CN111443149B - 测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法。所述方法包括下述步骤：供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。本发明使用透明质酸酶对供试品进行前处理，并结合液相色谱分离技术测得供试品中盐酸赖氨酸含量，方法准确度高，检测限低。按照本发明的方法，能够避免交联透明质酸钠对盐酸赖氨酸含量测定的干扰，提高检测准确度，降低检测限。同时又能够减少交联透明质酸钠复合溶液对色谱柱的损耗，延长色谱柱使用寿命。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸检测的技术领域，尤其涉及一种酶解法联合HPLC法测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronicacid，HA)是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，一般为其钠盐，即透明质酸钠(Sodium hyaluronate,SH)，习惯上仍称为透明质酸。分子式为(C14H21NO11)n，它由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接而成，其聚合物在体内的分子量大小范围从5000至2000万道尔顿不等，被认为是一种填充空间、稳定结构、涂层细胞和保护细胞的多糖。
透明质酸被广泛使用在修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹。透明质酸具有良好的理化性能及生物相容性。然而，它在体内受到透明质酸酶的酶解作用而迅速降解，存留时间较短，需要重复注射才能达到疗效。交联透明质酸是透明质酸经交联剂交联修饰得到的具有三维立体结构的高分子凝胶，可以弥补透明质酸钠存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果。注射用透明质酸钠复合溶液并不是单纯的交联透明质酸钠，还含有盐酸赖氨酸，其可以辅助成纤维细胞合成胶原蛋白。
目前常用的氨基酸检测方法有电位滴定法、茚三酮显色法以及衍生化高效液相色谱法。例如中国专利申请号CN201910490795.1中公开了一种测定黄精红曲中游离氨基酸含量的方法，其使用的异硫氰酸苯酯为衍生化试剂，高效液相色谱法测定氨基酸含量，但是其衍生化步骤比较复杂，需要萃取处理，操作粗犷，影响含量测定结果。
发明内容
本发明人开发的方法中，利用邻苯二甲醛为衍生试剂，可使供试品在水溶液中与衍生化试剂直接反应，优化操作步骤，提高测定准确度。但是在衍生后检测盐酸赖氨酸含量时发现，注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的含量测定结果与投料量偏差较大，重复性差，怀疑注射用透明质酸复合溶液中交联透明质酸钠的复杂结构影响盐酸赖氨酸含量的检测；而且由于注射用透明质酸钠复合溶液的黏性容易堵塞色谱柱，柱效降低，影响检测结果，同时缩短柱子使用寿命。
为了解决上述问题，本发明人对之前开发的方法、特别是供试品的前处理进行了优化，从而确定了酶解法联合使用高效液相色谱法测定注射用透明质酸复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，将注射用透明质酸钠复合溶液中交联透明质酸钠特异性酶解后，进行盐酸赖氨酸的衍生化反应，能够大大提高注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的准确度，检测限低至10-4ppm，同时延长色谱柱的使用寿命，维持色谱柱柱效。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包含下述步骤：
供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；
标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；
检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述透明质酸酶为细菌酶，优选的，在35-45℃酶解，进一步优选为42℃；优选的，酶解3-3.5h，进一步优选为2-3h；优选的，酶解pH为6.0-6.5。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在线衍生技术包括下述步骤：将所述供试品溶液与衍生化试剂在缓冲溶液存在下混合，优选的，所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述衍生化试剂为邻苯二甲醛。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在检测步骤中，使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，优选为Poroshell HPH-C18色谱柱或者ZORBA Eclipse-AAA色谱柱。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在检测步骤中，流动相采用体积比为90:10-98:2的弱碱溶液:甲醇，优选为97:3-98:2，进一步优选为98:2。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述弱碱溶液为pH8.0-8.8的溶液，优选为8.2-8.4，进一步优选为8.2。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述弱碱溶液为磷酸硼酸盐溶液，优选浓度为8-12mmol/L的磷酸硼酸盐溶液，进一步优选为8mmol/L的磷酸硼酸盐溶液。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：流速为1.0-1.5ml/min，进一步优选为1.2-1.5ml/min，最优选为1.5ml/min；
优选的，检测波长为220-250nm，优选为224-235nm，进一步优选为224nm；
优选的，进样量为0.5-1.5μL，优选0.8-1μL，进一步优选为1μL；
优选的，柱温为30-45℃，优选为40℃。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的检测限大于等于10-4ppm。
发明的效果
本发明使用透明质酸酶对供试品进行前处理，并结合液相色谱分离技术测得供试品中盐酸赖氨酸含量，方法准确度高，检测限低。按照本发明的方法，能够避免交联透明质酸钠对盐酸赖氨酸含量测定的干扰，提高检测准确度，降低检测限。同时又能够减少交联透明质酸钠复合溶液对色谱柱的损耗，延长色谱柱使用寿命。
附图说明
图1是实施例1-1中对照品色谱图。
图2是实施例1-1中空白溶液的色谱图。
图3是实施例1-1中供试品的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图所描述的实施方式对本发明做以详细说明，其中所有附图中相同的数字表示相同的特征。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
所述“酶解法”是利用活性酶来水解特定的某种物质，这种方法可用于一般的生物实验中，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。
所述“外标法”是指添加一定量的标准品于空白检材中制成对照样品，与未知检材平行地进行样品处理并检测，根据对照样品响应值与其中所添加标准品浓度的函数关系推算未知检材中被测组分浓度的定量方法。本发明中采用的外标法没有限定，可以采用标准曲线法。
注射用透明质酸钠复合溶液中加入的盐酸赖氨酸可以为合成胶原蛋白提供所需要的各类营养物质，刺激胶原蛋白的再生，进而保持皮肤弹性，使肤色水润有光泽。
本发明提供了一种酶解法联合高效液相色谱法测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包括下述步骤：
供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；
标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；
检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。
其中，供试品溶液制备是利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠溶液中交联透明质酸钠进行酶解，酶解后样品经纯化水稀释得到供试品溶液。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述透明质酸酶为细菌酶，优选的，在35-45℃酶解，进一步优选的，酶解3-3.5h，进一步优选的，酶解pH为6.0-6.5。
所述透明质酸酶是一种蛋白水解酶，能特异性地水解透明质酸。按来源不同，透明质酸酶分布在各种脊椎动物(如睾丸、动物毒液等)和无脊椎动物(如昆虫、水蛭、十二指肠虫等)中，还可以存在于微生物中(如链霉菌属、葡萄球菌属、梭菌属等)。
所述细菌酶是一种碱性糖蛋白，属于内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，作用于β-1,4糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双键。
本发明使用透明质酸为细菌酶而非常见的动物睾丸提取的动物酶是因为动物酶中含有约0.0004mg/ml的盐酸赖氨酸以及少量其他种类氨基酸，影响盐酸赖氨酸含量测定，同时动物酶只能将交联透明质酸酶解为四糖和六糖的混合物，不能达到彻底降解效果。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，其中，供试品溶液制备的步骤为：将供试品用酶解缓冲液进行稀释，加入透明质酸酶，优选为细菌酶，在35-45℃温度下，以及在pH为6.0-6.5下，酶解3-3.5h，优选为2-3h，进一步优选为2.5h。
酶解缓冲液的制备方法为：配置5mM/L的磷酸二氢钠与磷酸氢二钠缓冲液，调pH值为6.0-6.5，得酶解缓冲液。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在检测步骤中，在线衍生包括下述步骤：将所述供试品溶液与衍生化试剂在缓冲溶液存在下混合，优选的，所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液，进一步优选的，所述硼酸盐缓冲溶液选自浓度为0.4mol/L、pH值为10.2的硼酸盐缓冲液。
所述衍生技术指的是利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质的技术，作用在于把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(通称化学衍生试剂或标记试剂)与样品组分进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测或者分离。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在检测步骤中，所述衍生化试剂为邻苯二甲醛。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，其中，在线衍生的步骤为：吸取硼酸盐缓冲液3.5mL，吸取酶解后待测样品溶液1.0mL，混合，等待3min，加入邻苯二甲醛试剂0.6mL，混合。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在检测步骤中，使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，优选为Poroshell HPH-C18色谱柱或者ZORBA Eclipse-AAA色谱柱。
所述Poroshell HPH-C18色谱柱的尺寸为4.6×100mm，柱长为2.7μm，一般情况，柱子的填料粒径越小，这根柱子的柱效越好，但是也伴随着柱压增高，柱子的使用寿命会减短。但是，Poroshell HPH-C18色谱柱采用表面多孔层填料，能够获得与亚2微米填料相当的柱效，柱压却只有其50％左右，能够延长柱子使用寿命。在碱性条件下有很好的稳定性，硅胶基质色谱柱的耐受能力较强，可保证对盐酸赖氨酸分析结果的重复性
所述ZORBA Eclipse-AAA色谱柱的尺寸为3.0×150mm，柱长为3.5μm，灵敏度高，分辨率高，此款色谱柱酸碱耐受范围较宽，但是具体流动相酸碱范围需要根据被测物质酸碱耐受性来选择，价格合适的同时对盐酸赖氨酸检测准确度高。
在本发明优选的一种具体实施方式中，在检测步骤中，流动相采用体积比为90:10-98:2的弱碱溶液:甲醇，优选为98:2；
优选的，所述弱碱溶液为pH 8.0-8.8的溶液优选为8.2-8.4，进一步优选为8.2；优选的，所述弱碱溶液为磷酸硼酸盐溶液，优选为浓度为8-12mmol/L的磷酸硼酸盐溶液，进一步优选为8mmol/L的磷酸硼酸盐溶液。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：流速为1.0-1.5ml/min，进一步优选为1.2-1.5ml/min，最优选为1.5ml/min；
优选的，检测波长为220-250nm，优选为224-235nm，进一步优选为224nm；
优选的，进样量为0.5-1.5μL，优选0.8-1μL，进一步优选为1μL；
优选的，柱温为30-45℃，优选为40℃。
使用上述色谱条件能够更加准确地测定盐酸赖氨酸含量，重复性好，准确度高。
本发明的检测方法使用透明质酸酶将注射用透明质酸钠复合溶液中交联透明质酸钠特异性酶解，减少交联透明质酸钠对盐酸赖氨酸检测的干扰，提高检测准确度，检测限可达10-4ppm。
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示测得值与标示量比值的百分比。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
表1实施例所用到的原料来源
| 原料名称 | 纯度 | 生产厂家 |
| 四硼酸钠 | 99.5％ | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 磷酸氢二钠 | 99.0％ | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 甲醇 | 99.9％ | 德国默克 |
| 邻苯二甲醛 | 99.0％ | Aglient technologies |
| 细菌酶 | 酶活约4000IU/mL | 华熙生物科技股份有限公司 |
| 盐酸赖氨酸对照品 | 99.9％ | 中国食品药品检定研究院 |
| 注射用透明质酸钠复合溶液 | 无 | 华熙生物科技股份有限公司 |
| 动物酶 | 酶活约4000-10000IU/mL | 华熙生物科技股份有限公司 |
实施例1-1
对照品溶液：精密称取盐酸赖氨酸对照品25mg至5mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，然后将上述溶液稀释500倍，得到对照品溶液；
供试品溶液：取供试品(批号：20190423)1ml至10mL容量瓶中，加入4ml酶解缓冲液，然后加入0.5ml细菌酶，在42℃下，酶解2.5h，酶解pH为6，80℃下煮沸3min，水定容至刻度。
其中，供试品的制备方法为：将处方量盐酸赖氨酸和其他辅料在水中溶解混匀后，加至交联透明质酸钠中，搅拌均匀，得供试品溶液。共制得两批供试品溶液，批号：20190423和20190428。
空白溶液：酶解缓冲液作为空白溶液。
检测步骤：
色谱条件为：
色谱柱：Poroshell HPH-C18色谱柱(4.6×100mm，2.7μm)
流动相：流动相A(8mmol/L磷酸氢二钠和8mmol/L硼酸钠，用盐酸将pH调节为8.2)：流动相B(甲醇)＝98:2
流速：1.5ml/min
进样量：1μL
柱温：40℃
检测波长：224nm
取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液进样，外标法测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的含量。
其中，对于供试品溶液，在进样前对其进行衍生化处理，即吸取硼酸盐缓冲液3.5mL，然后吸取供试品1.0mL，混合，等待3min，加入邻苯二甲醛试剂0.6mL，混合。
含量的测定采用下式进行计算：
供试品中盐酸赖氨酸含量计算公式：
注：Pi---供试品中盐酸赖氨酸含量，％
cr---对照品溶液中盐酸赖氨酸浓度，mg/mL
Ai---供试品溶液的峰面积
Ar---对照品溶液的峰面积
cl---供试品中盐酸赖氨酸的标示含量，盐酸赖氨酸的标示含量为0.2mg/mL。
经测定，实施例1-1中注射用透明质酸复合溶液(批号：20190423)中盐酸赖氨酸的含量结果如下，检测限为1x10-4ppm，其中，百分含量代表的是测得值与标示含量的百分比。
表2实施例1-1的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-2
将实施例1-1中的色谱流动相A的浓度设定为12mmol/L的磷酸硼酸盐溶液，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为5x10-4ppm。
表3实施例1-2的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-3
将实施例1-1中的色谱的流动相A改为pH值为8.4的磷酸硼酸盐，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为4x10-4ppm。
表4实施例1-3的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-4
将实施例1-1中的流动相流速改为1.2ml/min，他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为3x10-4ppm。
表5实施例1-4的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-5
将实施例1-1中的色谱的检测波长改变为235nm，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为2x10-3ppm。
表6实施例1-5的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-6
将实施例1-1中的色谱条件进样量改为0.9μL，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为2x10-4ppm。
表7实施例1-6的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-7
将实施例1-1中的流动相A与流动相B的配比改为97％流动相A，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为4x10-4ppm。
表8实施例1-7的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-8
将实施例1-1中供试品换为另一批，批号为20190428，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为1x10-4ppm。
表9实施例1-8的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-9
将实施例1-1中的色谱条件进样量改为0.8μL，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为2.5x10-4ppm。
表10实施例1-9的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-10
将实施例1-1中的色谱条件进样量改为0.5μL，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为9x10-4ppm。
表11实施例1-10的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-11
将实施例1-1中的色谱条件进样量改为1.5μL，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为7x10-4ppm。
表12实施例1-11的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-12
将实施例1-1中的流动相流速改为1.0ml/min，他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为3.5x10-4ppm。
表13实施例1-12的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-13
将实施例1-1中的色谱的检测波长改变为220nm，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为8x10-4ppm。
表14实施例1-13的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-14
将实施例1-1中的色谱的检测波长改变为250nm，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为7x10-4ppm。
表15实施例1-14的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-15
将实施例1-1中的流动相A与流动相B的配比改为90％流动相A，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为6x10-4ppm。
表16实施例1-15的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-16
将实施例1-1中的柱温改为30℃，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为7x10-4ppm。
表17实施例1-16的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例1-17
将实施例1-1中的柱温改为45℃，其他条件与实施例1-1相同，测定的盐酸赖氨酸的含量如下，检测限为3x10-4ppm。
表18实施例1-17的盐酸赖氨酸的含量结果
表19实施例1-1至1-17的色谱条件表
实施例2-1重复性的测定
按照实施例1-1中的供试品处理方式，取与实施例1-1同一批号样品，平行制备6份，对照品溶液以及检测条件同实施例1-1相同，测定结果如表20所示。
表20实施例2-1的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例2-2日间精密度的测定
按照实施例1-1中的供试品处理方式，取与实施例1-1同一批号样品，在不同的时间平行制备6份，对照品溶液以及检测条件同实施例1-1相同，使用不同的仪器，测定结果如表21所示。
表21实施例2-2的盐酸赖氨酸的含量结果
实施例2-3准确度的测定
取不含盐酸赖氨酸的空白溶液，按照实施例1-1中的供试品处理方式处理空白溶液，精密称取实施例1-1中对照品，模拟处方配成处方量的80％、100％、120％浓度供试品溶液，分别平行制备3份，共9份。对照品溶液以及检测条件同实施例1-1相同，测定结果如表22所示。
表22盐酸赖氨酸准确度验证结果
比较例1
将实施例1-1中对供试品处理所用的透明质酸酶改为动物酶，因动物酶含有少量盐酸赖氨酸以及其他种类少量氨基酸，导致检测结果偏大，其检测限为3×10-4ppm。
表23对比例1的盐酸赖氨酸的含量结果
比较例2
将实施例1-1中的供试品不做酶解处理，交联透明质酸钠的复杂结构可能影响盐酸赖氨酸的衍生反应，检测结果如表24所示，其检测限为3×10-4ppm。
表24对比例2的盐酸赖氨酸的含量结果
比较例3
将实施例1-1中衍生化试剂改为异硫氰酸苯酯，其他条件与实施例1相同，检测结果发现供试品中盐酸赖氨酸检测结果偏低，如表25所示，其检测限为3×10-3ppm。
表25对比例3的盐酸赖氨酸的含量结果
比较例4
将实施例1-1中流动相B改为甲醇：乙腈：水为45：45：10，其他条件与实施例1相同，检测结果无发现盐酸赖氨酸峰。
比较例5
将实施例1-1中流动相A与流动相B进行梯度洗脱，时间为0-0.5-20-20.1-23.5-23.6-25，流动相A-98％-98％-43％-0％-0％-98％-98％，其他条件与实施例1相同，检测结果无发现供试品中盐酸赖氨酸的峰。
比较例6
将实施例1-1中检测波长改为262nm，其他条件与实施例1相同，检测结果无发现供试品中盐酸赖氨酸的峰。
表26对比例1-6的条件
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (28)
1.一种测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包含下述步骤：
供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；
标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；
检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量；
所述透明质酸酶为细菌酶；
在检测步骤中，流动相采用体积比为90:10-98:2的弱碱溶液:甲醇；
在检测步骤中，检测波长为220-250nm；
衍生化试剂为邻苯二甲醛；
在检测步骤中，使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在35-45℃酶解。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在42℃酶解。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，酶解3-3.5h。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，酶解2-3h。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，酶解pH为6.0-6.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在线衍生技术包括下述步骤：将所述供试品溶液与衍生化试剂在缓冲溶液存在下混合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述缓冲溶液为硼酸盐缓冲溶液。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，使用的色谱柱为Poroshell HPH-C18色谱柱。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，流动相采用体积比为97:3-98:2的弱碱溶液:甲醇。
11.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，流动相采用体积比为98:2的弱碱溶液:甲醇。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述弱碱溶液为pH8.0-8.8的溶液。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述弱碱溶液为pH8.2-8.4的溶液。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述弱碱溶液为pH8.2的溶液。
15.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述弱碱溶液为磷酸硼酸盐溶液。
16.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述弱碱溶液为浓度为8-12mmol/L的磷酸硼酸盐溶液。
17.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述弱碱溶液为浓度为8mmol/L的磷酸硼酸盐溶液。
18.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：流速为1.0-1.5ml/min。
19.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：流速为1.2-1.5ml/min。
20.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：流速为1.5ml/min。
21.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：检测波长为224-235nm。
22.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：检测波长为224nm。
23.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：进样量为0.5-1.5μL。
24.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：进样量为0.8-1μL。
25.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：进样量为1μL。
26.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：柱温为30-45℃。
27.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，在检测步骤中，采用的色谱条件为：柱温为40℃。
28.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中，所述注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的检测限大于等于10-4ppm。
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