CN110389192A - 一种测定羧甲基壳聚糖中二甘醇酸残留量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定样品中二甘醇酸残留量的高效液相色谱方法，其包括：用流动相溶解待测样品；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相过柱检测；基于检测结果计算待测样品中二甘醇酸的含量。

Description

一种测定羧甲基壳聚糖中二甘醇酸残留量的方法
技术领域
本发明涉及羧甲基壳聚糖的检测领域；具体涉及一种利用高效液相色谱(HPLC)测定羧甲基壳聚糖中二甘醇酸残留量的方法。
背景技术
壳聚糖(chitosan，CTS)是由甲壳素(chitin)经脱乙酰基后得到的一种天然高分子氨基多糖，具有生物相容性良好，无免疫原性、无毒无味，可生物降解等特点，但其溶解性(可以溶于酸性溶液、且不稳定，不能直接溶于水，也不溶于一般的有机溶剂)在很大程度上限制了其应用。根据CTS分子内的-OH和-NH2易于进行化学修饰的特点引入功能性基团，增加其溶解性和功能性以拓宽其应用范围，是壳聚糖应用开发的主要方向之一。
羧甲基壳聚糖是近年来研究得较多的壳聚糖衍生物之一，其水溶性良好，并具有抗菌抗病毒、防辐射、提高肝脏抗氧化能力、降血糖、抗凝血等活性，在化妆品、保鲜、医药等方面有多种应用。目前，常用的羧甲基壳聚糖制备工艺需要在碱性条件下将氯乙酸与壳聚糖反应，最终得到羧甲基壳聚糖。在此过程中，氯乙酸自身会反应生成少量的二甘醇酸(DGA)。查阅毒理数据库显示DGA具有刺激性、食入毒性和细胞毒性。医药级壳聚糖类产品会直接与体液及血液接触，存在潜在危害性，因此需要对羧甲基壳聚糖中的DGA残留量进行控制。
按照YY 0953-2015《医用羧甲基壳聚糖》行业标准要求，需要对羧甲基壳聚糖中的二甘醇酸残留量进行控制，限度为不超过0.1％。针对二甘醇酸残留量的检测方法，上述行业标准给出了第一法离子色谱法和第二法高效液相色谱法，离子色谱法需要专门配备离子色谱仪，第二法高效液相色谱法采用C18色谱柱，样品需要经过70％甲醇提取、超声、离心、过滤等前处理步骤，操作复杂，需使用毒性有机试剂，且操作不当易影响方法回收率。另外，该方法流动相中需要添加高比例的缓冲液，长期使用含缓冲盐流动相会对液相管路系统造成损伤。
现有技术文献
行业标准：YY 0953-2015《医用羧甲基壳聚糖》。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了：
1.一种测定样品中二甘醇酸残留量的高效液相色谱方法，其包括：
-用流动相溶解待测样品；
-利用不含盐的流动相，使用用于分析有机酸的离子交换柱对用流动相溶解的待测样品进行检测；
-基于检测结果计算待测样品中二甘醇酸的含量。
2.根据项1所述的方法，其中，所述离子交换柱为阳离子交换柱。
3.根据项2所述的方法，其中，所述阳离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。
4.根据项3所述的方法，其中，所述强阳离子H+型交换柱为MCI GEL CK08EH色谱柱或SilGreen GH0830078H色谱柱。
5.根据项1所述的方法，其中，所述流动相为酸溶液。
6.根据项5所述的方法，其中，所述酸溶液为磷酸溶液或乙酸溶液，优选浓度为0.01wt％～1.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液。
7.根据项1所述的方法，其中，在进行检测时，所述流动相的流速为0.3～1.0ml/min，进一步优选为0.4～0.8ml/min。
8.根据项1所述的方法，其中，所述离子交换柱的柱温为25℃～95℃，优选为30℃～80℃，更进一步优选为40℃～60℃。
9.根据项1所述的方法，其中，在利用高效液相色谱法进行检测时的检测波长为190～220nm。
10.根据项1所述的方法，其中，所述离子交换柱的进样量为5～20μL。
11.根据项10所述的方法，其中，所述高效液相色谱法使用外标法进样并计算二甘醇酸含量。
12.根据前述项的任一项所述的高效液相色谱方法的用途，用于测定羧甲基壳聚糖中的二甘醇酸残留。
发明的效果
本发明采用直接溶解法对样品进行预处理，并结合液相色谱分离技术得到待测样品中杂质残留量，方法可操作性强、耐用性好。
按照本发明的方法，能够避免操作中有毒性试剂的使用以及复杂的前处理对方法准确度的影响，并防止含盐流动相会对液相管路系统造成损伤的问题，能够更有效稳定的检测羧甲基壳聚糖中DGA的残留量。
附图说明
图1、图2、图3为实施例1的液相色谱图，其中，
图1为空白溶剂的图谱(对照1)；
图2为DGA对照品的图谱(对照2)；
图3为待测样品的图谱。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明在第一方面提供了一种测定样品中二甘醇酸残留量的高效液相色谱方法，其包括：
-用流动相溶解待测样品；
-利用不含盐的流动相，使用用于分析有机酸的离子交换柱对用流动相溶解待的测样品进行检测；
-基于检测结果计算待测样品中二甘醇酸的含量。
在本说明书的上下文中，色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。离子色谱法是高效液相色谱法的一种，适合于溶液中阴阳离子浓度的检测，灵敏度高，重现性好。离子色谱仪与普通高效液相色谱仪的区别在于前者使用的色谱柱填料具有更高的交联度和更低的交换容量，管路阀芯均要求耐腐蚀，且检测器通常为电导型。
HPLC的固定相有以下几种：(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物；(2)其他氧化物表面涂渍聚合物；(3)无孔单分散填料；(4)有机高聚填料；(5)灌注色谱填料和(6)手性固定相填料。流动相是影响液相色谱的关键因素，高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液。
离子交换柱是指用来进行离子交换反应的柱状压力容器，离子交换反应是指离子交换剂功能基中的阳离子或阴离子与溶液中同性离子进行可逆交换的过程。离子交换剂分为有机和无机的离子交换剂。无机离子交换剂分为天然和例如合成沸石等人造的材料。有机离子交换剂中有离子交换树脂，离子交换树脂按照物理结构分类可以分为孔径为5nm的凝胶型和孔径为20-100nm的大孔型，按照合成的树脂所用原料单体分类可以分为苯乙烯系、酚醛系、丙烯酸系、环氧系、乙烯吡啶系等。离子交换树脂最常用的分类是依据树脂离子交换功能团分类，分为包括强酸性阳离子型离子交换树脂、弱酸性阳离子型离子交换树脂、强碱性阴离子型离子交换树脂和弱碱性的阴离子型离子交换树脂以及其他类型。
在一个具体的实施方式中，所述离子交换柱为阳离子交换柱。
在又一具体的实施方式中，所述阳离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。
在再一具体的实施方式中，所述强阳离子H+型交换柱为MCI GEL CK08EH色谱柱或SilGreen GH0830078H色谱柱。
MCI GEL CK08EH色谱柱是日本三菱化学生产的属于CK08E系列的阳离子交换色谱柱，是磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子氢型交换柱，可用于分离糖类、羧酸、聚醇等。另外，SilGreen GH0830078H色谱柱中固定相是8％交联度的磺化苯乙烯-二乙烯基苯树脂，常温下用稀酸作为流动相，不仅能够分离样品中的碳水化合物，而且能够分离有机酸和醇。使用这样的色谱柱，比以往的用于检测二甘醇酸的色谱柱的耐用性更强。
在一个具体的实施方式中，所述流动相为酸溶液。
在本说明书的上下文中，流动相是指在色谱过程中携带待测组分向前移动的物质，其为与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。用作流动相的物质有：气体、液体、超临界流体等。常见的流动相主要有：乙腈-水溶液、乙腈-醋酸水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-磷酸水溶液等。
在又一具体的实施方式中，所述酸溶液为磷酸溶液或乙酸溶液，优选浓度为0.01wt％～1.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液。
在再一具体的实施方式中，在进行检测时，所述流动相的流速为0.3～1.0ml/min，进一步优选为0.4～0.8ml/min。
一般地，流动相的流速增大，会导致柱压增大，分离度减小，色谱峰的半峰宽变窄，同时保留时间会前移。在HPLC方法开发中，需要将流速与其他参数(如柱温)综合考虑，以达到比较理想的分离度和速度。
在一个具体的实施方式中，所述离子交换柱的柱温为25℃～95℃，优选为30℃～80℃，更进一步优选为40℃～60℃。
一般地，柱温会提高柱效，增加分离度，使出峰时间提前；但是，还需考虑色谱柱的承受范围，以及检测成分是否会降解。在HPLC方法开发中，需要将柱温与其他参数(如流动相流速)综合考虑，以达到比较理想的分离度和速度。
在一个具体的实施方式中，在利用高效液相色谱法进行检测时的检测波长为190～220nm。
一般地，对于单种物质，选择该物质的最大吸收波长。如果是同时检测多种成分物质，则要参考该多种物质的最大吸收波长，以此选择一个合适的波长，使得该多种物质的检测限和灵敏度都能达到一个合适的要求。
在一个具体的实施方式中，所述离子交换柱的进样量控制为5～20μL，且使用外标法计算二甘醇酸含量。
一般地，如果使用外标法进行定量分析，需要精密进样，所以在此需对进样量作出详细规定。一般地，进样量过高会使色谱柱出现过载现象，在色谱图中表现为平头峰，甚至会覆盖主峰后面的色谱峰。而进样量过少，则会导致方法灵敏度下降。
本发明的第二方面涉及前述高效液相色谱方法的用途，用于测定羧甲基壳聚糖中的二甘醇酸(DGA)残留。
利用本发明的测定DGA含量的方法，使用用于分析有机酸的离子交换柱，能够利用不含盐的缓冲溶液进行洗脱，能够减轻对液相管路系统造成的损伤，更长时间有效地检测DGA。利用本发明的方法，其中使用的色谱柱可以长期运行，也不会出现堵塞等情况，不需要经常对色谱柱等进行清洗，持续运行时间超过3600分钟。
实施例1
1试剂及材料
DGA对照品(阿拉丁试剂)、磷酸(国药集团)
2色谱条件
色谱柱：MCI GEL CK08EH色谱柱(三菱化学，8×300mm，5μm)；
流动相：1％磷酸溶液；
流速：0.6ml/min；
进样量：20μL；柱温：40℃；
检测波长：210nm。
色谱条件的说明：
其中，流动相、流速、柱温均为色谱柱使用说明推荐参数，进样量为常用值。检测波长为二甘醇酸的紫外末端吸收波长。
3溶液配制
对照品溶液：精密称取DGA对照品约10mg于10mL容量瓶中，流动相溶解并定容至刻度，混匀，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。
供试品(也可以称为待测样品)溶液：精密称取供试品0.5g于50mL容量瓶中，加入30mL流动相使之溶解并定容，混匀，0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
4测定
分别取对照品，供试品溶液20μL进样，按照上述色谱条件进行检测，以外标法峰面积计算供试品溶液中DGA残留量。
5计算
按以下公式计算供试品溶液中的DGA含量：
式中，X—供试品溶液中DGA含量，％
As—供试品溶液峰面积
Ar—对照品溶液峰面积
C—对照品溶液浓度，mg/mL
Ws—供试品称样量，mg
6结果
供试品中DGA残留量检测结果如表1所示。色谱图如图1～3所示。
表1实施例1中供试品的色谱分析结果(图谱如图3所示)
以上述条件持续对不同的待测样品进行检测，色谱柱合计运行时间超过3600分钟，色谱柱仍然正常运行。
实施例1的对照1(图谱如图1所示)
将实施例1中的供试品溶液改变为不含DGA的空白样品溶液，其他条件与实施例1相同，测定该空白溶剂的色谱图，示于图1。
实施例1的对照2(图谱如图2所示)
将实施例1中的供试品溶液改变为DGA的对照样品溶液，其他条件与实施例1相同，测定该对照品溶液的色谱图。结果如图2所示。
实施例2
将实施例1中的色谱的流动相改变为0.5wt％磷酸溶液，将流速改变为0.4ml/min等，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表2所示。
表2实施例2中供试品的色谱分析结果
实施例3
将实施例1中的色谱的流动相改变为0.01％乙酸溶液，将柱温改为95℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表3所示。
表3实施例3中供试品的色谱分析结果
实施例4
将流速改变为0.5ml/min，将柱温改为25℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表4所示。
表4实施例4中供试品的色谱分析结果
实施例5
将流速改变为0.3ml/min，柱温改变为45℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表5所示。
表5实施例5中供试品的色谱分析结果
实施例6
将流速改变为1.0ml/min，将实施例1中的色谱的检测波长改变为190nm，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表6所示。
表6实施例6中供试品的色谱分析结果
实施例7
将实施例1中的色谱柱改变为SilGreen GH0830078H色谱柱，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表7所示。
表7实施例7中供试品的色谱分析结果
实施例8
将实施例1中的色谱的进样量改变为5μL，将实施例1中的色谱的检测波长改变为210nm，色谱柱温度设置为60℃其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表8所示。
表8实施例8中供试品的色谱分析结果
比较例1
在实施例1中的色谱的流动相中添加0.15wt％的磷酸二氢钠，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表9所示。
表9比较例1中供试品的色谱分析结果
比较例2
将实施例1中的色谱的流动相改变为1.6wt％磷酸溶液，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表10所示。
在此条件下，因流动相中的磷酸粘度较大，色谱柱柱压接近使用上限，经常使用将会缩短色谱柱使用寿命。
表10比较例2中供试品的色谱分析结果
比较例3
将实施例1中的色谱的流动相改变为水，流速变为1.5ml/min，进样量变为10μL，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表11所示。
在此色谱条件下，二甘醇酸无法洗脱，对照品溶液及供试品溶液均没有色谱峰。
表11比较例3中供试品的色谱分析结果
比较例4
将实施例1中的色谱的柱温改变为100℃，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。此条件下流动相接近沸腾状态，造成色谱系统里产生大量气体，检测无法进行。
比较例5
将实施例1中的色谱的检测波长改变为230nm，其他条件与实施例1相同，测定供试品溶液中DGA含量。供试品中DGA残留量检测结果如表12所示。
在此波长下DGA吸收较弱，供试品检测不到残留量。
表12比较例5中供试品的色谱分析结果
表13实施例的运行效果比较
表14比较例的运行效果
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (10)

1.一种测定样品中二甘醇酸残留量的高效液相色谱方法，其包括：
-用流动相溶解待测样品；
-利用不含盐的流动相，使用用于分析有机酸的离子交换柱对用流动相溶解的待测样品进行检测；
-基于检测结果计算待测样品中二甘醇酸的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换柱为阳离子交换柱。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述阳离子交换柱为磺化交联的苯乙烯二乙烯基苯共聚物为填充剂的强阳离子H+型交换柱。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述强阳离子H+型交换柱为MCI GEL CK08EH色谱柱或SilGreen GH0830078H色谱柱。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述流动相为酸溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述酸溶液为磷酸溶液或乙酸溶液，优选浓度为0.01wt％～1.2wt％的磷酸溶液或乙酸溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，在进行检测时，所述流动相的流速为0.3～1.0ml/min，进一步优选为0.4～0.8ml/min。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换柱的柱温为25℃～95℃，优选为30℃～80℃，更进一步优选为40℃～60℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在利用高效液相色谱法进行检测时的检测波长为190～220nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换柱的进样量为5～20μL。
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