JPS63159748A - 分析物質を測定するための酵素−電極型センサ、このセンサの製法および試料中の分析物質を測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野； 本発明は酵素電極型のセンサ、使用するためセンサを準
備する段階およびセンサを使用する分析法に関する。

従来の技術： 酵素電極はとくに血液および他の生理液試料中のグルコ
ースおよび尿素のような材料を測定するため、医学およ
び他の研究所で次第に多く使用されている。このような
電極は多くの刊行物と（Ｋクラークおよびリオンズの論
文（Ｃ１−ａｒｋ　ａｎｄ　Ｌｙｏｎｓ　）　（Ａｎｎ
ａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋＡｃａｄｅｍ
ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　、　１０２　、２９〜４５
．１９６２）およびクラークおよびニューマン（Ｎｅｗ
ｍａｎ　）の米国特許第３５３９４５５号および第３９
７９２７４号明細書にそれぞれ記載されている。

酵素電極は一般に自体電気化学的忙活性でないけれど、
適当な酵素存在のもとに反応に加わり、電極によって容
易に検出しうる種を発生する材料を測定するために使用
される。酵素電極中で酵素は多くは下にある電極に密接
するポリマー材料の中に配置される。ごく最近提案され
た酵素電極は同時係属出願ヨーロッパ特許出願第８６３
０３　Ｑ　Ｏ７，９ならびに英国特許出願第８５２２８
３４号および第８５２９３００号に含まれる。

グルコースの測定は酵素電極による材料の測定例として
取上げることができる。酵素グルコースオキシダーゼの
存在で次の反応が起こる：この反応で発生した過酸化水
素は米国特許第３９７９２７４号に記載のような薄膜の
第１層を通過し、電極を使用して測定することができる
。発生する過酸化水素は試料中に存在するグルコースに
依存するので、適当に較正したセンサを使用してグルコ
ース濃度を決定することができる。

グルコースのような血液代謝産物の連続的生体内監視は
臨床医に患者の状態の直接的データを与え、それゆえ一
層有効な処置をとることができる。グルコースの連続的
生体内監視が長期にわたって可能であれば、糖尿病患者
のための携帯用閉鎖ループインシュリン供給系の構成が
可能となる。このような系のすべての成分は生体内使用
のための長期酵素−電極センサを除いて製造されている
。現在報告されているこの型式のもつとも有効な系はＭ
、５ｈｉｃｈｉｒｉ等（Ｌａｎ−ｃｅｔ　、１９８２，
２　（８３０８）、１１２９〜３１：Ｃｈｅｍ　、Ａｂ
ｓ、、１９８４．１００．１４４９５７ｇおよびＣｈｅ
ｍ、Ａｂｓ、、１９８５．１０２．２００４９５６参照
）によって開発されたものであり、膵切除した犬の３日
間にわたる生体内組織監視の成功およびヒトのボランテ
イヤの前腕組織グルコース〇一層短期間の監視の成功が
報告されている。

発明が解決しようとする問題点 生体内センサのメーカは次の性能の組合せを有する装置
を目的とすべき結論が得られた：１、長期安定性； ２　臨床的に重要な範囲すなわち０〜４０　ｍＭにわた
る基質への再現可能（とくに直線的）な応答； ３、選択性すなわち他の化学種により妨害されないとと
； 屯　試料中の酸素圧力（グルコースオキシダーゼの補基
質）の変化に対して電極性能が影響されないこと； ５、　とくに２分より早い応答時間； ５、障害、血栓形成および組織壊死を最小にする生物融
和性； ７、小サイズ； ８６　　攪拌および試料粘度変化に対する非依存性；９
、怒牢性； １０、殺菌可能性。

付加的に電極応答はと（Ｋ厳しい生物学的環境にさらさ
れる際はとんど影響されずに留まらなければならない。

問題点を解決するための手段： 本発明によれば酵素存在のもとにセンサによって検出し
うる種へ変換される分析物質を測定するための酵素−電
極型のセンサが得られ、このセンサは液体および溶質に
対し透過性の薄膜によって蔽われた電極を有し、この電
極は分析物質を含む試料と接触させることができ、薄膜
は１つまたは多数の酵素を含む層および酵素を含む層と
試料の間に配置した材料の最外層からなり、最外層をタ
ン白質変性試薬で処理したことを特徴としている。

さらに本発明によれば酵素存在のもとにセンサによって
検出しうる糧へ変換される分析物質を測定するための酵
素−電極型のセンサの製法が得られ、このセンサは液体
および溶質に対し透過性の薄膜によって蔽われ、かつ１
つまたは多数の酵素を含む層および酵素を含む層と分析
物質を含む試料の間に配置した材料の最外層を有する電
極を有し、この方法は最外層なタン白質変性試薬で処理
することを特徴としている。

さらに本発明によれば酵素−電極型センサの電極と試料
を接触させ、センサの種に対する応答を測定することか
らなる試料中の分析物質を測定する方法が得られ、その
際この電極は液体および溶質に対し透過性の薄膜によっ
て蔽われ、かつ分析物質をセンサによって検出しうる種
へ変換しうる１つまたは多数の酵素からなる層、および
酵素を含む層と試料の間に配置される材料の最外層を有
し、この方法は最外層をタン白質変性試薬で処理するこ
とを特徴としている。

作用： 電極は任意の形を有してよく、たとえば試料の滴によっ
て接触される形式のものである。しかしとくに薄膜によ
って蔽われた先端（選択的にテーバを有する）を有する
ロッド形である。

本発明の分析法によればこのような電極の薄膜に蔽われ
た先端は試料中へ挿入される。この明細書の以下の記載
にわたって本発明のセンサはロッド形または１針〃電極
の語で記載される。

本発明のセンサの薄膜はそのもつとも簡単な形式では酵
素含有層および材料のもう１つの層と（にヨーロッパ特
許出願筒８６３０７０１１゜６号に記載のような制限し
た透過性の層からなる。この層はこの簡単な形式の薄膜
では外側層であり、分析物質を測定するための本発明の
方法では試料によって直接接触される。

しかし薄膜が米国特許第３９７９２７４号明細書に例と
して開示される形式の積層薄膜であるのは有利である。

このような薄膜は酵素含有層と電極の間に配置した材料
の第１または内側層、酵素含有層および酵素含有層の外
側の材料の第２層からなり、この第２層は有利に制限さ
れた透過性を有する層である。

以下この明細書に記載する本発明のセンサは第１層およ
びとくに制限した透過性を有する多孔性材料からなる第
２層を有する積層薄膜を含む。

本発明のセンサの薄膜は酵素含有層に対し付加的に２つ
より多い材料層を含み５ることか明らかである。たとえ
ば第２層は薄膜の最外層である必要はない。すなわち第
２層または制限された透過性の層と試料の間に第３、第
４層などの材料の他の層があってもよい。しかし多くは
第２層が外側層であり、その外側表面が試料によって接
触される。

一般に第２層に使用される材料はポリマー材料であるけ
れど、他の適当な材料を使用することもできる。このよ
うに第２層はレーザによってカットした孔を有するガラ
スまたは金属から形成することができる。

材料の第２層を２％より多くない有効多孔度を有する材
料から形成するのが適当である。非常に低い有効多孔度
はたとえば０．００１％または０．００５％〜０．５％
の範囲が有利である。

本発明のセンサでは薄膜の第２層は拡散障壁として作用
し、かつ高分子量化合物通過を阻止または制限する。第
２層のだめの適当な多孔性材料は多孔性ポリカーボネー
ト、ポリウレタン、変性セルロースとくに硝酸セルロー
ス、酢酸セルロースおよび再生セルロースを含む。有利
に第２層はポリウレタンから形成される。ポリウレタン
は酵素層の上に第２層を形成するためポリマー前躯体と
してまたは前ポリマーとして被覆することができる。

本発明のセンサは分離可能の薄膜を有し、または付着性
薄膜を有する使い棄てセンサである。

センサのための適当な電極の形成に使用される材料は不
活性金属および（または）炭素を含む。

センサを米国特許第３９７９２７４号に開示される形式
の積層薄膜で形成する場合、酵素層と電極の間に配置さ
れるｉｌ１層はポリメチルメタクリラート、ポリウレタ
ン、酢酸セルロース、またはアスコルビン酸およびチロ
シンのような電気活性妨害化合物の通過を制限または阻
止する他の透過性材料から適当に形成される。第１層を
スルホン化したまたはしていないボリアリールケトンま
たはとくに英国特許出願第８５２９３００号に記載のよ
５なスルホン化したまたはしていないボリアリールスル
ホンから形成するのがと（に有利である。第１層にスル
ホン化したボリアリールスルホンを使用することはセン
サがロッド形電極を有する場合とくに有利である。ロッ
ド形電極の場合経験によればロンド端部上に個々の３層
を得ることは少し困難であり、しばしば第１層と酵素層
が組合わされた、第１層にスルホン化したボリアリール
スルホンを使用することによりロッド先端を３層で被覆
する困難が減少する。ロッド先端を薄膜の成分層で被覆
する際、第１層と第２層は異なる溶剤に可溶の材料から
適当に形成されることが指摘される。第１層が０．２〜
１．０ミクロンの範囲の厚さをゼするのが適当である。

本発明のセンサに存在する酵素は任意の適当な手段で薄
膜に配置することができる。とくに積層薄膜では酵素は
第１層と多孔性材料の第２層の間に存在し、酵素含有層
が２つの層の間の結合を形成する。この状態のもとに、
かつ一般的に酵素は交差結合を発生させる材料と混合す
ることによって有利に不動にされる。この目的に非常に
適する材料はグルタルアルデヒドであり、アルブミンの
よ５なタン白質および他の材料も有利に含まれる。セン
サから迅速で安定な読取の達成を容易にするため、酵素
含有層は薄く、すなわち６ミクロンより厚くないのが有
利である。

本発明のセンサに使用される酵素は濃度を測定すべき分
析物質に依存する。分析物質がグルコースであれば酵素
はたとえばグルコースオキシダーゼである。存在しうる
他の酵素は尿酸および乳酸を測定するためそれぞれ尿酸
オキシダーゼおよび乳酸オキシダーゼを含む。２つ以上
の酵素からなる酵素系も存在可能である。

薄膜最外層（通常第２層）を処理するため使用するタン
白質変性状系は任意の適当な試薬である。無機酸および
塩基は塩酸、水酸化ナトリウムおよびカリウムが有利で
あり、とくに０．０１〜０．５Ｍの範囲の濃度がとくに
適当である。有利な処理条件は酵素およびそれが配置さ
れるタン白質マトリツケスに依存する。ロッド形電極の
場合処理を実施する簡単な方法として先端を試薬へ数秒
間浸漬する。

発明の効果： 本発明の方法を使用すればセンサ応答に対する濃度のグ
ラフが直線である濃度範囲が増大する利点が得られる。

常用法によれば直線性は一般にグルコースに対してはほ
ぼ３ｍｍ０Ｉ／ｌの濃度まで拡がるに過ぎない。本発明
の方法を使用すれば直線性は上昇し、その範囲は５０　
ｍｍｏｌ／を以上のグルコース濃度まで拡がる。このよ
うに範囲は血液試料中に予測しうるグルコース濃度をカ
バーシ、シたがって血液グルコースレベルなさらに容易
に測定することができる。これは多数の測定を規則的に
最小の試料調製（すなわち稀釈）で実施しなければなら
ない状態では著しい利点である。

ロッド形電極を有する本発明のセンサの潜在用途は次の
とおりである： （１）医療用： 代謝産物のマルチプル生体内分析。人工膵臓製閉鎖ルー
プ系。生体内の強力な着膜監視（たとえば糖尿病性昏睡
患者または血液グルコースが急速にゼロに低下し、致命
的結果を伴う幼児の遺伝的障害）。体外で使用するため
の針電極（あらかじめ殺菌した）と１体化した簡単なフ
ローセル系。日中の砂糖などを監視するための歯科用調
査工具。

（２）獣医用： （主として（１）と同じ）。普通の代謝産物レベルの変
化を伴う動物のホルモンレベルの可能な監視。

（３）食品用： 食品生産ライン（たとえばジャム、飲料等）の監視。ア
ルコール飲料製造（ビール、ワイン等）。肉、野菜、果
物等の食品品質探針。

細菌監視。

（４）農業用： 作物成熟度、品質等（（３）と同じ）。生牧草製造。ミ
ルク製造。

（５）　　醗酵： （（３）と同じ）。単細胞によるタン白質製造のための
食料の連続的監視。

（６）公害用： 流出物、汚水等のための河水の監視。

実施例： 次に本発明を実施例の図面により説明する。

第１Ａおよび１８図には例に記載のように製造および試
験したロッド形電極の２つの形式が示される。第１Ａ図
の電極は０．５　ｔｔｘｎ電極であり、第１Ｂ図の電極
は０．２５−電極である、第１Ｃ図は電極先端を被覆す
るため使用した薄膜を示す。

電極は参照および対向電極として作用するステンレス鋼
管１から形成され、この中へ白金線２が埋込まれる。存
在する絶縁材料は第１Ａ図ではガラススリーブ３および
エポキシ樹脂４からなり、第１Ｂ図ではテフロン（登録
商標）スリーブ５およびエポキシド樹脂６からなる。電
気的接続は電極の端部へはんだ付けされ、電極先端７は
エメリーペーパを使用して研磨される。

研磨した先端は次に第１Ｃ図に示す薄膜層で被覆される
。これはスルホン化したボリアリールエーテルスルホン
（ＰＥＳ　）の１１層８、！ルコースオキシダーゼから
なる層９およびポリウレタンの第２層１０である。完全
な薄膜を塩酸中に浸漬処理した。

ポリウレタン層は酵素層の上に１回または多数回の浸漬
被覆によって設け、溶剤は空気中に蒸発させることがで
きる。使用したポリウレタンは前駆体型（溶剤に不溶の
層を発生しながらその場で重合する）ＳＣ７７１，５Ｃ
７６２，）リクサｙ　（Ｔｒｉｘａｎｅ　）　Ｈ３５（
Ｂａｘｅｎｄｅｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　。

Ｇｏ、Ｌｔｄ、　）または溶解したポリウレタンゴムエ
；ｕｐ　ン（Ｅｓｔａｎｅ　）　５７０１ＦＩ　、５７
０７ＦＩ　。

５７１１１Ｆ　Ｉ　（Ｂ、Ｆ、Ｇｏｏｄｎｉｃｈ　Ｃｏ
ｙへ＋キー　）　テアった。すべての場合に直線性を拡
大することができる。前駆体製およびゴムポリマー被覆
（厚さ０．２〜１μｍの個々のプリキャストシートとし
て適用できる。）は両方とも同じような直線性を与える
けれど、ニスタンの応答性が遅いことが明らかである。

ポリウレタンはグルコースの酵素層への拡散を減少する
ことによって電極の直線性範囲を拡大する。使用するす
べてのポリウレタンは、完全な層がグルコースに対し不
透過性なので、マイクロ多孔性拡散制限障壁として作用
するものと考えられる。電極はさらに直線性を拡大する
ため酸処理される。これは電極先端を０．１ＭＨａＫ５
〜５０秒間浸漬し、次に洗浄し、安定なベースラインが
達成されるまで攪拌した緩衝液に再浸漬することによっ
て達成される。下層の薄膜なしに直線性を酸処理によっ
て７から７０ｍＭへ拡大できるけれど、数時間後この電
極の直線性は約３５　ｍＭで安定化する。

例： 電極な吟張リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）中で性格付げ
した。電極性能は薄膜構造および使用する前処理に高度
に依存し、それゆえ目的の用途に応じて設定することが
できる。グルコースに対する電極の直線範囲は下にある
薄膜なしに、攪拌溶液中２０〜６０秒の応答時間で第２
図に示すように拡大することができる。ＰＥＳ下層の組
込により直線性は＞　３０　ｍＭへ拡大された。

攪拌しない溶液中の応答時間は５〜２４０秒（代表的に
は３０秒）にわたる。稀釈および攪拌しない全血中の応
答時間は代表的には１９５％１０〜９０秒である。第３
図はグルコース添加に対する応答曲線を示す：電極に対
し３０ｍＭまで直線（１９５％１５秒２分解能＋１−０
．２ｍＭ）電流レベルは４０ｍＭで〉養時間不変化に留
まった（この場合下層薄膜なし）、、下層のＰＥＳ薄膜
がある場合、電極は他の生物学的８１ｉ（ブスコルビン
酸、グルタチオン、尿酸等）による妨害を無視すること
ができた。電極は攪拌効果にはとんと依存しなかった。

稀釈および攪拌しない全血中で常用の分光光度検定との
相関は良好であった。ｙ＝１．ｏ０６ｘ＋０、ＯＱ６　
、　ｒ−０，９９５、ｎ＝２６　（第養図参照）。しか
しこの電極の応答時間は、緩衝液中の３０秒から血液中
で６０〜９０秒に増大した。稀釈した攪拌血液（１を３
の等張緩衝液μ４７，４中へ）中でｙ＝０．９７１ｘ＋
０．０２４．ｒ−０，９８７，ｎ＝２８の相関が得られ
た。稀釈および未稀釈全血中では両方とも標準液に対す
る応答が最初の血液浸漬の後１〜４％減少したけれど、
その後標準応答は不変化に留まった。未稀釈全血で間欠
的測定が１゜日間にわたって行われたけれど、電極特性
に有意の変化はなかった（乾燥状態で１夜貯蔵）。

稀釈血液中で電極性能は８週にわたる２００血液測定後
劣化が認められなかった（室温で１夜等張緩衝液中に貯
蔵）。

【図面の簡単な説明】

第１（Ａ）図および第１（Ｂ）図は２つのロッド形電極
の縦断面図、第１　（ｃ）図は電極先端の縦断面図、第
２図は電極電流とグルコース濃度の関係を示す図（攪拌
した緩衝液）、第３図は直線性を拡大したセンサのグル
コース添加に対する電極電流と時間の関係を示す図、第
４図は全血の常用分光光度検定との相関を示す図（ｙ＝
１．ｏ０６ｘ＋０．０９６．ｒ＝０．９９６．ｎ＝２６
）である。 １・・・ステンレス鋼管、２・・・白金線、３・・・ガ
ラススリーブ、養、６・・・エポキシ樹脂、５・・・テ
フロン、７・・・電極先端、８・・・第１層ＣＰＥＳλ
９・・・グルコースオキシダーゼ層、１０・・・第２層
（ポリウレタン） グルコース／ｍＭ Ｒり・３・ １０　　２０　　３０　　４０　　５０　　６０　　７
０　　８０　　９０　１０θ時間／分

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分析物質が酵素の存在によりセンサで検出しうる種
   へ変換可能であり、センサが液体および溶質に対し透過
   性の薄膜によつて蔽われた電極からなり、この電極は分
   析物質を含む試料と接触させることができ、前記薄膜が
   １つまたは多数の酵素を含む層および酵素を含む層と試
   料の間に配置した材料の最外層からなる、分析物質を測
   定するための酵素−電極型センサにおいて、最外層をタ
   ン白質変性試薬で処理したことを特徴とする分析物質を
   測定するための酵素−電極型センサ。 ２、薄膜が酵素を含む層と電極の間に配置した材料の第
   １または内側層、および酵素を含む層の他の側の材料の
   第２層からなる特許請求の範囲第１項記載のセンサ。 ３、最外層または第２層が５％以下の有効多孔度を有す
   る制限された透過性の多孔性材料からなる特許請求の範
   囲第１項または第２項記載のセンサ。 ４、最外層または第２層が２％以下の有効多孔度を有す
   る特許請求の範囲第３項記載のセンサ。 ５、最外層または第２層が０．００１〜０．５％の範囲
   の有効多孔度を有する特許請求の範囲第４項記載のセン
   サ。 ６、最外層または第２層が０．００５〜０．５％の範囲
   の有効多孔度を有する特許請求の範囲第５項記載のセン
   サ。 ７、最外層または第２層がポリウレタンからなる特許請
   求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項に記載の
   センサ。 ８、酵素を含む層の厚さが５ミクロン以下である特許請
   求の範囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載の
   センサ。 ９、センサが液体および溶質に対し透過性の薄膜によつ
   て蔽われ、かつ１つまたは多数の酵素を含む層および酵
   素を含む層と分析物質を含む試料との間に配置した材料
   の最外層を有する電極からなる、酵素の存在によりセン
   サによつて検出しうる種へ変換しうる分析物質を測定す
   るための酵素−電極型センサの製法において、最外層を
   タン白質変性試薬で処理することを特徴とする分析物質
   を測定するための酵素−電極型センサの製法。 １０、試料を酵素−電極型センサの電極と接触させ、セ
   ンサの種に対する応答を測定し、その際この電極が液体
   および溶質に対し透過性の薄膜によつて蔽われ、かつ分
   析物質をセンサによつて検出しうる種へ変換しうる１つ
   または多数の酵素を含む層および酵素を含む層と試料の
   間に配置した材料の最外層からなる、試料中の分析物質
   を測定する方法において、最外層をタン白質変性試薬で
   処理したことを特徴とする試料中の分析物質を測定する
   方法。