JPH02110362A

JPH02110362A - 酵素電極

Info

Publication number: JPH02110362A
Application number: JP63264975A
Authority: JP
Inventors: Isao Taniguchi; 功谷口; Koichi Takizawa; 滝沢　耕一
Original assignee: Omron Tateisi Electronics Co
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1988-10-20
Filing date: 1988-10-20
Publication date: 1990-04-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、被測定検体中の生化学物質濃度を、酵素反
応を利用して電気的に測定するための酵素電極に関する
ものである。

（ロ）従来の技術被測定検体中の生化学物質濃度を、酵素反応を利用して
電気的に測定する酵素電極として、近年高分子膜上に酵
素を固定化したものが提案されている。この酵素電極は
、例えば白金等よりなり下地電極上に、高分子膜を電解
重合により形成し、この高分子膜に測定対象たる生化学
物質を基質とする酵素と、この酵素の反応に伴い酸化若
しくは還元される酸化還元物質とを固定化してなるもの
である。

（ハ）発明が解決しようとする課題上記従来の酸素電極にあっては、高分子膜が薄いために
固定化できる酵素及び酸化還元物質の量が極めて少ない
。従って、電極出力が小さい、測定感度が低い、応答が
おそい、あるいは測定可能な濃度範囲が狭いといった実
用性に欠ける面があった。

また、前記高分子膜は機械的強度が小さく、下地電極の
表面が露出しやすい。このため、電極出力にノイズが混
入したり、電極出力がドリフトし測定精度が劣化する問
題点があった。さらに、酵素電極及び酸化還元物質の流
出が生じやすく、使用耐久性、保存性が劣る問題点があ
った。

下地電極を大きくすれば、電極出力の大きさ、及びその
安定性は改善することができる。しかしながら、近年酵
素電極の微小化が要求されているので、下地電極を大き
くすることはこの要求に反することとなる。

この発明は、上記に鑑みなされたもので、高分子膜に多
量の酵素及び酸化還元物質を固定化でき、高分子膜の機
械的強度を高めると共に、その微小化を可能とする酵素
電極の提供を目的としている。

（ニ）課題を解決するための手段上記課題を解決するため、この発明の酵素電極は、作用
電極と対照電極とよりなり、少なくともこの作用電極の
下地電極上には高分子膜を装着し、この高分子膜には酵
素とこの酵素の反応に伴い酸化又は還元される酸化還元
物質とを固定化してなるものにおいて、前記高分子膜は
、第１の高分子膜と第２の高分子膜とよりなり、この第
１の高分子膜は前記下地電極上に直接装着されて、前記
酸化還元物質が固定化され、前記第２の高分子膜はこの
第１の高分子膜上に重ねて装着されて、これら第１の高
分子膜及び第２の高分子膜に前記酵素が固定化されるこ
とを特徴とするものである。

（ホ）作用この発明の酵素電極では、高分子膜が二重になっている
から、高分子膜に固定化できる酵素及び酸化還元物質を
多量にできる。よって、電極出力の増大、測定感度と応
答速度の向上、及び測定範囲の拡張を図ることができる
。また、高分子膜の機械的強度が向上できるから、下地
電極が露出することが少なく、酵素及び酸化還元物質の
流出を防止することができ、測定精度の劣化防止及び使
用耐久性と保存性の向上とを図ることができる。

（へ）実施例〈実施例１〉この発明の第１の実施例を第１図乃至第４図に基づいて
以下に説明する。

この実施例は、グルコース濃度の測定用の酵素電極に本
発明を適用したものであり、第１図は、この実施例に係
る酵素電極の作用電極２の縦断面図を示している。３は
、底部３ａが閉塞されたガラス管（例えば細い試験管）
であり、底部３ａには、下地電極５が貫通した状態で支
持される。この実施例では、下地電極５として直径０．
５Ｍ、長さ５ｆｆＩ１１１の白金（ＰＬ）ＰＩを用いて
いるが、他の金属やカーボン類を使用してもよい。

下地電極５の上＠５ａには、リード６が接続されており
、このリード６はガラス管３の開口部２ｂより外部に引
き出される。ガラス管３内は、樹脂（例えばエポキシ樹
脂）４が充填される。一方、下地電極５のガラス管底部
３ａより垂下する部分には、二重のポリチラミン膜７が
形成されている。

このポリチラミン膜７には、酵素としてグルコースオキ
シダーゼ（ＣＯＤ）及び酸化還元物質としてフェロセン
カルボアルデヒド（ＦＣＡ）が固定化されている。

次に、二重のポリチラミン膜７の形成方法並びに、ＣＯ
Ｄ及びＦＣＡの固定方法を説明する。

まず、第１のポリチラミン膜７−１を電解重合により下
地電極５表面に形成する。この電解重合に用いる電解液
は、メタノール（ＣＨ，ｏ　Ｈ）に、０．１Ｍのチラミ
ン及び０．３Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を溶解
したものである。この電解液中に作用電極２の下地電極
５を、対照電極としての塩化！！ｉ　（Ａｇ　／Ａｇ　
Ｃｉ、　）電極及びカウンタ電極としての白金電極と共
に浸漬し、下地電極５と塩化銀電極との間で定電流電解
を行う。この実施例では、定電流値５０μＡで、０．５
クーロンの通電により行っている。

このようにして形成された第１のポリチアミン膜７−１
に、ＦＣＡを固定する。この固定化は、５ｍのエタノー
ル（Ｃ，Ｈ５ＯＨ）に、０．１モルのＦＣＡと０．２ａ
ｆｆｉの塩酸（３５％液）を加えた液に、第１のポリチ
アミン膜１−ｒの形成された下地電極５を一昼夜浸漬し
て行われる。

次に、第２のポリチアミン膜７−２を、電解重合により
第１のポリチアミンＩＩ！２Ｌ、上に形成する。

この第２のポリチアミン膜７−ｔの形成方法は、先に述
べた第１のポリチアミン膜７−＋の場合と全く同様であ
る。

こうして形成された二重のポリチアミン膜７に、ＣＯＤ
が固定化される。ＣＯＤの固定化は、１ｄあたり５０ユ
ニツトのＣＯＤと６６ｒＵｌのカルボジイミドを含むｐ
　Ｈ４，５の１％塩化ナトリウム溶液５ｄ中に、上記下
地電極５を浸漬し、３時間反応させることにより行われ
る。

第２図は、この実施例酵素電極ｌの使用例を説明する図
である。１０は、恒温槽であり、その内部には、０．Ｉ
Ｍ、ｐＨ７，０のリン酸緩衝液１１が貯溜され、一定温
度に保持される。また、恒温槽１０内部には、回転子１
２が置かれ、恒温槽１０下方に設けられるスターク１３
により、この回転子１２が回転駆動され、リン酸緩衝液
１１が撹拌される。

前記作用電極２は、対照電極８と共にリン酸緩衝液に浸
漬される。この実施例では、対照電極８として飽和カロ
メル電極（ＳＣＥ）を使用しているが、対照電極はこれ
に限定されるものではなく、適宜変更可能である。作用
電極２及び対照電極８のそれぞれのり−１”　６．９は
、電位計１４に接続される。また、電位計１４は、レコ
ーダ１５に接続され電位差（電極出力）が記録される。

前記リン酸緩衝液中には、グルコース（Ｇｆ！ｃ）を含
む被測定検体が、マイクロピペットにより所定量に計量
されて注入される。この時、前記ポリチラミン膜７内で
は、ＣＯＤにより、次式（１）で示される反応が生じる
。

さらに、（１）式の反応の生成物Ｈ、Ｏ，によりＦＣＡ
（Ｃｐ、Ｆｅ）の酸化反応が生じる。

Ｈ，Ｏ，＋２Ｃｐ、Ｆｅ＋２Ｈ”−＋２Ｃｐ、Ｆｅ”　
＋２Ｈ！０−（２）この酸化型ＣｐｚＦｅ　”濃度と、
還元型ＣｐｚＦａの濃度差に対応して酸化還元電位が生
じ、作用電極２と対照電極８との間に電位差が生じる。

この生じる電位差を計測することにより、被測定検体の
グルコース濃度を知ることができる。第３図は、異なる
グルコース濃度に対する電位差の経時変化を示している
。

第４図は、測定開始時より所定時間（約１分間）経過後
の電極電位の変化よりグルコース濃度を求める検量線を
実線で示している。図中白丸（０）は、作用電極２作成
光日の電極出力を、黒丸（・）は、作用電極２作成後１
０日を経過した時の電極出力をそれぞれ示しており、電
極劣化がほとんどないことが確認できる。

第４図には、また破線で従来の酵素電極の出力が比較例
■として示されている。この比較例■は、下地電極５上
に、第１のポリチラミン膜７−１を形成し、このポリチ
ラミンｎ’１１−．に、ＦＣＡとＧＯＤとを固定化し、
第２のポリチラミン膜７−２を形成しない点を除いては
、実施例酵素電極１と同様である。実施例（実線）と比
較例（破線）を比べてみれば、実施例の電極出力の大き
さ及び測定可能な濃度範囲の広さが確認できる。

なお、測定終了後の作用電極１は、以下の２つの手段の
内、いずれかの手段により再生される。

第１の手段は、作用電極２と対照電極８間に電圧を印加
しく０．６Ｖ）、酸化型ＣｐｔＦｅ”を、還元型Ｃｐｚ
Ｆｅに電気的に還元する。第２の手段は、作用電極２を
フェリシアン化カリ等の還元剤溶液中に浸漬し、酸化型
ＣｐｌＦｅ”を還元型ＣｐｚＦｅに化学的に還元する。

また、この実施例では、ポリチラミン膜７−１．７−２
を電解重合により下地電極５上に形成しているが、別途
作成された高分子膜を下地電極に装着するようにしても
よく、適宜設計変更可能である。

〈実施例２〉この発明の第２の実施例を第５図及び第６図を参照しな
がら説明する。

この実施例酵素電極は、尿酸濃度測定を目的とするもの
で、酵素としてウリカーゼを使用する。

この第２の実施例作用電極（図示せず）は、第１の実施
例の作用電極２とは、固定している酵素が異なるだけで
、その他は全く同じである。

ウリカーゼを固定化するには、ウリカーゼ２５ユニツト
／ｄと１％のグルグルアルデヒドを含む炭酸塩緩衝液（
ｐＨ９，５）に、第２のボリチアミン膜の形成された下
地電極を浸漬して２４時間反応させる。

使用方法は、第１の実施例と同様であるが、ウリカーゼ
の反応は次式（３）のようになる。

・・・（３）Ｈ，Ｏ□とＦＣＡとの反応、及び作用電極の再生等は第
１の実施例の場合と同様である。

第５図は、異なる尿酸濃度に対する電位差の経時変化を
示す図である。また、第６図は、測定開始時より所定時
間経過後の電位差より、尿酸濃度を求める検量線を示し
ている。第６図中実線がこの実施例の検１線で、破線が
比較例（従来例）■の検Ｎ線である。

この比較例■は、下地電極上に一層のポリチアミン膜を
形成し、この１つのポリチアミン膜にＦＣＡとウリカー
ゼとを固定化したもので、他はこの実施例と同様のもの
である。第６図より、実施例の電極出力は従来よりも大
きく、その測定可能な濃度範囲が拡がっていることが確
認できる。

なお、上記第１及び第２の実施例には、それぞれ酵素と
してＣＯＤ、ウリカーゼを使用しているが、他の酵素を
使用し、この酵素の基質たる生化学物質の濃度を測定す
ることが可能である。また、酸化還元物質はＦＣＡに限
定されるものではなく適宜変更可能である。

（ト）発明の詳細な説明したように、この発明の酵素電極は、高分子膜が
第１の高分子膜と第２の高分子膜とよりなり、この第１
の高分子膜は前記下地電極上に直接装着されて、酸化還
元物質が固定化され、前記第２の高分子膜はこの第１の
高分子膜上に重ねて装着されて、これら第１の高分子膜
及び第２の高分子膜に酵素が固定化されることを特徴と
するものである。従って、多量の酸化還元物質及び酵素
を固定化でき、電極出力と応答速度の増大、測定感度の
向上及び測定可能な濃度範囲の拡張を図れる利点を有し
ている。また、高分子膜の機械的強度が向上して、電極
出力のノイズ及びドリフトを減少し、測定精度を向上さ
せると共に、酵素及び酸化還元物質の流出を防止し、使
用耐久性・保存性を向上できる利点を有している。さら
に、酵素電極の微小化を図れる利点も有している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の一実施例に係る酵素電極の作用電
極の中央縦断面図、第２図は、同酵素電極の使用例を説
明する図、第３図は、同酵素電極の種々のグルコース濃
度について電極出力の経時変化を示す図、第４図は、同
酵素電極のグルコース検量線を従来と比較して示す図、
第５図は、この発明の第２の実施例に係る酵素電極の種
々の尿酸濃度について電極出力の経時変化を示す図、第
６図は、同酵素電極の尿酸検量線を従来と比較して示す
図である。２：作用電極、　　　　　５：下地？Ｓ極、７−１：第
１のポリチアミン膜、７４：第２のポリチアミン膜、８：対照電極。第１図特許出願人　　　　　立石電機株式会社代理人　　弁理
士　　中　村　茂　信７−２：　第２のポ°リチアミン月臭第図電位基（ｍＶ）第図第図７−ルフース）Ｘノχ（ｍＭ）電位莞（ｍＶ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）作用電極と対照電極とよりなり、少なくともこの
作用電極の下地電極上には高分子膜を装着し、この高分
子膜には酵素とこの酵素の反応に伴い酸化又は還元され
る酸化還元物質とを固定化してなる酵素電極において、前記高分子膜は、第１の高分子膜と第２の高分子膜とよ
りなり、この第１の高分子膜は前記下地電極上に直接装
着されて、前記酸化還元物質が固定化され、前記第２の
高分子膜はこの第１の高分子膜上に重ねて装着されて、
これら第１の高分子膜及び第２の高分子膜に前記酵素が
固定化されることを特徴とする酵素電極。