JPH0564732B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (イ) 産業上の利用分野 この発明はバイオセンサに関する。さらに詳し
くは、固定化酵素と、化学物質感応性電極とを組
合せてなり、臨床分析や工業プロセス、環境化学
などの分析分野に有用なバイオセンサに関する。

(ロ) 従来技術 最近、固定化酵素膜等の機能性膜と、電極、サ
ーミスタ、フオトンカウンタ、音波検知機等のト
ランスジユーサとを組合せてなり、酵素反応等に
起因する化学物質の生成や増減、熱の発生、発
光、音波等をトランスジユーサにより電気信号に
変換しこの出力に基づいて試料中の種々の成分を
分析するバイオセンサが種々提案されている。

これらバイオセンサのうち、酵素反応により生
成したり増減する化学物質を指標とするバイオセ
ンサは通常、イオン選択性電極やイオン選択性電
界効果型トランジスタ（ISFET）の如き化学物
質感応性電極をトランスジユーサとしてなり、こ
の感応面に固定化酵素膜を装着してなる。そして
酵素を固定化する膜状担体としてはセルロースア
セテート、ポリグルタメート、イオン交換樹脂、
多孔性ポリ塩化ビニル等の有機ポリマーが通常用
いられている。

しかしながら、かようなバイオセンサにおいて
は、膜状担体と感応面との密着性が不充分であ
り、そのため安定した性能が得られず長期間の使
用に適さないという問題点があつた。

(ハ) 発明の目的 この発明は、上記従来の問題点を解消すべくな
されたものであり、安定な性能を有し長期間の使
用に適したバイオセンサを提供しようとするもの
である。

本発明者らは、従来のバイオセンサにおける電
極と固定化酵素膜との弱い密着性は、イオン選択
性電極では酸化アルミニウムや酸化ケイ素、
ISFETでは酸化ケイ素や窒化ケイ素等を主体と
する無機固体からなる電極感応面と固定化酵素の
担体である有機ポリマーとの非親和性に起因する
ものと考察し、これに基づいて鋭意研究検討を行
なうことによりこの発明に到達した。

(ニ) 発明の構成 かくしてこの発明によれば、無機固体感応面を
備えた化学物質感応性電極をトランスジユーサと
してなり、該電極の感応面上に、所定の酵素を固
定化した金属水酸化物系ゲルからなる固定化酵素
膜を密着形成してなることを特徴とするバイオセ
ンサが提供される。

この発明における「無機固体感応面を備えた化
学物質感応性電極」としては、従来のバイオセン
サに用いられている種々の固定電極や半導体電極
及びその均等物を適用することができ、より具体
的にはイオン選択性電極、イオン選択性電界効果
型トランジスタ（ISFET）、白金電極等が挙げら
れる。通常、酵素反応によるPH変化を検知するPH
ガラス電極やPH−ISFETを用いるのが汎用性の
点で好ましい。

この発明のバイオセンサは、上記化学物質感応
性電極の感応面（すなわち、例えばガラス電極や
白金電極の場合は端部や全面、ISFETの場合は
そのゲート面）上にその場で金属水酸化物系ゲル
膜を形成させ、該ゲル膜に酵素を固定化すること
により得ることができる。この際形成されるゲル
膜は薄膜でかつ感応面に密着していることを要す
る。かかるゲル膜は、金属アルコシドや酵素を配
位子とする有機金属キレート化合物を溶解した易
揮発性の親水性溶媒溶液（例えば、メタノール、
エタノール等の低級アルコール溶液）に酸を添加
し、この液を上記感応面に塗布し、次いでこれを
そのまま又は加熱下放置して上記化合物の加水分
解及び乾燥を進行させて対応する金属水酸化物に
変換することにより形成させることができる。

上記ゲル膜の原料となる金属アルコキシドとし
ては、Si（OHC₃）₄，Si（OC₂H₅）₄，Ti（OC₃H₇）₄，
Ｖ（OC₂H₅）₃，Al（OC₃H₇）₃，Co（OC₂H₅）₂，Ni
（OC₂H₅）₂，Fe（OC₂H₅）₃等が挙げられ、これら
のうち低級アルコキシシランが好ましい。また、
酵素を配位子とする有機金属キレート化合物とし
ては、アルカンジオン又はその誘導体の金属キレ
ート化合物が適しており、例えば、２，４−ペン
タンジオン（アセチルアセトン）、３−フエニル
−２，４−ペンタンジオン（３−フエニルアセチ
ルアセトン）、２，４−ヘキサンジオン、２，４
（又は３，５）−ヘプタンジオン、２，２，６，６
−テトラメチル−３，５−ヘプタンジオン（ジピ
パロイルメタン）等の低級アルカンジオン類のカ
ルシウム、アルミニウム、チタン、亜鉛、鉄又は
カリウムキレート化合物が挙げられる。これら金
属アルコキシドや有機金属キレート化合物はもち
ろん混合して用いてもよい。

また、上記親水性溶媒溶液中に添加する酸とし
ては種々の鉱酸が挙げられるが、フツ化水素酸を
用いるのが好ましく、塩酸でPH１〜８とした後フ
ツ化水素酸を少量添加するのが最も好ましい。フ
ツ化水素酸の添加量は金属に対するモル比として
0.05〜1.0モル程度が適切である。なお、この溶
液中には少量の水が添加されていてもよい。

このようにして感応面上で直接形成される金属
水酸化物系のゲル膜は、感応面に密着した薄膜状
（通常約0.1〜0.5μm）のものであり、しかも酵素
固定化に至適な多数の水酸基を有しかつ多孔性の
ものである。

感応面上に形成された上記ゲル膜への酵素の固
定化自体は、シランカツプリング剤を用いた方法
や臭化シアン活性化法等の公知の方法を適用する
ことができ、その一つの好ましい例として、γ−
アミノプロピルトリエトキシシランの溶液と上記
ゲル膜とを接触させてカツプリング基を導入し、
次いでグルタルアルデヒドの溶液と接触させて、
最後に所望の酵素溶液と接触させてシツフ塩基結
合により酵素を固定化する方法が挙げられる。

固定化する酵素としては、分析を意図する成分
を基質としかつ化学物質感応性電極が応答を示す
酵素反応を行ないうるものが種々適用できる。こ
れらのうち、少なくとも酵素反応によりPH変化を
生じうる酵素を適用するのが好ましく、この際化
学物質感応性電極としてはPHガラス電極又はPH−
ISFETを用いるが好ましい。これらの酵素と目
的成分との具体的な組合せとしては、グルコース
オキシダーゼとグルコース、尿素窒素とウレアー
ゼ、ガラクトールとガラクトースオキシダーゼ、
中性脂肪とリパーゼ、ペニシリンとペニシリナー
ゼ等が挙げられる。

この発明のバイオセンサの具体例を第１図及び
第２図に示した。第１図に示すバイオセンサ１
は、Ag／AgCl内部極２１及び内部液２２を有す
る円筒状のPHガラス電極２の先端部感応面３に、
金属水酸化物系ゲル膜に酵素を固定した固定化酵
素膜４を密着形成してなる。一方、第２図Ａ及び
Ｂに示すバイオセンサ１′は、MOS電界効果型ト
ランジスタ素子（５；PH−ISFET）のゲート５
５上に上記と同様な固定化酵素膜４を密着形成し
てなる。なお、第２図中、５１はSiO₂やSi₃N₄等
からなり、PH感応面となる絶縁膜、５２は半導体
層、５３はソース領域、５４はドレイン領域をそ
れぞれ示すものである。

なお、この発明のバイオセンサは、通常、参照
電極と組合せてポテンシヨメトリツクな測定に用
いるのが適している。この際の参照電極としては
イオン選択性電極やISFETの分野で公知のもの
をそのまま用いることができるが、バイオセンサ
に用いる化学物質感応性電極の感応面に酵素未固
定の金属水酸化物系ゲル膜を前述と同様に密着形
成してなる参照電極を用いることが好ましい。

なお、場合によつてはアンペロメトリツクな測
定に供することもでき、この際には印加用の電極
と組合せて用いればよい。

(ホ) 実施例 ゲート上にSiO₂層及びSi₃N₄層を形成してPH感
応面を設定したPH−ISFET（長さ８mm、幅0.6mm、
ゲート面積約0.05mm²）を用いてこの発明のバイオ
センサを作製した。

まず、テトラエトキシシラン5.4mol、エチル
アルコール50ml、水５ml及び塩素１mlからなる金
属アルコキシド溶液を浸漬法により上記PH−
ISFETに塗布することによりゲート面上に該溶
液を被覆させた。次いで、このPH−ISFETを80
℃下１時間大気中に放置することにより、テトラ
エトキシシランの加水分解及び溶媒等の乾燥を進
行させてゲート面上に膜厚約2000ÅのSi（OH）₄系
ゲル膜を形成させた。

ゲル膜が形成されたPH−ISFETを、5wt％のγ
−アミノプロピルトリエトキシシランのPH3.5緩
衝水溶液中に浸漬し85℃下２時間保持してゲル膜
中の水酸基を介してカツプリング剤を結合導入
し、水洗後、2.5wt％のグルタルアルデヒドのPH
7.0緩衝水溶液に浸漬し、20分間脱気した後30℃
下で40分間保持してカツプリング剤の末端にアル
デヒド基を有するシツフベースを導入した。

このように処理されたPH−ISFETをウレアー
ゼ100Uの水溶液（PH7.0の0.1Mリン酸塩緩衝液５
mlに溶解）中に浸漬し、５分間脱気した後、30℃
下で３時間保持することにより、上記酵素の固定
化反応を行ない、第２図に示すごときこの発明の
バイオセンサ（尿素検出用）を得た。

この半導体バイオセンサは、試料液中の尿素と
固定化されたウレアーゼとの酵素反応に起因する
PH上昇をPH−ISFETで検知しうるよう構成され
たものであり、この出力に基ずいて試料液中の尿
素の定性や定量が行ない得るものである。なお、
この出力は適当な演算回路やインテグレータを介
して尿素換算量としてリアルタイムに表示や記録
可能である。

上記で得られたバイオセンサを用いて種々の濃
度の尿素水溶液（PH7.0の0.01Mリン酸塩緩衝液
中）についての出力（発生電位）を測定した結果
を第３図に示した。なお、この際の参照電極とし
ては酵素未固定のPH−ISFETを用いてバイアス
電極としてはAg／AgCl（内部液は飽和KCl溶液）
電極を用いた。

このように、上記バイオセンサは尿素濃度10^-4
ｇ／mlから10^-1ｇ／ml近くまで直線性が良好であ
ることが判る。従つて、酵素活性が高く感度及び
精度が良好であることが確認された。

なお、このバイオセンサを40日間リン酸緩衝水
溶液（PH7.0）に浸漬した後の出力変化を調べた
ところ尿素濃度変化に対する出力電位には変化は
見られないことが判つた。これに対し、セルロー
ストリアセテートポリマーを担体として同様に構
成した従来のバイオセンサでは寿命が１週間程度
で、膜が剥れてしまい、この発明のバイオセンサ
が、耐久性及び応答の安定性点で著しく優れてい
ることが確認された。

(ヘ) 発明の効果 以上述べたごとく、この発明のバイオセンサ
は、センサとしての安定な性能を備えた耐久性の
優れたものであり、かつ、感度も優れたものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明のバイオセンサの一具体例
を示す構成説明図、第２図Ａは、同じく他の具体
例を示す平面図、第２図Ｂは、第２図Ａのイ−イ
断面図、第３図は、この発明のバイオセンサの出
力と被成分濃度との関係を例示するグラフであ
る。 １，１′……バイオセンサ、２……PHガラス電
極、３……先端部感応面、４……固定化酵素膜、
５……PH−ISFET、５５……ゲート。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 無機固体感応面を備えた化学物質感応性電極
   をトランスジユーサとしてなり、該電極の感応面
   上に、所定の酵素を固定化した金属水酸化物系ゲ
   ルからなる固定化酵素膜を密着形成してなること
   を特徴とするバイオセンサ。 ２ 金属水酸化物系ゲルが、金属アルコキシド又
   は酵素を配位子とする有機金属キレート化合物の
   加水分解生成物である特許請求の範囲第１項記載
   のバイオセンサ。 ３ 化学物質感応性電極が、イオン選択性電極又
   はイオン選択性電界効果型トランジスタである特
   許請求の範囲第１項又は第２項記載のバイオセン
   サ。