CN114236014B - 隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法,检测方法为高效液相色谱法,检测方法包括:a)配制透明质酸酶处理后的参照溶液和待测溶液;b)选择高效液相色谱仪的色谱参数,色谱参数包括使用ODS色谱柱;c)分别取参照溶液和待测溶液进样,并按照色谱参数运行高效液相色谱仪以获得对应于参照溶液的第一峰面积以及对应于待测溶液的第二峰面积;以及d)根据第一峰面积和第二峰面积以得到护理液中透明质酸钠的浓度。根据本发明,能够提供一种专属性好的、适用于隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法。
Description
技术领域
本发明大体涉及化学检测领域,具体涉及一种隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法。
背景技术
透明质酸是一种大分子酸性粘多糖,具有润滑、保湿、滋养、抗皱等作用,通常以钠盐即透明质酸钠的形式存在,透明质酸钠在化妆品、食品、药品中具有广泛的应用。
透明质酸钠也常作为隐形眼镜护理液的成分之一,当隐形眼镜护理液中的透明质酸钠含量在一定范围内时,有利于提供合适的液体粘度且利于护理液被眼体吸收。根据医疗器械分类目录,隐形眼镜的护理液被列为国家III类医疗器械。根据相应的法规要求,在规定期限后,护理液的部分成分含量的变化量应保持在较低水平,因此,需要对护理液中的透明质酸钠的含量进行检测。
目前,检测透明质酸钠的含量的检测方法有硫酸-咔唑法,高效液相色谱法(HPLC法)等。硫酸-咔唑法的工作原理是利用硫酸水解透明质酸钠得到的糖醛酸与咔唑的显色强弱来测定透明质酸钠含量高低,该方法在检测过程中的干扰因素比较多,专属性比较差,得到的检测结果可能与实际含量有较大的误差。高效液相色谱法为采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法,注入的供试品,由流动相带入色谱柱内,各组分在柱内被分离,并进入检测器检测,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
目前,利用高效液相色谱法对透明质酸钠进行检测大致有以下几种方式:①采用凝胶色谱柱(SEC柱),利用待测物分子量的大小来达到分离目的,但是该方法测得的峰宽通常较宽,而且峰形对称性不佳,可能会对检测结果造成影响,此外透明质酸钠的粘度较高,可能会对SEC柱造成损伤;②采用糖基柱或氨基柱,其原理是透明质酸钠分子结构中存在羟基,该方法中的色谱柱的流动相的pH值的范围较窄,且色谱柱基质不太稳定,寿命较短;③采用离子交换色谱柱,该色谱柱工作原理是利用待测物电离后的电荷差异来选择性分离,而隐形眼镜的护理液中通常含有金属络合剂(例如EDTA),若采用离子交换色谱柱,金属络合剂与透明质酸钠的酶解产物离子同流出,该方法的专属性也比较差。
发明内容
本发明是有鉴于上述现有技术的状况而提出的,其目的在于提供一种专属性好的、适用于隐形眼镜护理液中透明质酸钠的含量的检测方法。
为此,本发明提供了一种隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法,所述检测方法为高效液相色谱法,所述检测方法包括:a)配制透明质酸酶处理后的参照溶液和待测溶液;b)选择高效液相色谱仪的色谱参数,所述色谱参数包括使用ODS色谱柱;c)分别取所述参照溶液和所述待测溶液进样,并按照所述色谱参数运行所述高效液相色谱仪以获得对应于所述参照溶液的第一峰面积以及对应于所述待测溶液的第二峰面积;以及d)根据所述第一峰面积和所述第二峰面积以得到所述护理液中透明质酸钠的浓度。具体地,基于以下公式得到所述护理液中透明质酸钠的浓度:
其中,cx是指待测溶液的浓度,cR是指参照溶液的浓度,Ax是指待测溶液的第二峰面积,AR是指参照溶液的第一峰面积。
在本发明中,通过使用透明质酸酶对透明质酸钠进行特异性地酶解并生成酶解产物,由此,能够得到含有透明质酸钠的酶解产物的参照溶液和待测溶液;再利用高效液相色谱法,对酶解产物进行检测,得到参照溶液和待测溶液的峰面积,再利用上述两个峰面积得到待测溶液中酶解产物的含量,从而,能够得到护理液中的透明质酸钠的含量;本发明使用的色谱参数选择使用ODS色谱柱(十八烷基硅烷键合硅胶填料,也可以称为C18色谱柱),C18色谱柱是根据待测物分子极性大小进行选择性分离,相较于离子交换色谱柱,能够不受ETDA等护理液中其他物质的干扰,对护理液中透明质酸钠检测的专属性较好。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,在步骤b)中,可以使用AQ色谱柱。选用C18色谱柱中的AQ色谱柱,还能够对纯水相更加耐受,从而延长色谱柱的使用寿命。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,在步骤a)中,所述参照溶液的配置方法包括:准备透明质酸钠,加入至纯化水中;搅拌至所述透明质酸钠完全溶于所述纯化水,得到透明质酸钠溶液;取第一体积的透明质酸钠溶液,并向第一体积的所述透明质酸钠溶液中加入第二体积的透明质酸酶进行酶解反应,其中所述第二体积被设定成,使得1mg的透明质酸钠对应有不低于200活性单位(units)的透明质酸酶;以及得到预定浓度的所述参照溶液。由此,透明质酸酶能够对透明质酸钠进行更加充分地酶解,得到预定浓度的参照溶液;同时,在保障酶解能力的基础上,还能够节约酶的使用量,降低检测成本。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,在步骤a)中,所述待测溶液的配置方法包括:准备所述护理液;取第一体积的所述护理液,并向第一体积的所述护理液中加入第二体积的透明质酸酶进行酶解反应;以及得到所述待测溶液。由此,能够得到酶解处理后的待测溶液。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,所述酶解反应的反应温度为20℃~60℃,反应时间为大于3小时。由此,能够提供合适的酶解反应温度,有利于透明质酸酶的酶解反应的进行。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,所述透明质酸酶采用经由微生物发酵得到的透明质酸酶。微生物来源的透明质酸酶催化透明质酸钠得到的酶解产物含有不饱和双键,具有紫外吸收性,可以采用常规的紫外检测器对该酶解产物进行检测;而动植物来源的透明质酸酶催化透明质酸钠得到的酶解产物为四元糖,该糖类物质不具有紫外吸收性,不能采用紫外检测器对酶解产物进行检测。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,所述色谱参数还包括:使用pH值为2.0~5.0的磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合相作为流动相,所述流动相中磷酸二氢钾溶液的浓度为5mM~100mM。在这种情况下,通过选择合适的流动相的成分、配比和pH值,对于护理液中的透明质酸钠的检测,能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,所述流动相中磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比为100:0~95:5。流动相的配比影响待测溶液中各成分的分离效果,在这种情况下,通过选择合适的流动相的配比,对于护理液中的透明质酸钠的检测,能够有利于获得良好的分离效果。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,所述色谱参数还包括:所述色谱柱的柱温为30℃;所述流动相的流速为0.9ml/min~1.2ml/min;检测波长为210nm~254nm。在这种情况下,通过选择合适的柱温与流速,对于护理液中的透明质酸钠的检测,能够有利于获得良好的分离效果;通过选择合适的检测波长,能够提高检测的准确度。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,在步骤c)中,所述参照溶液和所述待测溶液的进样量为10~20μl。在这种情况下,通过选择合适的进样量,对于护理液中的透明质酸钠的检测,能够有利于获得良好的分离效果和线性关系。
在本发明所涉及的检测方法中,可选地,所述第一峰面积和所述第二峰面积选自对应的色谱图中的最大峰的峰面积。利用微生物来源的透明质酸钠酶对透明质酸钠进行酶解后具有两种酶解产物,因此,高效液相色谱仪信号将产生两个分离的色谱峰,发明人发现,其中,具有较小面积的色谱峰中包括护理液中的其他成分,专属性影响较大;而具有较大面积的另一个色谱峰则未包括护理液中的其他成分。为此,具有较大面积的峰被选做上述第一峰面积、第二峰面积,由此可以提高检测准确度。也即,本公开所采用的所用第一峰面积、第二峰面积采用具有最大峰面积的峰来计算,可以避免护理液其他成分的影响。
根据本发明,能够提供一种专属性好的、适用于检测护理液中的透明质酸钠的含量的检测方法。
附图说明
图1是示出了本公开的实施方式所涉及的隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法的流程图。
图2是示出了图1所涉及的配置参照溶液的流程图。
图3是示出了图1所涉及的配置待测溶液的流程图。
图4是示出了本公开的实施方式所涉及的实施例1的参照溶液的峰图。
图5是示出了本公开的实施方式所涉及的实施例1的待测溶液的峰图。
图6是示出了本公开的实施方式所涉及的实施例2的参照溶液的峰图。
图7是示出了本公开的实施方式所涉及的实施例2的待测溶液的峰图。
图8是示出了本公开的实施方式所涉及的实施例3的参照溶液的峰图。
图9是示出了本公开的实施方式所涉及的实施例3的待测溶液的峰图。
图10是示出了本公开的实施方式所涉及的比较例1的待测溶液的峰图。
图11是示出了本公开的实施方式所涉及的比较例2的参照溶液的峰图。
图12是示出了本公开的实施方式所涉及的比较例2的待测溶液的峰图。
图13是示出了本公开的实施方式所涉及的参考例1的空白溶液的峰图。
图14是示出了本公开的实施方式所涉及的参考例3的线性图。
具体实施方式
以下,参考附图,详细地说明本发明的优选实施方式。在下面的说明中,对于相同的部件赋予相同的符号,省略重复的说明。另外,附图只是示意性的图,部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。
需要说明的是,本发明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形,例如所包括或所具有的一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可以包括或具有没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
另外,在本发明的下面描述中涉及的小标题等并不是为了限制本发明的内容或范围,其仅仅是作为阅读的提示作用。这样的小标题既不能理解为用于分割文章的内容,也不应将小标题下的内容仅仅限制在小标题的范围内。
本公开所涉及的隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法为高效液相色谱法。本公开所涉及的隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法可以简称为检测方法。
本公开所涉及的隐形眼镜的护理液可以应用于隐形眼镜的清洁、消毒、贮存等。在一些示例中,护理液可以是市售的,也可以是自制的。在一些示例中,本公开的护理液可以包括透明质酸钠。在一些示例中,本公开的护理液还可以包括稳定剂(例如EDTA-2Na)。在一些示例中,本公开的护理液还可以包括用于调节护理液pH值和渗透压的无机盐和防腐剂等。
以下结合附图进行详细描述本发明。图1是示出了本实施方式所涉及的隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法的流程图。图2是示出了图1所涉及的配置参照溶液的流程图。图3是示出了图1所涉及的配置待测溶液的流程图。
在一些示例中,如图1所示,隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法可以包括:配置参照溶液和待测溶液(步骤S100);选择高效液相色谱仪的色谱参数(步骤S200);取参照溶液和待测溶液进样,并运行高效液相色谱仪(步骤S300);得到护理液中透明质酸钠的含量(步骤S400)。
在一些示例中,步骤S100可以包括步骤S120和步骤S130。其中,步骤S120为配置参照溶液的步骤,步骤S130为配置待测溶液的步骤。
在一些示例中,在步骤S120中,如图2所示,配置参照溶液的流程可以包括:准备透明质酸钠,加入至纯化水中(步骤S121);搅拌得到透明质酸钠溶液(步骤S122);取第一体积的透明质酸钠溶液,加入第二体积的透明质酸酶(步骤S123);得到预定浓度的参照溶液(步骤S124)。
在一些示例中,在步骤S121中,透明质酸钠与纯化水的质量体积比可以根据护理液中透明质酸钠的质量体积比而决定,例如可以使透明质酸钠与纯化水的质量体积比大致与护理液中透明质酸钠的质量体积比相似。
在一些示例中,在步骤S122中,可以搅拌至使透明质酸钠完全溶于纯化水,得到透明质酸钠溶液。
在一些示例中,在步骤S123中,可以取第一体积的透明质酸钠溶液,并向第一体积的透明质酸钠溶液中加入第二体积的透明质酸酶进行酶解反应。在一些示例中,透明质酸酶的第二体积被设定成,可以使得1mg中的透明质酸钠对应有不低于200活性单位(units)的透明质酸酶。例如,透明质酸酶的第二体积可以被设定成,使得1mg中的透明质酸钠对应有200活性单位(units)的透明质酸酶。由此,使透明质酸酶更加充足,能够更加充分地使透明质酸钠发生酶解。在保障酶解水平的基础上,也能减少酶的使用量,降低检测成本。
在一些示例中,在步骤S123中,透明质酸钠的酶解反应的反应温度可以为20℃~60℃,例如透明质酸钠的酶解反应的反应温度可以为20℃、30℃、40℃、50℃或60℃。由此,在不破坏酶的活性的情况下,能够提供合适的反应温度,利于酶解反应的进行。
在一些示例中,在步骤S123中,透明质酸钠的酶解反应的反应时间可以大于3小时。例如,透明质酸钠的酶解反应的反应时间可以为3小时、3.5小时、4小时。由此,能够有利于使透明质酸钠被充分酶解。
在一些示例中,在步骤S123中,透明质酸钠的酶解反应的压力条件可以为常规大气压。
在一些示例中,在步骤S123中,透明质酸酶可以采用经由微生物发酵得到的透明质酸酶。例如,可以为链球菌、链霉菌、噬菌体等微生物发酵得到的透明质酸酶。在一些示例中,在步骤S123中,透明质酸酶不采用提取自动植物的透明质酸酶。微生物来源的透明质酸酶催化透明质酸钠得到的酶解产物含有不饱和双键,具有紫外吸收性,可以采用常规的紫外检测器对酶解产物进行检测;而动植物来源的透明质酸酶催化透明质酸钠得到的酶解产物为四元糖,该糖类物质不具有紫外吸收性,不能采用紫外检测器对酶解产物进行检测。
在一些示例中,在步骤S124中,可以将经过步骤S123处理后的溶液放置至室温,得到参照溶液。可以理解地,参照溶液中,透明质酸钠的酶解产物的浓度,与步骤S122中透明质酸钠溶液的浓度是具有对应关系的。也就是说,可以通过参照溶液的浓度得到透明质酸钠溶液的浓度。
在一些示例中,在步骤S130中,如图3所示,配置待测溶液的流程可以包括:准备护理液(步骤S131);取第一体积的护理液,加入第二体积的透明质酸酶(步骤S132);得到待测溶液(步骤S133)。
在一些示例中,在步骤S131中,护理液可以为市售或自研的隐形眼镜的护理液。在本实施方式中,护理液可以包括保湿剂透明质酸钠、pH调节剂、渗透压调节剂、稳定剂(例如EDTA-2Na)、以及防腐剂中的一种或多种。
在一些示例中,在步骤S132中,可以取第一体积的护理液,加入第二体积的透明质酸酶,进行酶解反应。由此,能够使护理液中的透明质酸钠发生酶解。在一些示例中,如上所述,护理液中的透明质酸钠的质量体积比可以和步骤S121中透明质酸钠和纯化水的质量体积比大致相同。也就是说,在这种情况下,取相同体积的透明质酸钠溶液和护理液,加入相同体积的透明质酸酶,而透明质酸钠溶液和护理液中透明质酸钠的浓度接近,由此也能够让透明质酸酶的量更加足够地使护理液中的透明质酸钠发生酶解。
在一些示例中,在步骤S132中,护理液中透明质酸钠的酶解反应的反应温度可以为20℃~60℃,例如可以为20℃、30℃、40℃、50℃或60℃。由此,能够提供合适的反应温度,利于酶解反应的进行。
在一些示例中,在步骤S132中,护理液中透明质酸钠的酶解反应的反应时间可以大于3小时。由此,能够更加充分地保障透明质酸钠被酶解。
在一些示例中,在步骤S132中,透明质酸酶可以采用经由微生物发酵得到的透明质酸酶。例如,可以为链球菌、链霉菌、噬菌体等微生物发酵得到的透明质酸酶。微生物来源的透明质酸酶催化透明质酸钠得到的酶解产物含有不饱和双键,具有紫外吸收性,可以采用常规的紫外检测器对酶解产物进行检测;而动植物来源的透明质酸酶催化透明质酸钠得到的酶解产物为四元糖,该糖类物质不具有紫外吸收性,不能采用紫外检测器对酶解产物进行检测。
在一些示例中,在步骤S133中,可以将经过步骤S132处理后的溶液放置至室温,得到待测溶液,备用。可以理解地,在待测溶液中,透明质酸钠的酶解产物的浓度,与步骤S131中护理液中透明质酸钠的浓度是具有对应关系的。也就是说,可以通过待测溶液的浓度得到护理液中透明质酸钠的浓度。
在一些示例中,在步骤S200中,高效液相色谱仪的色谱参数可以包括选择使用的色谱柱为ODS色谱柱(C18色谱柱)。在一些示例中,可以选择使用AQ色谱柱。其中,AQ色谱柱的规格可以为4.6*150mm,5μm。C18色谱柱是根据待测物分子极性大小进行选择性分离,相较于离子交换色谱柱,能够不受ETDA等护理液中其他物质的干扰,对护理液中透明质酸钠检测的专属性好,C18色谱柱或AQ色谱柱对于检测透明质酸钠的含量具有运行时间短的特点,且C18色谱柱或AQ色谱柱价格较便宜,由此,根据本实施方式,能够专属性好地、降低成本地、快速地检测护理液中的透明质酸钠的含量。此外,选用AQ色谱柱,还能够对纯水相更加耐受,从而延长色谱柱的使用寿命。在另一些示例中,也可以选用与C18色谱柱或AQ色谱柱检测效果相当的其他色谱柱。
在一些示例中,在步骤S200中,可以选择磷酸盐溶液与甲醇的混合相作为流动相。在一些示例中,可以选择磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合相作为流动相。在一些示例中,磷酸二氢钾溶液的浓度可以为5mM~100mM。例如,磷酸二氢钾溶液的浓度可以为5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM等。在一些示例中,磷酸二氢钾溶液的pH值可以为2.0~5.0。例如,磷酸二氢钾溶液的pH值可以为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0。流动相的种类、浓度与pH值可能影响分离效果,本实施方式通过选择合适的流动相的种类、浓度与pH值,能够达到良好的分离效果。同时,不同流动相本身可能在特定波长处具有较强吸收,可能会对检测准确度造成影响,在这种情况下,通过选择合适的流动相,对护理液中的透明质酸钠的检测,能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。
在一些示例中,在步骤S200中,流动相中磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比可以为100:0~95:5。例如,流动相中磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比可以为100:0、99.5:0.5、99:1、98.5:1.5、98:2、97.5:2.5、97:3、96.5:3.5、96:4、95.5:4.5或95:5等。在这种情况下,通过选择合适的流动相的比例,对护理液中的透明质酸钠的检测,能够有利于获得良好的分离效果和提高检测的准确度。
在一些示例中,在步骤S200中,色谱参数还可以包括:色谱柱的柱温可以为30℃。温度对于分离效果有影响,在这种情况下,本实施方式选择合适的柱温,能够有利于获得良好的检分离效果。
在一些示例中,在步骤S200中,色谱参数还可以包括:流动相的流速可以为0.9ml/min~1.2ml/min。例如,流动相的流速可以为0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min或1.2ml/min等。优选地,流动相的流速为1ml/min。流速对于分离效果有影响,在这种情况下,本实施方式选择合适的流动相流速,能够有利于获得良好的分离效果。
在一些示例中,在步骤S200中,色谱参数还可以包括:检测波长可以为210nm~254nm。例如,检测波长可以为210nm、220nm、230nm、240nm、250nm或254nm等。优选地,检测波长为232nm。本实施方式根据护理液中成分及透明质酸钠的酶解产物的性质,确定了透明质酸钠的酶解产物的吸收带的分布波长,由此,能够有利于提高检测的准确性。
在一些示例中,在步骤S300中,参照溶液的进样量可以为10~20μl。例如,参照溶液的进样量可以为10μl、13μl、15μl、18μl或20μl等。进样量过低会影响检测限和峰面积的重复性,而进样量过高会影响分离的和线性关系,本实施方式选择合适的进样量,能够有利于获得良好的分离效果和线性关系。
在一些示例中,在步骤S300中,可以按照所选择的色谱参数运行高效液相色谱仪,并得到参照溶液的色谱图。参照溶液的色谱图中具有第一峰,第一峰具有第一峰面积。
在一些示例中,在步骤S300中,待测溶液的进样量可以为10~20μl。例如,待测溶液的进样量可以为10μl、13μl、15μl、18μl或20μl等。进样量过低会影响检测限和峰面积的重复性,而进样量过高会影响分离的和线性关系,本发明选择合适的进样量,能够获得良好的实验效果。优选地,在一些示例中,待测溶液的进样量可以和参照溶液的进样量相同,由此,能够便于计算待测溶液中的透明质酸钠的含量。
在一些示例中,在步骤S300中,可以按照所选择的色谱参数运行高效液相色谱仪,并得到待测溶液的色谱图。待测溶液的色谱图具有第二峰,第二峰具有第二峰面积。
在一些示例中,在步骤S300中,运行时间可以为主峰保留时间的1.3倍至3倍。由此,能够使主峰完整地被检测到,并可以观察是否存在杂质峰的影响。
在一些示例中,在步骤S400中,可以基于以下公式得到护理液中透明质酸钠的浓度:
其中,cx是指待测溶液的浓度,cR是指参照溶液的浓度,Ax是指待测溶液的第二峰面积,AR是指参照溶液的第一峰面积。由此,能够通过该公式计算出待测溶液的浓度(即护理液中透明质酸钠的浓度)。
下面通过实施例、比较例和参考例对本发明进行详细描述。但下述实施例、比较例或参考例只是为了具体说明本发明而提供的例子,并不限定或限制本申请中公开的发明的范围。
[实施例]
实施例1:
试剂及材料
甲醇(市售,HPLC级)
磷酸二氢钾(市售,AR)
纯化水(自制)
透明质酸钠(市售,药辅级)
透明质酸酶(10000units/1ml/瓶,山东福瑞达)
护理液(隐形眼镜润滑液,上海卫康光学眼镜有限公司,国械注准20163161415,由以下组成配制:硼酸、硼砂、氯化钠、EDTA-2Na、透明质酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氨丙基双胍)
辅料空白溶液(自制,不含透明质酸钠,其余组分与上海卫康光学眼镜有限公司的隐形眼镜润滑液一致,也即由以下组成配制:硼酸、硼砂、氯化钠、EDTA-2Na、聚乙烯基吡咯烷酮、聚氨丙基双胍)
仪器
高效液相色谱仪:Agilent 1260的HPLC系统
检测器:紫外检测器(VWD)
样品配置
空白溶液:纯化水
参照溶液:精密称取37.5mg透明质酸钠对照品,置于25ml量瓶中,加适量纯化水润湿后,投入大小适中的搅拌子在转速300rpm/min的条件下搅拌直至完全溶解,用磁铁将搅拌子吸至量瓶瓶口处,用适量水清洗搅拌子,取出已清洗完毕的搅拌子,用纯化水稀释并定容至量瓶的刻度,摇匀,得到透明质酸钠溶液。取1ml上述透明质酸钠溶液于试管中,加入30μl(以使1mg透明质酸钠对应有200units的酶)透明质酸酶在40℃下酶解3小时后,冷却至室温。
待测溶液:取1ml护理液于试管中,加入30μl透明质酸酶在40℃下酶解3小时后,冷却至室温。
色谱参数
色谱柱:YMC Pack ODS-AQ色谱柱(4.6*150mm,5μm,维美希公司)
柱温:30℃
样品盘温度:室温
进样量:10μl
检测波长:232nm
流动相流速:1ml/min
流动相:10mM的磷酸二氢钾溶液:甲醇=95:5(体积比)
检测
分别取参照溶液和待测溶液进样,按照上述色谱参数进行检测,运行时间5分钟,利用上述峰面积计算护理液中透明质酸钠的含量。结果见下表1、图4及图5,图4是示出了本实施方式所涉及的实施例1的参照溶液的峰图;图5是示出了本实施方式所涉及的实施例1的待测溶液的峰图。
表1
参照溶液浓度(mg/ml) | 1.5922 |
参照溶液的峰面积 | 6796.25 |
待测溶液的峰面积 | 6832.11 |
待测溶液浓度(mg/ml) | 1.6006 |
得到的实施例1的参照溶液和待测溶液的保留时间为3分钟,其中,图4中的两个峰分别为透明质酸钠的两种酶解产物,使用灰色峰进行计算面积;图5中的中的两个峰分别为透明质酸钠的两种酶解产物,使用灰色峰进行计算面积。
实施例2:
流动相改为10mM的磷酸二氢钾溶液:甲醇=99.5:0.5(体积比);运行时间7分钟,其余色谱参数与实施例1一样,并使用实施例1的参照溶液和待测溶液进行进样与检测,结果见下表2、图6和图7。图6是示出了本实施方式所涉及的实施例2的参照溶液的峰图,图7是示出了本实施方式所涉及的实施例2的待测溶液的峰图。
表2
参照溶液浓度(mg/ml) | 1.5922 |
参照溶液的峰面积 | 7067.16 |
待测溶液的峰面积 | 7132.38 |
待测溶液浓度(mg/ml) | 1.6069 |
得到的实施例2的参照溶液和待测溶液的保留时间为5分钟,其中,图6中的两个峰分别为透明质酸钠的两种酶解产物,使用灰色峰进行计算面积;图7中的两个峰分别为透明质酸钠的两种酶解产物,使用灰色峰进行计算面积。
实施例3:
流动相改为10mM的磷酸二氢钾溶液:甲醇=100:0(体积比);运行时间10分钟,其余色谱参数与实施例1一样,并使用实施例1的参照溶液和待测溶液进行进样与检测,结果见下表3、图8和图9。图8是示出了本实施方式所涉及的实施例3的参照溶液的峰图,图9是示出了本实施方式所涉及的实施例3的待测溶液的峰图。
表3
参照溶液浓度(mg/ml) | 1.5922 |
参照溶液的峰面积 | 7682.58 |
待测溶液的峰面积 | 7743.04 |
待测溶液浓度(mg/ml) | 1.6047 |
得到的实施例3的参照溶液和待测溶液的保留时间为6分钟,其中,图8中的两个峰分别为透明质酸钠的两种酶解产物,使用灰色峰进行计算面积;图9中的两个峰分别为透明质酸钠的两种酶解产物,使用灰色峰进行计算面积。
[比较例]
比较例1:
流动相改为10mM的磷酸二氢钾溶液:甲醇=90:10(体积比);其余色谱参数与实施例1一样,并使用实施例1的参照溶液和待测溶液进行进样与检测,结果见下表4与图10。图10是示出了本实施方式所涉及的比较例1的待测溶液的峰图。
表4
参照溶液浓度(mg/ml) | 1.5922 |
参照溶液的峰面积 | 6688.75 |
待测溶液的峰面积 | 6673.12 |
待测溶液浓度(mg/ml) | 1.5885 |
由图10可以看到,峰图存在重叠,不符合分离度的要求。
比较例2:
色谱柱改为安捷伦Agilent Hi-Plex Na(7.7×300mm)色谱柱,该色谱柱属于强阳离子色谱柱;其他色谱参数根据色谱柱类型相应修改:流动相:水;流速:0.5ml/min;进样量:10μl;柱温:80℃;检测波长:232nm,取实施例1的参照溶液和待测溶液分别进行进样与检测,结果见图11与图12,图11是示出了本实施方式所涉及的比较例2的参照溶液的峰图。图12是示出了本实施方式所涉及的比较例2的待测溶液的峰图。
由图11可以看到,透明质酸钠的两种酶解产物共同流出,呈现为一个峰;图12可以看到,各组分在阳离子色谱柱上离子共流出,呈现为一个峰;因此,该色谱柱的专属性不佳,不适用于检测护理液中透明质酸钠的含量。
[参考例]
参考例1:分析方法验证之专属性
取纯化水(即空白溶液)进样,其余色谱参数与实施例1一样,进行检测,结果见图13,图13是示出了本实施方式所涉及的参考例1的空白溶液的峰图。
再根据实施例1的图4、图5,以及参考例1的图13的结果可知,实施例1的参照溶液和待测溶液的保留时间为3分钟,峰型明显,未见杂质峰;参考例1的空白溶液在3分钟处无明显峰型。因此,本实施方式满足专属性的检测要求。
参考例2:分析方法验证之准确度
参照品:精密称取透明质酸钠80.68mg,置于50ml量瓶中,加适量纯化水与搅拌子在转速300rpm/min下搅拌至完全溶解,用磁铁石将搅拌子吸引至量瓶瓶口处,用适量的纯化水清洗搅拌子后,用纯化水稀释至刻度。摇匀,得到透明质酸钠溶液。取1ml上述透明质酸钠溶液于试管中,加入50μl透明质酸酶在40℃下酶解3小时后,冷却至室温。
标准品:分别精密称取透明质酸钠41.31、81.84、118.98mg,置于50ml量瓶中,加适量辅料空白溶液与搅拌子在转速300rpm/min下搅拌至完全溶解,用磁铁石将搅拌子吸引至量瓶瓶口处,用适量的辅料空白溶液清洗搅拌子后,用辅料空白溶液定容至刻度。摇匀,得到标准品溶液。取1ml上述标准品溶液于试管中,加入50μl透明质酸酶在40℃下酶解3小时后,冷却至室温。得到3份标准品。
分别取参考例2的参照品和3份标准品,并按照实施例1的色谱条件进行进样与检测,根据标准品的实际称样量与标准品的计算含量得到回收率。如下表5所示。
由表5可以得知,回收率均符合AOAC标准,也就是说,本实施方式满足准确度的检测要求。
表5
参考例3:分析方法验证之线性
参考实施例1的参照溶液的配置方法,分别得到5个梯度的参照溶液(分别为下表6的溶液1至溶液5),并分别对溶液1至溶液5分别进样检测,其余色谱参数与实施例1一样,结果见下表6和图14,图14是示出了本实施方式所涉及的参考例3的线性图:
表6
浓度(mg/ml) | 峰面积 | |
溶液1 | 0.32272 | 1328.07 |
溶液2 | 0.80680 | 3286.61 |
溶液3 | 1.12952 | 4665.21 |
溶液4 | 1.29088 | 5311.06 |
溶液5 | 1.61360 | 6703.64 |
如图14所示,以5个参照溶液的浓度与峰面积作为X轴与Y轴作图,得到线性回归方程:y=4162.3958x-39.6048,R2=0.9998。呈现良好的线性关系,也就是说,本实施方式满足线性的检测要求。
虽然以上结合附图和实施例对本公开进行了具体说明,但是可以理解,上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化,这些变形和变化均落入本公开的范围内。
Claims (8)
1.一种隐形眼镜的护理液中透明质酸钠的含量的检测方法,所述检测方法为高效液相色谱法,其特征在于,所述检测方法包括:
a)配制透明质酸酶处理后的参照溶液和待测溶液,得到含有透明质酸钠的酶解产物的所述参照溶液和所述待测溶液;
b)选择高效液相色谱仪的色谱参数,所述色谱参数包括使用的色谱柱为ODS色谱柱,所述色谱参数包括选择pH值为2.0~5.0的磷酸二氢钾溶液与甲醇的混合相作为流动相,在所述流动相中磷酸二氢钾溶液与甲醇的体积比为95:5,所述流动相中磷酸二氢钾溶液的浓度为5mM~100mM,所述色谱参数还包括检测波长为232nm;
c)分别取所述参照溶液和所述待测溶液进样,并按照所述色谱参数运行所述高效液相色谱仪以获得对应于所述参照溶液的第一峰面积以及对应于所述待测溶液的第二峰面积,所述第一峰面积和所述第二峰面积分别选自所述参照溶液和所述待测溶液的色谱图中的最大峰的峰面积;以及
d)基于以下公式得到所述护理液中透明质酸钠的浓度:
其中,cx是指所述待测溶液的浓度,cR是指所述参照溶液的浓度,Ax是指所述待测溶液的第二峰面积,AR是指所述参照溶液的第一峰面积。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤b)中,使用的色谱柱为AQ色谱柱。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤a)中,所述参照溶液的配制方法包括:
准备透明质酸钠,加入至纯化水中;
搅拌至所述透明质酸钠完全溶于所述纯化水,得到透明质酸钠溶液;
取第一体积的透明质酸钠溶液,并向第一体积的所述透明质酸钠溶液中加入第二体积的透明质酸酶进行酶解反应,得到预定浓度的所述参照溶液,其中所述第二体积被设定成,使得1mg的透明质酸钠对应有不低于200活性单位的透明质酸酶。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤a)中,所述待测溶液的配制方法包括:
准备所述护理液;
取第一体积的所述护理液,并向第一体积的所述护理液中加入第二体积的透明质酸酶进行酶解反应;以及
得到所述待测溶液。
5.根据权利要求3或4所述的检测方法,其特征在于,所述酶解反应的反应温度为20℃~60℃,反应时间大于3小时。
6.根据权利要求5所述的检测方法,其特征在于,所述透明质酸酶采用经由微生物发酵得到的透明质酸酶。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述色谱参数还包括:所述色谱柱的柱温为30℃;所述流动相的流速为0.9ml/min~1.2ml/min。
8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,在步骤c)中,所述参照溶液和所述待测溶液的进样量为10~20μl。
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