JPS63182559A - 酵素電極の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化酵素電極（以下酵素電極と略す）の製
造方法に関し、特に電気化学的妨害物質の影響を受けず
、感度、応答速度に優れた酵素電極の製造方法に関する
ものである。

（従来の技術） 酵素反応を生体物質や食品等に含まれる目的物質の定量
に用いることは、その反応速度の速さ及び基質特異性を
有する等の利点から広く行われている。

特に酵素電極を用いた目的物質の濃度測定法は微量の酵
素を反復利用する可能性を開き、その応用範囲を医療、
食品、薬品分析等に広げつつある。

一定電圧を酵素電極に印加しながら、酵素反応による生
成物の電極反応に伴う電流値を計測するアンペロメトリ
ック法は、一般に電極構成が簡単で、かつ高感度化が可
能であり、特に反応に際し過酸化水素を形成するオキシ
ダーゼ（Ｈ２０□形成オキシダーゼと略す）反応系を利
用する電極は応答速度、感度共に比較的価れるため広く
研究されている。

しかしこの方法には被検体中に還元物質が混入している
と、その影響を受は目的物質の濃度を正確に測定出来な
いという欠点がある。

例えばグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）を用いたグル
コース定量の場合、（ｉ）式により生じた過酸化水素は
、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）に対して＋０
．６Ｖ前後の電圧で（ｉ］）式の如く電極反応を起こす
。この時に流れる電流量はグルコース濃度に比例するこ
とから、グルコース濃度の定量が可能となる。

ｔｔ＋ｂコース　＋酸素　　−〉　　６　−ゲルゴノラ
クトン十８２０□　（ｉ）１１ｚｏ□　　−一一斉　　
０２＋２Ｈ”　　＋２ｅ−（ｉｉ）酵素による反応（ｉ
）は測定目的物質であるグルコースに対し高度の基質特
異性を有するが、電極反応（ｉｉ　）は種々の還元物質
つまり妨害物質が電極上で酸化されるため、測定電流に
は妨害物質が酸化された時に生じる電流が上乗せされ、
測定誤差を生じる。食品、生体液中に存在する妨害物質
には、アスコルビン酸、尿素、還元型グルクチオン、チ
ロシン等が知られている。

従来上記の問題を解決するために、最も多く用いられて
きた手法としては、前記のオキシダーゼ反応により生じ
る過酸化水素を測定する系において、固定化酵素層と白
金等の導電性基体間にアセチルセルロース等から成る選
択透過膜を設け、過酸化水素のみが透過する条件下で測
定を実施するものがある。しかしながら、選択透過膜−
酵素層複合系と導電性基体との間に電解液、緩衝液等で
満たされた間隙が存在するので、酵素反応で生じた過酸
化水素が選択透過膜及び間隙に拡散するのに時間を要し
、応答速度の向上を阻む要因となっている。また過酸化
水素が間隙中で希釈されるため電気検出系を極度に高感
度化する必要がある。

このような問題に対しては選択透過膜を薄くし、過酸化
水素が膜を透過し易くすることが考えられるが、妨害物
質も一部透過してしまう欠点がある。

また電極系全体をミクロ化すれば拡散、希釈による応答
速度の遅れは防げるが、電極面積の低下による電流量の
減少によって電流検出系製作上の問題が残り、好ましい
ものではない。さらにアセチルセルロース膜等の選択透
過膜をキャスティングの手法を用いて導電性基体上に直
接作成することが考えられるが、従来の選択透過膜の材
質では導電性基体と選択透過膜間の付着力が弱く耐久性
の点で満足できるものではない。この欠点は、特に分析
の自動化・高速化を進める上で不可欠のフロー型測定装
置では選択透過膜に液の流れに基づく一３＝ 剪断力が加わるため、大きな開発上の制約となっている
。

（発明が解決しようとする問題点） かかる現状に鑑み本発明者等は、妨害物質の影響を有効
に除去した酵素電極の製造法に関し鋭意研究の結果、導
電性基体上に特定の条件で架橋アルブミン層を形成し、
その上に酵素層を形成することにより妨害物質の影響を
受けず、感度、応答速度、耐久性、長期安定性に優れた
酵素電極が得られることを見出し本発明を完成するに至
った。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、導電性基体上に０．１〜０．５重量％濃度の
多官能基性アルデヒドを含むアルブミン溶液を塗布し、
０〜１０℃の温度範囲で架橋アルブミン層を形成後、該
架橋アルブミン層上に０．５重量％濃度以下の多官能基
性アルデヒドとＨ，Ｏ□形成オキシダーゼを含有する溶
液を塗布してＨ，０□形成オキシダ一ゼ含有層を形成す
ることを特徴とする酵素電極の製造方法である。

（作用） ＝４− ・本発明においては、導電性基体として白金またはグラ
ファイト製の棒状あるいは板状体が用いられる。導電性
基体は、酵素電極感度のロット差をなくすため、先づ祇
やすりやアルミナ粉末等で研磨し、希硫酸水溶液中で三
角波電位走査する等の方法で清浄化処理することが望ま
しい。

次に第１図に示すように、アルブミンを蒸留水等に溶解
し、多官能基性アルデヒドを加えた混合液を導電性基体
＋１１上に塗布し、選択透過性を有する架橋アルブミン
層（２）を形成する。アルブミンは付着力が強いため耐
久性に優れた酵素電極が得られる。この際、多官能基性
アルデヒドの濃度が高すぎると良好な選択透過性が得ら
れず、妨害物質を一部透過するものとなる。これは多官
能基性アルデヒドによりアルブミンの高次構造が変化す
るためと推測される。逆に濃度が低すぎるとアルブミン
の架橋が不充分で長期使用に耐えるものが出来ないため
、多官能基性アルデヒドの濃度は０．１〜０．５重量％
（以下、単に％と表記する）に調整する必要がある。多
官能基性アルデヒドとしては６一 グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、グリオキ
サール等が挙げられるが、グルタルアルデヒドは酵素の
活性を阻害し難いため好ましい。溶液中のアルブミン濃
度は均一な塗布を行うために０．１〜５％とすることが
好ましい。またアルブミン塗布量は５〜５０ｇ／ｍ程度
である。溶媒に塩類を含む緩衝液を使用すると後述する
架橋反応時に塩類が析出し、均一な架橋アルブミン層の
形成を防げるため、蒸留水のみを用いるか、ＰＨを制御
する場合は酢酸、アンモニア等の析出しないものを使用
することが望ましい。

次に塗布したアルブミン層を適度な条件下で架橋反応さ
せるが導電性基体（１）に上記のアルブミン溶液を塗布
した後、そのまま室温に保持して架橋反応を行うと選択
透過性に優れたものは得られない。これは室温下では架
橋反応が速く進むが、部分的に不均一に進行するためと
推測される。このため多官能基性アルデヒドの濃度を規
制すると同時に架橋反応を特定の条件下で行う必要があ
る。

而して導電性基体（１１にアルブミン溶液を塗布した後
、先づ０〜１０°Ｃの温度範囲、より好ましくは２〜８
℃で架橋反応を行う。本発明においては架橋反応の初期
段階を上記温度範囲で行うため反応が均一に進み選択透
過性の優れた膜が得られる。

かかる架橋反応を長期間行うと逆に選択透過性が損なわ
れるので通常２０分〜２４時間、より好ましくは、３０
分〜４時間行う。この際、多官能基性アルデヒド濃度の
変化とアルブミン層の乾燥を防ぐために、密封容器中に
多官能基性アルデヒド水溶液を入れ、その飽和蒸気存在
下で反応を行うことが好ましい。

上記の架橋反応後直ちにＨ２０□形成オキシダーゼ含有
層を形成することも可能であるが、飽和蒸気存在下から
導電性基体（］）に架橋アルブミン層（２）を形成した
試料を取り出し１０℃〜５０°Ｃ下で処理を行うと、第
２図に示すように過剰の多官能基性アルデヒド及び水分
を除き、架橋反応を完結させることが出来る。かかる処
理は４０℃の場合１５分〜３０分で完了する。

次に、第３図に示すように、得られた架橋アルＩ− ブミンの選択透過層上に８２０□形成オキシダ一ゼ含有
層（３）を形成する。先づ多官能基性アルデヒドとＨ，
Ｏ□形成オキシダーゼを含有する溶液、またはこれにア
ルブミンをさらに加えた溶液を塗布するが、多官能基性
アルデヒドは架橋アルブミン層（２）へも浸透して行く
ため、その濃度が高いと架橋アルブミン層（２）の選択
透過性が損なわれる。従って多官能基性アルデヒド濃度
は０．５％以下、好ましくは架橋アルブミン層（２）を
形成するのに用いた溶液中の濃度以下とする必要がある
。ただし通常オキシダーゼを固定するためには０．１％
濃度以上の多官能基性アルデヒドが必要である。かかる
オキシダーゼ含有溶液には緩衝液を用いることが出来る
が、０、１　ｍｏｌ／　Ｉｌ以下の希薄なものを用いた
方が先に形成した架橋アルブミン層（２）を破損せず好
ましい。

固定化に要する時間は架橋アルブミンＮ（２）を形成す
る場合よりも短時間で充分である。

なお、本発明において架橋アルブミン層（２）の導電性
基体（１）への付着力をさらに強める目的で公知のシラ
ンカップリング剤を用いた化学結合処理を行うこともで
きる。

本発明の製造方法によれば、過酸化水素を透過し、妨害
物質を通さない優れた選択透過層を有する酵素電極が得
られる。また本発明では特定の選択透過層が導電性基体
上に直接形成されるため、過酸化水素の不必要な希釈は
起こらず、感度、応答速度に優れ、耐久性、長期安定性
にも優れた酵素電極が得られる。

以下に実施例を示すが、本発明は、これに限定されるも
のではない。なお、％は重量％を示す。

〔実施例１〕 直径２Ｎの白金線表面を紙やすりと０．５μｍ径のアル
ミナ粉末で研磨後、０．１　ｍｏｌ／βの硫酸水溶液に
浸漬し、対５ＣＥ−０，３Ｖ　〜＋１．３Ｖ（７）電位
範囲で１．　Ｑ　Ｖ　／ＳｅＣの速度で三角波電位走査
を５分間反復し、さらに蒸留水で洗浄後、４０°Ｃで１
５分間乾燥して電気化学的に清浄な表面を得た。

電極表面が水平になるように固定し、２％ウシ血清アル
ブミン（Ｓｉｇｍａ社製；フラクションＶ）水溶液に０
．２％になるようにグルタルアルデヒドを添加した液を
マイクロシリンジで５μｌ点滴した。この試料を、グル
タルアルデヒド水溶液を入れ飽和蒸気雰囲気とした密封
容器に入れ、４°Ｃで２時間放置した。更に試料を密封
容器より取り出し４０℃で３０分間処理した。

次に１％グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製；Ｔ
ｙｐｅ　ＩＩ、　　３６０００ｕｎｉｔｓ／ｇ　）と１
％のウシ血清アルブミンを含む０．１　ｍｏｌ／　７！
リン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，０）に０．２％にな
るようにグルタルアルデヒドを加え、この２．５μｌを
架橋アルブミン層表面に点滴した。これを４０°Ｃで３
０分間処理後、０．１　ｍｏｌ／βリン酸ナトリウム緩
衝液（ＰＨ７，０）で洗浄して酵素電極を得た。これを
フロー型測定装置のセルに装着し、ポテンシオスタフト
を用いて対極との電位を＋０．６■に設定し、ポンプで
Ｐ　Ｈ７，０の緩衝液を１．０ｍｌ／ｍｉｎの速度で流
し、注入口より１０ｍＭの過酸化水素、グルコース、ア
スコルビン酸水溶液を１０μβずつ注入して、それぞれ
のピーク電流値を比較した。この結果を第１表に示す。

〔比較例１〕 架橋アルブミン層を形成せずに、グルコースオキシダー
ゼ含有層を直接白金線上に形成した以外は実施例１と同
様に測定を行った。その結果を第１表に示す。

〔比較例２〕 直径２１ｍの白金線表面を実施例１と同様に清浄処理し
、架橋アルブミン層を形成した。

次に１％グルコースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製；Ｔ
ｙｐｅ　Ｈ，３６０００ｕｎｉｔｓ／ｇ　）と１％のウ
シ血清アルブミンを含む０．１　ｍｏｌ／　Ｉｔリン酸
ナナトリウム緩衝液ＰＩ（７，０）に１．０％になるよ
うにグルタルアルデヒドを加え、架橋アルブミン層表面
に点滴して実施例１と同様にグルコースオキシダーゼ含
有層を形成し、同様の測定を行った。この結果を第１表
に示す。

本発明にかかる実施例１では過酸化水素、グルコースに
は応答を示すが、妨害物質であるアスコルビン酸には応
答を示さず、良好な選択透過層が形成されたことがわか
る。これに対し架橋アルダｌｌ− ミン層を有さない比較例１では過酸化水素、グルコース
に対する応答は実施例１とほぼ同じであるが、アスコル
ビン酸に対して過酸化水素の約６割の応答を示しており
妨害物質の影響が大きいことが判る。

グルコースオキシダーゼ含有溶液のグルタルアルデヒド
濃度を１．０％とした比較例２では、アスコルビン酸に
対して過酸化水素の約３割の応答を示しており、架橋ア
ルブミン層がアスコルビン酸を透過させていることが判
る。これはオキシダーゼ含有層より高濃度のグルタルア
ルデヒドが架橋アルブミン層へ浸透するためその選択透
過性が損なわれたためである。

第１表 第１表における各数字は、過酸化水素、グルコース、ア
スコルビン酸に対する応答感度を示すものである。

（効果） 本発明は妨害物質の影響を除去した正確、かつ高感度の
酵素電極製造方法であった。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は本発明の酵素電極の製造方法における
各工程を例示するもので、第１図は導電性基体上に架橋
アルブミン層を形成する工程、第２図は該架橋アルブミ
ン層における架橋反応を完結させる工程、第３図は８２
０□形成オキシダ一ゼ含有層を形成する工程を示すもの
である。 （１）・・・導電性基体 （２）・・・架橋アルブミン層

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 導電性基体上に０．１〜０．５重量％濃度の多官能基性
   アルデヒドを含むアルブミン溶液を塗布し、０〜１０℃
   の温度範囲で架橋アルブミン層を形成後、該架橋アルブ
   ミン層上に０．５重量％濃度以下の多官能基性アルデヒ
   ドとＨ＿２Ｏ＿２形成オキシダーゼを含有する溶液を塗
   布してＨ＿２Ｏ＿２形成オキシダーゼ含有層を形成する
   ことを特徴とする酵素電極の製造方法。