルとしては、尿、血液、発酵培
養液等が対象とされ、そこに含まれる種々の電極活性物
質が前述の如く分離膜によって除去された後、タンパク
質バイオセンサとの接触が行われ、そこでのタンパク質
量の測定は通常のフロー・インジェクション・アナリシ
ス(FIA)法に従って行われる。 【００１４】 【発明の効果】種々の電極活性物質を混在させた測定サ
ンプル中のタンパク質量を測定するに際し、測定サンプ
ルをタンパク質バイオセンサとは別の流路で注入し、分
離膜で他の混在物質を除去した後センサと接触させるこ
とにより、タンパク質量のみを選択的に検出することが
できる。また、その際に検出の再現性および耐久性の向
上もみられる。 【００１５】 【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。 【００１６】実施例１ アルミナ基板(京セラ製品A-493)１上に、図２に示され
る如き形状の白金対極３、白金作用極リード電極２およ
び白金参照極リード電極４を、いずれも4000Åの膜厚で
蒸着法により形成させた。次いで、参照極リード電極上
にスクリーン印刷法で銀ペーストを印刷し、焼成して銀
電極とした。この銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.
6mA/cm2の電流密度で20分間の定電流電解を行い、参照
極リード電極表面を塩化銀化６した。この定電流電解に
は、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA-501)が
用いられた。 【００１７】その後、メタルマスクでマスキングして、
作用極リード電極２の上部に膜厚4000Åのニッケル薄膜
５を、スパッタリング法によって形成させた。更に、ス
クリーン印刷法によって、所定部位にシリコーン樹脂を
スクリーン印刷し、絶縁膜７を形成させた。 【００１８】このようにして製作されたセンサをセルに
装着した後、分離膜と共にFIA測定装置に組み込み、尿
タンパク質の主成分であるヒト血清アルブミンを所定の
濃度で混合した市販コントロール尿に対する応答性を、
図１に示された態様に従って測定した。この際の分離膜
としては、耐pHが1〜13である分画分子量50000のポリス
ルホン平膜(アドバンテック社製品ウルトラフィルターQ
0500)が用いられた。 【００１９】測定には、電流検出計(B. A. S. 社製LC-4
B)が用いられた。測定サンプルは、0.1mM NiSO4および5
0mMのKClに0.1M NaOHを加えたpH13.0のキャリアの溶液
で調製された。測定は、次の条件に従って行われた。 サンプルインジェクタと分離膜間の距離：0.5m 分離膜とセンサ間の距離：0.5m センサセル容量：28μl サンプル注入量：100μl 使用チューブ：テフロン製、内径0.8mm、外径1/16イン
チ 流速：1.4ml/分 作用極vs.参照極の印加電圧：0.4V 【００２０】それぞれヒト血清アルブミン濃度10mg/d
l、50mg/dlまたは100mg/dlを混合したコントロール尿に
対して、下記表１および図３のグラフに示されるような
出力ピークが得られ、タンパク質量の測定が正確に行え
ることが分かった。 【００２１】 表１ ヒト血清アルブミン濃度(mg/dl) 出力(nA) 0 210 10 405 50 785 100 980 【００２２】また、ヒト血清アルブミン濃度50mg/dlを
混合したコントロール尿について、その測定サンプルを
連続して10回注入して測定する操作を行い、次の表２お
よび図４のグラフに示されるような結果を得た。この結
果から、本発明方法は測定の再現性および耐久性の点に
おいてもすぐれていることが分かる。 【００２３】
定方法に関する。更に詳しくは、タンパク質バイオセン
サを用いたフロー・インジェクション・アナリシス法に
よるタンパク質量の測定方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】タンパク質バイオセンサなどの電気化学
的センサを用いてタンパク質を検出しようとする場合に
は、センサ自体に選択性がないため、測定サンプルであ
る混合物中のタンパク質のみを検出することは一般に困
難である。そのため、タンパク質のみを検出せんとする
場合には、測定サンプルの前処理を必要とし、操作が煩
雑であるといった欠点がみられる。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質バイオセンサを用いたフロー・インジェクション
・アナリシス法によるタンパク質量の測定方法におい
て、タンパク質以外の他の成分の影響を排除し、しかも
簡便なる測定方法を提供することにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
タンパク質のフロー・インジェクション・アナリシス法
において、タンパク質バイオセンサと測定サンプル注入
部とを別流路に設け、注入された測定サンプルを分離膜
と接触させ、タンパク質以外の成分を分離した後、ニッ
ケル薄膜を形成させたタンパク質バイオセンサと接触さ
せるタンパク質量の測定方法によって達成される。 【０００５】 【発明の実施の形態】本発明方法を、図１に示される態
様に従って説明する。この態様においては、タンパク質
バイオセンサ１１と測定サンプル注入部１２とが別流路
に設けられており、これらは切替バルブ１３，１４を介
してキャリア用ポンプ１５と、また切替バルブ１６を介
して分離膜１７とそれぞれ連結されており、分離膜１７
は切替バルブ１８を介してキャリア用ポンプ１９とも連
結されている。 【０００６】このようなシステムを用いてのタンパク質
量の測定は、次のようにして行われる。 【０００７】まず、測定サンプル注入部１２から測定サ
ンプルが注入され、切替バルブ１６によって分離膜１７
方向へのみ測定サンプルが流れるようにする。測定サン
プルの全量が切替バルブ１６を通過した時点で、切替バ
ルブ１４，１３および１６を操作して、タンパク質バイ
オセンサ１１内をキャリア用ポンプ１５からのキャリア
が流れるようにする。これは、キャリアが常時流れてい
ないとセンサの性能が低下し、ノイズが発生するのを防
止するためである。 【０００８】測定サンプル中のタンパク質は、分離膜１
７によってそれの通過が阻止され、それ以下の分子量の
物質は膜を透過し、切替バルブ１８およびライン２０に
よって廃棄される。このような形で廃棄される物質とし
ては、例えばアミノ酸、グルコース、尿素、尿酸、アン
モニア、クレアチニン、アスコルビン酸等が挙げられ
る。 【０００９】一方、通過を阻止されたタンパク質は、分
離膜１７の膜面に保持された状態になっているので、逆
洗をかけてタンパク質バイオセンサ１１へ移送させる。
逆洗は、逆洗前に用いられたキャリアと同等もしくはそ
れ以上に出力が高められたキャリアをキャリア用ポンプ
１９側から切替バルブ１８を通して送ることによって行
われ、膜面に保持されていたタンパク質はそこから溶出
し、切替バルブ１６を通ってセンサ１１に到達する。こ
こで用いられたキァリアは、切替バルブ１３および１４
を通って、ライン２１から排出される。 【００１０】このような一連の操作によって、タンパク
質のみの出力を電気化学的にタンパク質バイオセンサに
よって測定することができ、また逆洗も行われることか
ら、分離膜のファウリング防止の効果も期待される。 【００１１】分離膜としては、ポリスルホン、銅アンモ
ニアセルロース、脱酢酸セルロースアセテート、アクリ
ロニトリル共重合体、ポリメチルメタクリレート、ポリ
ビニルアルコール、エチレン-酢酸ビニル共重合体けん
化物、芳香族ポリアミド、カーボネート-エチレンオキ
シド共重合体、ポリフッ化ビニリデン、ポリエチレン、
ポリプロピレン、セラミックス等の平膜状、中空糸状、
チューブ状、スパイラル状などの多孔質体よりなる精密
ロ過膜や限外ロ過膜などが用いられる。これらの分離膜
は、例えば分子量約70000のヒト血清アルブミンを含有
する測定サンプルについていえば、それ以下の分画分子
量、例えば分画分子量約50000のものを用いることによ
り、ヒト血清アルブミンは透過させず、分子量約50000
以下の物質のみを透過させる。 【００１２】タンパク質バイオセンサとしては、作用極
リード電極上にタンパク質感応性金属薄膜としてのニッ
ケル薄膜をスパッタリング法、蒸着法、スクリーン印刷
法、メッキ法などによって、一般に約1000〜10000Å、
好ましくは約1000〜6000Åの膜厚で形成させたものが用
いられる。更に、対極および参照極も設けられ、対極は
白金、金、銀、カーボン等から形成され、また参照極と
しては、参照極リード電極上に銀/塩化銀電極を形成さ
せたものが用いられる。 【００１３】測定サンプルとしては、尿、血液、発酵培
養液等が対象とされ、そこに含まれる種々の電極活性物
質が前述の如く分離膜によって除去された後、タンパク
質バイオセンサとの接触が行われ、そこでのタンパク質
量の測定は通常のフロー・インジェクション・アナリシ
ス(FIA)法に従って行われる。 【００１４】 【発明の効果】種々の電極活性物質を混在させた測定サ
ンプル中のタンパク質量を測定するに際し、測定サンプ
ルをタンパク質バイオセンサとは別の流路で注入し、分
離膜で他の混在物質を除去した後センサと接触させるこ
とにより、タンパク質量のみを選択的に検出することが
できる。また、その際に検出の再現性および耐久性の向
上もみられる。 【００１５】 【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。 【００１６】実施例１ アルミナ基板(京セラ製品A-493)１上に、図２に示され
る如き形状の白金対極３、白金作用極リード電極２およ
び白金参照極リード電極４を、いずれも4000Åの膜厚で
蒸着法により形成させた。次いで、参照極リード電極上
にスクリーン印刷法で銀ペーストを印刷し、焼成して銀
電極とした。この銀電極部分を0.1M塩酸中に浸漬し、0.
6mA/cm2の電流密度で20分間の定電流電解を行い、参照
極リード電極表面を塩化銀化６した。この定電流電解に
は、ポテンショガルバノスタット(北斗電工製HA-501)が
用いられた。 【００１７】その後、メタルマスクでマスキングして、
作用極リード電極２の上部に膜厚4000Åのニッケル薄膜
５を、スパッタリング法によって形成させた。更に、ス
クリーン印刷法によって、所定部位にシリコーン樹脂を
スクリーン印刷し、絶縁膜７を形成させた。 【００１８】このようにして製作されたセンサをセルに
装着した後、分離膜と共にFIA測定装置に組み込み、尿
タンパク質の主成分であるヒト血清アルブミンを所定の
濃度で混合した市販コントロール尿に対する応答性を、
図１に示された態様に従って測定した。この際の分離膜
としては、耐pHが1〜13である分画分子量50000のポリス
ルホン平膜(アドバンテック社製品ウルトラフィルターQ
0500)が用いられた。 【００１９】測定には、電流検出計(B. A. S. 社製LC-4
B)が用いられた。測定サンプルは、0.1mM NiSO4および5
0mMのKClに0.1M NaOHを加えたpH13.0のキャリアの溶液
で調製された。測定は、次の条件に従って行われた。 サンプルインジェクタと分離膜間の距離：0.5m 分離膜とセンサ間の距離：0.5m センサセル容量：28μl サンプル注入量：100μl 使用チューブ：テフロン製、内径0.8mm、外径1/16イン
チ 流速：1.4ml/分 作用極vs.参照極の印加電圧：0.4V 【００２０】それぞれヒト血清アルブミン濃度10mg/d
l、50mg/dlまたは100mg/dlを混合したコントロール尿に
対して、下記表１および図３のグラフに示されるような
出力ピークが得られ、タンパク質量の測定が正確に行え
ることが分かった。 【００２１】 表１ ヒト血清アルブミン濃度(mg/dl) 出力(nA) 0 210 10 405 50 785 100 980 【００２２】また、ヒト血清アルブミン濃度50mg/dlを
混合したコントロール尿について、その測定サンプルを
連続して10回注入して測定する操作を行い、次の表２お
よび図４のグラフに示されるような結果を得た。この結
果から、本発明方法は測定の再現性および耐久性の点に
おいてもすぐれていることが分かる。 【００２３】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法の一態様の概要図である。
【図２】本発明方法で用いられるタンパク質バイオセン
サの一態様の平面図である。 【図３】ヒト血清アルブミン濃度と出力との関係を示す
グラフである。 【図４】測定回数と出力との関係を示すグラフである。 【符号の説明】 １ 絶縁性基板 ２ 作用極リード電極 ３ 対極 ５ タンパク質感応性金属薄膜 ６ 参照極 １１ タンパク質バイオセンサ １２ 測定サンプル注入部 １５，１９ キャリア用ポンプ １７ 分離膜
サの一態様の平面図である。 【図３】ヒト血清アルブミン濃度と出力との関係を示す
グラフである。 【図４】測定回数と出力との関係を示すグラフである。 【符号の説明】 １ 絶縁性基板 ２ 作用極リード電極 ３ 対極 ５ タンパク質感応性金属薄膜 ６ 参照極 １１ タンパク質バイオセンサ １２ 測定サンプル注入部 １５，１９ キャリア用ポンプ １７ 分離膜
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 タンパク質のフロー・インジェクション
・アナリシス法において、タンパク質バイオセンサと測
定サンプル注入部とを別流路に設け、注入された測定サ
ンプルを分離膜と接触させ、タンパク質以外の成分を分
離した後、ニッケル薄膜を形成させたタンパク質バイオ
センサと接触させることを特徴とするタンパク質量の測
定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01931896A JP3514025B2 (ja) | 1996-01-10 | 1996-01-10 | タンパク質量の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01931896A JP3514025B2 (ja) | 1996-01-10 | 1996-01-10 | タンパク質量の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09189677A JPH09189677A (ja) | 1997-07-22 |
| JP3514025B2 true JP3514025B2 (ja) | 2004-03-31 |
Family
ID=11996065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01931896A Expired - Fee Related JP3514025B2 (ja) | 1996-01-10 | 1996-01-10 | タンパク質量の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3514025B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001242115A (ja) * | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Techno Medica Co Ltd | 電気化学センサー用の参照電極 |
| AT408662B (de) * | 2000-05-16 | 2002-02-25 | Hoffmann La Roche | Creatinin-sensor |
| JP2005214919A (ja) * | 2004-02-02 | 2005-08-11 | Toray Ind Inc | タンパク質および／もしくはペプチド分析前処理用分離膜 |
| JP4635258B2 (ja) * | 2006-03-02 | 2011-02-23 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | バイオセンサー |
-
1996
- 1996-01-10 JP JP01931896A patent/JP3514025B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09189677A (ja) | 1997-07-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20031224 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040106 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |