CN109298113A - 一种测定包含有柠檬酸的溶液中的透明质酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定透明质酸含量的方法，其包括：利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的柱温为60℃～95℃。本发明的方法特别适合于检测含有柠檬酸的物质中的透明质酸的含量。

Description

一种测定包含有柠檬酸的溶液中的透明质酸含量的方法
技术领域
本发明涉及透明质酸的检测领域，具体涉及一种测定透明质酸含量、特别是含柠檬酸的物质中的透明质酸含量的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸或玻尿酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖。1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。
透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品、医药和临床治疗等行业领域。
大分子透明质酸可被细菌来源的透明质酸酶彻底水解为不饱和透明质酸双糖(ΔDiHA)，ΔDiHA在232nm处有特异性紫外吸收，可通过色谱柱与其它成分分离后用外标法检测其含量。目前，检测透明质酸常用的方法有HPLC法、比色法、CTAB比浊法和咔唑显色法。例如专利文献1公开了用咔唑显色法定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法，但在检测前需要除去发酵液中的残留杂糖、色素等干扰因素。另外，在专利文献2中公开了一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法，其中使用了分子筛色谱柱，流动相为0.1～1mol/L的KCl-磷酸盐缓冲液。
在色谱法中，分离寡糖类物质一般选用采用氨基键合柱，此种色谱柱填料易水解，耐用性差，且流动相(水相)中需要添加像专利文献2那样的高浓度的缓冲盐才可将透明质酸双糖洗脱，长期使用高盐流动相会对液相管路系统造成损伤。因此，本发明人开发了一种不使用上述高浓度的缓冲盐，能够有效地检测透明质酸的方法。其中,使用了一类用于分析有机酸的离子交换柱，特别是MCI GEL CK08EH色谱柱，能够将透明质酸双糖与其它小分子物质分离，柱效高，且耐用性好，流动相中不需要添加缓冲盐，由此建立了酶解法联合高效液相色谱法用于复杂配方保健食品中HA含量的检测的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:CN108362686A
专利文献2:CN107561179A
发明内容
然而上述本发明人开发的方法中，在检测含有柠檬酸的配方中的透明质酸(HA)含量时，由于柠檬酸和降解后的透明质酸钠即透明质酸钠二糖色谱的谱图或出峰时间非常近似，即，柠檬酸的保留时间与不饱和透明质酸双糖ΔDiHA保留时间相近，因此在含有柠檬酸的条件下，存在对透明质酸的检测的干扰问题。
为了解决上述问题，本发明人对之前开发的方法、特别是其中的色谱条件进行了优化，从而确定了酶解法且联合使用用于分析有机酸的离子交换柱的高效液相色谱法测定透明质酸含量的方法中，能够将柠檬酸和ΔDiHA分离的色谱条件，从而成功地得到了适合用于在含柠檬酸的物质中检测透明质酸含量的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
1.一种测定透明质酸含量的方法，其包括利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的柱温为60℃～95℃，特别是65℃。
2.根据项1所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为阳离子交换色谱柱。
3.根据项1或2所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。
4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为MCI GEL CK08EH色谱柱或SilGreen GH0830078H色谱柱。
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的流动相为弱酸溶液，优选为磷酸溶液或乙酸溶液，进一步优选浓度为0.01wt％～0.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液。
6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.4～0.6ml/min。
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的检测波长为205～235nm，例如为232nm。
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的进样量为10～100μL，优选为20～50μL。
9.根据项1～8中任一项所述的方法，其用于含柠檬酸的物质中透明质酸含量的测定，柠檬酸的含量高于0.1‰。
10.根据项9所述的方法，其中，所述含柠檬酸的物质为保健食品、药品、医疗器械、化妆品、毛发护理用品、口腔护理用品、纸制品。
发明的效果
本发明使用透明质酸酶对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到样品含量，方法特异性高。按照本发明的方法，能够防止用于糖的分析柱例如氨基柱的填料易水解、耐用性差，以及长期使用高盐流动相会对液相管路系统造成损伤的问题，能够更有效地检测透明质酸。
而且该方法能够避免柠檬酸的存在对透明质酸的干扰，适合于含柠檬酸的物质、特别是含柠檬酸配方的保健食品中的透明质酸含量检测。
附图说明
图1为实施例1的液相色谱图。
图2为参考例1的液相色谱图。
图3为参考例2的液相色谱图。
发明的具体实施方式
本文中的术语“酶解法”，是利用活性酶来水解特定的某种物质，这种方法可用于一般的生物实验中，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，本发明使用透明质酸酶可特异性裂解透明质酸钠双糖单位之间的糖苷键，终产物为带有一个双键的透明质酸钠二糖。在本发明中使用的透明质酸酶可以是任何现有技术中已知的能够裂解透明质酸钠双糖单位之间的糖苷键的酶，没有任何限制，可以购买市场上常用的用于降解透明质酸的酶来使用，但最优的酶为细菌来源的裂解酶，因为只有这样才可以将透明质酸彻底降解为带双键的二糖单位。市面上能买到的酶基本都是动物睾丸提取的透明质酸酶，最终降解产物是四糖和六糖的混合物，而且不易达到彻底降解效果。
色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
HPLC的固定相有以下几种：(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物；(2)其他氧化物表面涂渍聚合物；(3)无孔单分散填料；(4)有机高聚填料；(5)灌注色谱填料；(6)手性固定相填料。流动相是影响液相色谱的关键因素，高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液。
离子交换柱是指用来进行离子交换反应的柱状压力容器，离子交换反应是指离子交换剂功能基中的阳离子或阴离子与溶液中同性离子进行可逆交换的过程。离子交换剂分为有机和无机的离子交换剂。无机离子交换剂分为天然和例如合成沸石等人造的材料。有机离子交换剂中有离子交换树脂，离子交换树脂按照物理结构分类可以分为孔径为5nm的凝胶型和孔径为20-100nm的大孔型，按照合成的树脂所用原料单体分类可以分为苯乙烯系、酚醛系、丙烯酸系、环氧系、乙烯吡啶系等。离子交换树脂最常用的分类是依据树脂离子交换功能团分类，分为包括强酸性阳离子型离子交换树脂、弱酸性阳离子型离子交换树脂、强碱性阴离子型离子交换树脂和弱碱性的阴离子型离子交换树脂以及其他类型。
柠檬酸又称枸缘酸，化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸。根据其含水量的不同，分为一水柠檬酸和无水柠檬酸。柠檬酸的用途非常广泛,用于食品工业占生产量的75％以上,可做为食品的酸味剂、抗氧化剂、pH调节剂，用于清凉饮料、果酱、水果和糕点等食品中。用于医药工业占10％左右，主要用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等。用于化学工业等占15％左右，用作缓冲剂、络合剂、金属清洗剂、媒染剂、胶凝剂、调色剂等。在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中都有十分广阔。
以下将对本发明做以详细说明。
根据本发明的一个方面，提供测定透明质酸含量的方法，其包括利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的柱温为60℃～95℃。本发明使用透明质酸酶对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到样品含量，方法特异性高。另外，能够防止用于糖的分析柱例如氨基键合柱的填料易水解、耐用性差，以及长期使用高盐流动相会对液相管路系统造成损伤的问题，而且在该柱温下检测透明质酸，能够避免因柠檬酸的保留时间与ΔDiHA保留时间相近造成的柠檬酸对透明质酸的干扰。
在一个具体的实施方式中，上述用于分析有机酸的离子交换柱可以为阳离子交换色谱柱，特别可以为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子钙型交换柱。例如为MCI GEL CK08EH色谱柱(8×300mm，5μm)。MCI GEL CK08EH色谱柱是日本三菱化学生产的属于CK08E系列的阳离子交换色谱柱，是磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子氢型交换柱，可用于分离糖类、羧酸、聚醇等。此款色谱柱温度耐受范围较宽，温度越高，分离效果越好，但也要根据被分离物质的温度耐受性来选择。如没有特殊需求，一般采用比夏季最高室温稍高的40℃，易于控制柱效。另外，SilGreen GH0830078H色谱柱中固定相是8％交联度的磺化苯乙烯-二乙烯基苯树脂，常温下用稀酸作为流动相，不仅能够分离样品中的碳水化合物，而且能够分离有机酸和醇。通过使用这样的色谱柱，比以往的用于检测透明质酸的色谱柱的耐用性更强。
在一个具体的实施方式中，高效液相色谱的流动相为弱酸溶液，优选为磷酸溶液或乙酸溶液，进一步优选浓度为0.01wt％～0.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液，最优选为0.01wt％的磷酸溶液，在该条件能够将可以将透明质酸和柠檬酸更好地分开。在本发明中，由于高效液相色谱的流动相中不添加盐分，因此能够有效地防止长期使用高盐流动相会对液相管路系统造成损伤的问题。
在一个具体的实施方式中，流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.4～0.6ml/min。检测波长为205～235nm，例如为232nm，进样量为10～100μL，优选20～50μL在该条件下能够更加准确地测定透明质酸，排除柠檬酸的干扰。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法用于含柠檬酸的物质中透明质酸含量的测定。所检测的透明质酸的溶液中柠檬酸的含量高于0.1‰。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法用于含柠檬酸的保健食品中透明质酸含量的测定。保健食品又称为功能性食品，保健食品是指声称具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品，即适宜于特定人群食用，具有调节机体功能，不以治疗疾病为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或者慢性危害的食品。本发明的方法是针对保健食品中HA含量检测而开发的，在某些的保健食品配方中需要添加柠檬酸来调节产品的风味、酸度等指标，此外柠檬酸也具有一定的防腐作用。而本发明的方法能够避免配方中柠檬酸对HA二糖的色谱峰的干扰。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法用于含柠檬酸的药品或医疗器械中透明质酸含量的测定。透明质酸可作为药品或医疗器械的原料或辅料，用于眼用制剂、关节内制剂、术后防粘连剂、创伤愈合外用制剂及软组织填充剂等医药产品。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法用于含柠檬酸的化妆品中透明质酸含量的测定。化妆品是指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品。化妆品中的透明质酸具有持久保湿、润滑、防晒、增稠、稳定乳化作用、抗衰老，及晒后修复等作用。在有些化妆品配方中添加柠檬酸，可以防止和消除皮肤色素沉着，有助于角质的更新，提高皮肤抵御干燥的能力，能提高皮肤天然保湿能力，可以使皮肤真皮浅层的透明质酸含量增高，使皮肤角膜细胞和真皮浅层的含水量增多。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法用于含柠檬酸的毛发护理用品中透明质酸含量的测定。其中，根据适用对象不同，毛发护理用品又可分为宠物毛发护理用品和人类头发护理用品。根据产品功效不同，毛发护理用品又可包括防脱发用品、促进头发毛囊再生产品、毛发改善产品、烫发产品、染发产品以及毛发定型产品，具有保湿、抑菌、修复、防脱发、促进毛囊再生等作用。在有些毛发护理用品配方中添加柠檬酸，柠檬酸能中和头发中的碱性成分，从而起到护发作用。
在一个具体的实施方式中，本发明的方法用于含柠檬酸的口腔护理用品中透明质酸含量的测定。其中，口腔护理用品包括治疗口腔溃疡的组合物、种牙产品、洗牙用产品、缓解口腔干燥的产品、口腔清洁产品、唾液代用品等，具有清洁口腔、抑菌、抗炎、修复、保湿、增稠、诱导骨再生等作用。在某些口腔护理用品配方中添加柠檬酸，可以抑制牙结石的生长，溶解牙菌斑。
利用本发明的测定透明质酸含量的方法，使用用于分析有机酸的离子交换柱，且在特定的检测条件下检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸双糖，能够获得很好的透明质酸双糖和柠檬酸峰的分离度，避免柠檬酸的存在对透明质酸的干扰，而且能够利用不含盐的溶液将透明质酸双糖洗脱，能够减轻对液相管路系统造成的损伤，更长时间有效地检测透明质酸。利用本发明的方法，其中使用的色谱柱可以长期运行，也不会出现堵塞等情况，不需要经常对色谱柱等进行清洗，持续运行时间超过3600分钟。
实施例
以下利用实施例对本发明做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。在本发明中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。
实施例1
1试剂及材料
磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司)
透明质酸钠对照品(华熙福瑞达生物医药有限公司)、透明质酸酶(HAase)(华熙福瑞达生物医药有限公司，酶活约4000IU/mL)
2色谱条件
色谱柱：MCI GEL CK08EH色谱柱(三菱化学)(8×300mm，5μm)；流动相：0.01％磷酸；流速：0.4ml/min；进样量：20μL；柱温：65℃；检测波长：232nm，此条件为最优条件。下表1表示不同条件下HA二糖和柠檬酸的峰的分离度。
表1色谱条件筛选表
3溶液配制
酶解缓冲液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)27.4g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)8.8g置1000mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。上述缓冲液稀释40倍后得到酶解缓冲液(5mM/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH6.0)。
对照品溶液：精密称取透明质酸钠对照品约50mg于50mL容量瓶中，酶解缓冲液溶解并定容至刻度，混匀。取上述溶液0.1mL，加入1mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解3h，煮沸2min使酶失活转移入10mL容量瓶中以流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。
供试品溶液：精密量取供试品溶液0.5mL，加入酶解缓冲液适量调节pH至中性，加入1mL透明质酸酶，混匀，密封，42℃酶解3h，煮沸2min使酶失活后转移至10mL容量瓶中，流动相定容至刻度，0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。平行制备两份。
4测定
分别取对照品，供试品溶液20μL进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算供试品溶液中透明质酸钠含量。
5计算
按以下公式计算供试品溶液中的HA含量：
X＝As*Wr*Z*(1-h)/(Ar*125)
式中，X—供试品溶液中HA含量，mg/mL
As—供试品溶液峰面积
Ar—对照品溶液峰面积
Wr—对照品称样量，mg
Z—对照品含量
h—对照品干燥失重
另外，理论塔板数(N)是反映色谱柱的柱效参数，计算公式为：
N＝5.54×(保留时间/半峰宽)2
理论塔板数一般由色谱工作站数据处理软件自动计算给出。
6结果
供试品中HA含量检测结果如表2所示，另外色谱图如图1所示。图1中，其中出峰时间约为13.9min的物质为HA二糖，出峰时间约为13.2min的物质为微量的柠檬酸，两个色谱峰的分离度为1.5，达到基线分离，可见本发明的方法能够避免柠檬酸对HA检测的干扰。
表2实施例1中供试品的色谱分析结果
以上述条件持续对不同的待测样品进行检测，色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
实施例2
将实施例1中的色谱的流动相改变为流动相浓度0.05wt％磷酸溶液，流速变为0.3ml/min，进样量变为40μL，柱温变为70℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表3所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表3实施例2中供试品的色谱分析结果
实施例3
将实施例1中的色谱的流动相改变为流动相浓度0.1wt％磷酸溶液，流速变为0.6ml/min，进样量变为60μL，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表4所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表4实施例3中供试品的色谱分析结果
实施例4
将实施例1中的色谱的流动相改变为流动相浓度0.01wt％乙酸溶液，进样量变为80μL，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表5所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表5实施例4中供试品的色谱分析结果
实施例5
将实施例1中的色谱的流速改变为0.6ml/min，进样量变为100μl，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表6所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表6实施例5中供试品的色谱分析结果
实施例6
将实施例1中的色谱的柱温改变为60℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表7所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表7实施例6中供试品的色谱分析结果
实施例7
将实施例1中的色谱的检测波长改变为235nm，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表8所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表8实施例7中供试品的色谱分析结果
实施例8
将实施例1中的色谱柱改变为SilGreen GH0830078H，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表9所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表9实施例8中供试品的色谱分析结果
实施例9
将实施例1中的流动相改变为流动相浓度0.2wt％磷酸溶液，流速变为0.5ml/min，进样量变为50μL，柱温变为62℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表10所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表10实施例9中供试品的色谱分析结果
实施例10
将实施例1中的流动相改变为流动相浓度0.05wt％磷酸溶液，流速变为0.3ml/min，进样量变为40μL，柱温变为70℃，检测波长变为205nm，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表11所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表11实施例10中供试品的色谱分析结果
实施例11
将实施例1中的流动相改为0.1wt％乙酸溶液，进样量变为10μL，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表12所示。色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
表12实施例11中供试品的色谱分析结果
比较例1
将实施例1中的色谱柱改变为氨基柱，流动相：0.4mol/L NaH2PO4溶液，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量，而且色谱柱合计运行时间低于800分钟。供试品中HA含量检测结果如表13所示。
表13比较例1中供试品的色谱分析结果
比较例2
将实施例1中的柱温改变为50℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。
供试品中HA含量检测结果如表14所示，在此温度下色谱柱柱效明显降低，柠檬酸与不饱和透明质酸二糖的分离度明显降低，积分不准确，检测结果误差较大。
表14比较例2中供试品的色谱分析结果
比较例3
将实施例1中的柱温改变为100℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。
供试品中HA含量检测结果如表15所示，此条件下流动相接近沸腾状态，造成色谱系统里产生大量气体，检测无法进行。
表15比较例3中供试品的色谱分析结果
比较例4
将实施例1中的溶液改变为0.3wt％乙酸溶液，流速变为0.6ml/min，进样量变为80μL，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。供试品中HA含量检测结果如表16所示，在此流动相条件下，柠檬酸与不饱和透明质酸二糖的分离度差，积分不准确，检测结果误差较大。
表16比较例4中供试品的色谱分析结果
比较例5
将实施例1中的检测波长变为240nm，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。
供试品中HA含量检测结果如表17所示。在此波长下HA二糖吸收较弱，色谱峰面积小，检测结果误差较大。
表17比较例5中供试品的色谱分析结果
比较例6
将实施例1中的检测波长变为190nm，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。
供试品中HA含量检测结果如表18所示。在此波长下，为紫外末端吸收，基线不稳，误差较大。
表18比较例6中供试品的色谱分析结果
比较例7
将实施例1中的流速变为1.5ml/min，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中透明质酸钠含量。
供试品中HA含量检测结果如表19所示，HA二糖在此色谱条件下，流速过高，没有分离效果。
表19比较例7中供试品的色谱分析结果
参考例1
将实施例1中的供试品溶液改变为不含HA的空白样品溶液，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液的色谱图。结果如图2所示。
参考例2
将实施例1中的供试品溶液改变为HA二糖的对照样品溶液，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液的色谱图。结果如图3所示。
由上表可知，本发明的测定透明质酸含量的方法，能够避免柠檬酸的存在对透明质酸的干扰，而且能够在低浓度的缓冲盐才可将透明质酸双糖洗脱，能够减轻对液相管路系统造成的损伤，更长时间有效地检测透明质酸。
而比较例1由于没有使用用于分析有机酸的离子交换柱，因此色谱柱合计运行时间短，无法长时间有效地检测透明质酸。比较例2的柱温过低，色谱柱柱效明显降低，检测结果误差较大，比较例3的柱温过高而无法检测。比较例4的乙酸溶液浓度过大，无法有效分离透明质酸双糖和柠檬酸的峰。比较例5和比较例6的检测波长不合适，检测误差较大。比较例7的流速过高，没有分离效果。
而与这些比较例相对，在实施例的液相色谱条件下能够有效分离透明质酸双糖和柠檬酸的峰，长时间有效地检测透明质酸。尽管对本发明的实施方案和具体实施例进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (10)

1.一种测定透明质酸含量的方法，其包括：
利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；
使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及
基于检测结果计算透明质酸的含量，
其中，高效液相色谱中使用的色谱柱的柱温保持在60℃～95℃的范围。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换柱为阳离子交换色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述用于分析有机酸的离子交换柱为MCI GEL CK08EH色谱柱或SilGreen GH0830078H色谱柱。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，高效液相色谱的流动相为弱酸溶液，优选为磷酸溶液或乙酸溶液，进一步优选浓度为0.01wt％～0.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，流动相的流速为0.3～1.0ml/min，优选为0.4～0.6ml/min。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在高效液相色谱中检测波长为205～235nm。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，在高效液相色谱中分析时样品的进样量为10～100μL，优选20～50μL。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其用于含柠檬酸的物质中透明质酸含量的测定，所检测的透明质酸的溶液中柠檬酸的含量高于0.1‰。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述含柠檬酸的物质为保健食品、药品、医疗器械、化妆品、毛发护理用品、口腔护理用品、纸制品。
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