KR20160062024A - 갈락토올리고당의 검출·정량 방법 - Google Patents

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Abstract

갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료로부터, 간이하면서 또한 저비용으로 4'-GL을 분리하고, 4'-GL 및 갈락토올리고당을 정확하게 정량하는 방법을 제공한다. 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료 중의 갈락토올리고당을 검출·정량하는 방법으로서, 상기 시료를 유도체화 시약과 반응시키고, 시료 중의 덱스트린 및 갈락토올리고당을 유도체화하고, 이어서 C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 고속 액체크로마토그래피에 의해 상기 시료 중의 갈락토올리고당 성분을 분리하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.

Description

갈락토올리고당의 검출·정량 방법{METHOD FOR DETECTING AND DETERMINING QUANTITY OF GALACTO-OLIGOSACCHARIDES}
본 발명은 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료 중의 갈락토올리고당을 검출·정량하는 방법에 관한 것이다.
갈락토올리고당은 갈락토오스를 주성분으로 하는 결합 양식이 다른 올리고당의 혼합물이고, 일반적으로는 유당에 β-갈락토시다아제에 의한 전이 반응을 행함으로써 제조된다. 갈락토올리고당은 그 생리 효과로서, 장에 생식하고 있는 비피더스균을 증가시켜, 장내 환경을 조절하는 효과나, 장간막 지방의 저감을 통해 생활 습관병 예방에 이바지하는 등의 효과가 보고되고 있고, 특정 보건용 식품이나 각종 기능성 식품 또는 그들의 소재로서, 이전부터 중보되고 있다. 특정 보건용 식품 등의 성분으로서 갈락토올리고당을 사용하는 경우에는 그 품질, 규격의 보증이나 기능성 성분으로서의 정량 분석 데이터의 표시 등 때문에, 정확성이 높은 정량법을 확립하는 것이 요구된다.
음식품 중의 갈락토올리고당을 정량하는 방법에는 갈락토올리고당에 β-갈락토시다아제를 작용시키고, 효소 분해에 의해 생기는 갈락토오스를 정량하고, 올리고당을 산출하는 방법이 있다(비특허문헌 1). 그러나, 생성하는 갈락토오스의 검출에는 고가의 펄스형 전기 화학 검출기를 장착한 음이온 교환 고속 액체 크로마토그래피를 사용할 필요가 있고, 범용성이 낮다고 하는 문제가 있다. 또한, 음식품 중에 유당 등의 영양 성분이 포함되어 있는 경우, 효소 처리에 의해 생긴 갈락토오스와 유당으로부터 유리된 갈락토오스를 판별할 수 없고, 결과적으로 갈락토올리고당의 정량의 정밀도가 저하해버린다.
갈락토올리고당 중의 특징적인 성분, 예를 들면 4'-갈락토실락토오스(4'-GL; Galβ1-4Galβ1-4Glc)를 정량하고, 그 양으로부터 역산하고, 갈락토올리고당의 전량을 산출하는 방법도 존재하고 있다. 이 방법은 사용하는 갈락토올리고당 중의 4'-GL의 함유량이 판명되어 있고, 그 함유량이 로트차 등 없이 안정하게 하고 있는 경우에, 특히 유효하다. 음식품 시료 중의 4'-GL을 정량하는 방법으로서는 종래는 주로 겔여과 크로마토그래피에 의해, 음식품 중의 다른 성분과 4'-GL을 분자의 사이즈에 의해 분리하는 방법이 사용되고 있다.
그러나, 갈락토올리고당은 상기한 바와 같이, 기능성의 소재로서, 영양 성분이 풍부한 음식품, 예를 들면 육아용 조제 분유나 발효 유제품 등에 사용되는 경우가 많고, 그 음식품 중에는 4'-GL과 분자의 크기가 동등한 당질원이 포함되는 경우도 많기 때문에, 겔여과 크로마토그래피에서는 그들 당질원과 4'-GL을 분리할 수는 없다. 예를 들면, 덱스트린에 포함되는 당류의 일종인 말토트리오스를 포함하는 음식품 중의 4'-GL을 겔여과 크로마토그래피로 분리·정량하고자 한 경우, 말토트리오스와 4'-GL은 분자 사이즈가 동일한 점에서, 컬럼으로부터 용출 후의 양자의 피크가 중복되므로, 4'-GL의 정량, 즉 갈락토올리고당의 정량에 지장을 초래한다.
올리고당을 역상 크로마토그래피로 검출하는 방법으로서, C8 또는 C18 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1). 그러나, 이들의 컬럼을 사용해서 음식품 중의 갈락토올리고당의 분리를 시험한 경우, 음식품의 다른 성분과 갈락토올리고당 성분을 분리할 수 없다.
일본특허공표 2007-523352호 공보
Journal of AOAC International, Volume 85, Number 2, March 2002, pp. 417-423(7)
따라서, 본 발명은 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료로부터, 간이하면서, 또한 저비용으로 4'-GL을 분리하고, 4'-GL 및 갈락토올리고당을 정확하게 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료를 유도체화 시약과 반응시키고, 상기 시료 중의 덱스트린 및 갈락토올리고당을 유도체화하고, 이어서 C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 고속 액체크로마토그래피에 제공함으로써 상기 시료 중의 갈락토올리고당 성분을 충분하게 분리할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료 중의 갈락토올리고당을 검출·정량하는 방법이고, 상기 시료를 유도체화 시약과 반응시키고, 시료 중의 덱스트린 및 갈락토올리고당을 유도체화하고, 이어서 C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 고속 액체크로마토그래피에 의해 상기 시료 중의 갈락토올리고당 성분을 분리하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 검출·정량 방법에 의하면, 시료 중의 갈락토올리고당과 다른 성분을 간이하고, 저비용으로 분리하고, 정확하게 갈락토올리고당의 정량을 행할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여, 음식품 등의 갈락토올리고당을 검출·정량함으로써 상기 음식품 등에 포함되는 갈락토올리고당의 양을 정확하게 관리하고, 품질 보증할 수 있음과 아울러, 각종 유효성 시험 데이터의 취득, 표시 등을 정확하게 행하는 것이 가능해진다.
도 1은 겔여과 컬럼을 사용한 HPLC의 크로마토그램이다.
도 2는 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30)이다.
도 3은 PMP 유도체-역상 HPLC 크로마토그램(C18 역상 컬럼)이다.
도 4는 PMP 유도체-역상 HPLC 크로마토그램(C8 역상 컬럼)이다.
도 5는 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30), 인산 칼륨 완충액(pH4)/CH3CN(78/22)이다.
도 6은 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30), 인산 칼륨 완충액(pH5)/CH3CN(79/21)이다.
도 7은 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30), 인산 칼륨 완충액(pH7)/CH3CN(81/19)이다.
도 8은 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30), 인산 칼륨 완충액(pH7)/CH3CN(82/18)이다.
도 9는 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30), 인산 칼륨 완충액(pH8)/CH3CN(82/18)이다.
도 10은 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30), 인산 칼륨 완충액(pH8)/CH3CN(83/17)이다.
도 11은 PMP 유도체 역상 HPLC 크로마토그램(C30)이다.
본 발명의 검출·정량 방법은 음식품 등의 시료 중에 포함되는 갈락토올리고당을 유도체화한 후, C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 고속 액체크로마토그래피(HPLC)에 제공하고, 시료 중의 다른 성분과 갈락토올리고당을 분리, 정량하는 것이다. 갈락토올리고당은 일반식: Gal-(Gal)n-Glc(단, 식 중 Gal은 갈락토오스 잔기, Glc는 글루코오스 잔기, n은 0∼4의 정수)으로 나타내어지는 분자내에 갈락토오스를 1분자 이상 포함하는 2∼6당의 혼합물이다. 단, 유당은 갈락토올리고당에는 포함되지 않는다.
갈락토올리고당의 주성분은 유당의 비환원 말단에 갈락토오스가 하나 결합한 3당의 4'-갈락토실락토오스(4'-GL)이다. 그 밖의 구체적인 성분으로서는 Galβ1-3Glc, Galβ1-2Glc, Galβ1-6Glc, Galβ1-6Galβ1-4Glc, Galβ1-6Galβ1-4Galβ1-4Glc, Galβ1-4Galβ1-4Galβ1-4Glc 등이 열거된다. 본 발명의 검출·정량 방법에서는 갈락토올리고당을 혼합물로서 검출·정량해도 좋고, 각각의 갈락토올리고당 성분을 검출·정량해도 좋지만, 4'-GL을 대상으로서 분리한 후, 검출·정량하고, 그 양으로부터 역산하고, 갈락토올리고당의 전량을 산출하는 것이 정량의 정밀도의 점으로부터 바람직하다.
갈락토올리고당은 어떠한 방법으로 얻어진 것이어도 되고, 예를 들면 유당을 원료로서, 유당 분해 효소(β-갈락토시다아제)에 의한 전이 반응을 이용해서 생산된 것을 사용할 수 있다. 전이 반응에서는 원료에 효소를 생산하는 미생물을 작용시켜도 좋다. 유당을 포함하는 원료로서는 예를 들면, 시판의 유당, 유즙, 분유, 치즈 훼이(cheese whey) 등이 열거된다. 사용하는 효소는 갈락토올리고당을 얻을 수 있는 효소이면 특별하게 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 원료 중의 유당을 가수 분해하고, 분해에 의해 생긴 갈락토오스를 유당이나 글루코오스에 전이시킬 수 있는 효소, 구체적으로는 β-갈락토시다아제나 α-갈락토시다아제가 열거된다. 이들의 효소는 단독으로 또는 2종 이상을 조합시켜서 사용할 수 있다. 효소 처리 조건은 특별하게 한정되지 않고, 일반적으로는 원료 농도는 10∼70%, pH는 3∼8, 효소 농도는 0.01∼100units/ml, 온도는 20∼70℃, 반응 시간은 2시간∼3일간이 적당하다. 또한, 시판의 갈락토올리고당 액당을 사용할 수도 있고, 예를 들면 올리고메이트 55N(Yakult Pharmaceutical Industry)을 들 수 있다. 또한, 갈락토올리고당을 포함하는 천연물로부터 정법에 의해 단리, 정제한 것을 사용할 수도 있다. 갈락토올리고당을 포함하는 천연물의 종류는 하등 한정되지 않고, 예를 들면 포유 동물의 유즙이 열거된다.
본 발명에 있어서, 갈락토올리고당의 검출·정량의 대상이 되는 시료는 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 특정 보건용 식품, 기능성 식품, 건강 식품, 영양 보조 식품, 유아용, 어린이용, 임산부용, 환자용 특별 용도 식품, 연하 곤란자용 식품, 육아용 조제 분유 등의 음식품이나 그들의 소재 또는 의약품 등이 열거된다. 그 중에서도 당질 성분이 많이 포함되는 육아용 조제 분유에 본 발명의 방법을 적용한 경우에, 고정밀도로 갈락토올리고당의 검출·정량을 할 수 있어 바람직하다. 덱스트린이란 3분자 이상의 글루코오스가 중합한 물질의 총칭이다. 또한, 덱스트린의 일종으로서 말토덱스트린이 있고, 말토덱스트린이란 α-1,4 결합에 의해 D-글루코오스가 중합한 중합체이고, 덱스트로스 당량이 20미만이고, 전분의 가수 분해에 의해 얻어지는 것이다.
말토덱스트린에는 3분자의 글루코오스로 이루어지는 말토트리오스나, 4분자의 글루코오스가 중합한 4당, 또는 그 이상의 글루코오스가 중합한 다당류를 포함한다. 말토트리오스는 3분자의 글루코오스가 중합한 것으로, 4'-GL과 분자량과 분자 사이즈가 동일하고, 일부의 히드록실기의 입체 구조가 다르다. 음식품 등의 시료 중에, 이러한 4'-GL과 같은 크기의 분자가 존재하고 있는 경우, 겔여과 크로마토그래피 등의 종래법에서는 4'-GL과 말토트리오스 등을 분리하고, 갈락토올리고당을 정량할 수 없었지만, 본 발명의 방법에 의하면, 양자를 충분하게 분리하는 것이 가능해진다. 덱스트로스 당량이란 시료 중의 환원당을 글루코오스로서 나타내고, 고형분에 대한 백분률로서 구해지는 값이다. 덱스트로스 당량의 최대는 100이고, 고형분의 전부가 글루코오스인 것을 의미한다. 덱스트로스 당량은 전분으로부터의 가수 분해율을 나타내는 지표이고, 덱스트로스 당량이 작은, 즉 가수분해율이 작은 덱스트린에는 다당 성분이 많이 포함된다. 한편, 덱스트로스 당량이 큰, 즉 가수분해율이 큰 덱스트린에는 소당류가 많이 포함된다.
본 발명의 검출·정량 방법에서는 우선 시료에 유도체화 시약을 반응시키고, 시료 중의 당질을 유도체화한다. 유도체화 시약은 갈락토올리고당을 유도체화할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 자외, 가시흡수 또는 형광 검출이 가능한 소수성의 유도체가 열거되고, 구체적으로는 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론(PMP), 2-아미노피리딘, 2-아미노벤즈아미드, 3-아미노퀴논, 4-아미노벤조산에틸, 4-아미노벤조산부틸, 4-트리메틸암모늄아닐린이 열거되고, 이들에서 선택되는 1종을 사용할 수 있다. 그 중에서도, PMP을 사용하는 것이 갈락토올리고당 성분의 분리를 충분하게 행하기 위해서는 바람직하다.
유도체화는 예를 들면, PMP에 의한 유도체화이면, 시료에 0.5M의 PMP의 메탄올 용액과 0.6M의 NaOH 용액을 가하고, 70℃에서 30분간 반응시키고, 반응액에 0.1M 염산과 클로로포름을 첨가하고, 교반 후, 하층의 클로로포름을 제거함으로써 행할 수 있다. 갈락토올리고당 등의 당질은 친수성이지만, 소수성의 유도체화 시약으로 유도체화된 것에 의해, 그 유도체화 부분이 소수성이 되기 때문에, 고정상에 알킬기를 포함하는 고속 액체크로마토그래피용 컬럼에 제공한 경우, 친수성의 성분에 비하여, 장시간 컬럼내에 유지되는 것이 된다.
유도체화 처리 후의 시료는 고속 액체크로마토그래피에 제공하고, 시료 중의 갈락토올리고당 성분을 분리한다. 본 발명에 있어서, 고속 액체크로마토그래피에 사용하는 컬럼에는 C30 역상 크로마토그래피용 컬럼, 즉, 고정상에 탄소수 30개의 알킬기(트리아콘틸기)를 포함하는 컬럼을 사용한다. 시료 중의 갈락토올리고당을 충분하게 분리하기 위해서는 탄소수 30개의 컬럼을 사용하는 것이 필요하기 때문이다. 보다 구체적으로는 Develosil RPAQUEOUS(Nomura Chemical), Develosil C30-UG(Nomura Chemical), Inertosil C30 S-Select(GL Sciences)가 열거된다. 이들 중에서도 이중 결합이 있는 시스형의 알킬기를 갖는 고정상을 구비하는 것이 갈락토올리고당의 분리능의 점으로부터 바람직하고, 구체적으로는 Develosil RPAQUEOUS(Nomura Chemical)가 바람직하다. C30 역상 크로마토그래피용 컬럼이 갈락토올리고당 성분의 분리에 바람직한 이유는 알킬기의 길이와 그 입체 구조가 갈락토올리고당과 말토트리오스 등의 유지 시간의 변화에 기여하고 있는 것이라 생각된다.
고속 액체크로마토그래피의 이동상에 사용하는 용출액은 컬럼이나 장치에 악영향을 주지 않는 것이면 특별히 제한없이 사용할 수 있고, 예를 들면 물만으로 이루어지는 용출액, 완충액만으로 이루어지는 용출액, 물 또는 완충액과 극성의 유기용매의 혼합액을 들 수 있고, 특히 완충액과 극성의 유기용매의 혼합액을 사용하는 것이 바람직하다. 완충액과 극성의 유기용매의 혼합비(vol/vol, 이하, 모든 혼합비의 단위는 vol/vol로 한다)는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 완충액/극성의 유기용매=79/21∼80/20이 바람직하다. 이들의 용출액을 사용함으로써 갈락토올리고당의 분리가 충분하게 되어, 양호한 크로마토그램을 얻을 수 있기 때문이다. 또한, 같은 이유로부터, 완충액의 pH는 pH4∼8이 바람직하고, 특히 pH5∼6이 바람직하다.
또한, 완충액으로서 인산 칼륨 완충액, 시트르산 칼륨 완충액, 포름산 암모늄 완충액 및 아세트산 칼륨 완충액에서 선택되는 적어도 1종과, 극성의 유기용매로서 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올에서 선택되는 적어도 1종을 포함하는 혼합액을 사용하는 것이 바람직하고, 특히, 인산 칼륨 완충액과 아세토니트릴의 혼합액을 사용하는 것이 바람직하고, 인산 칼륨 완충액의 pH는 5∼6이 바람직하고, 인산 칼륨 완충액과 아세토니트릴의 혼합비는 인산 칼륨 완충액/아세토니트릴=79/21∼80/20이 바람직하다.
고속 액체크로마토그래피는 시판의 HPLC 장치를 이용하여 행할 수 있고, 컬럼의 평형화나 유속 등의 각종 조건은 시료의 용량 등에 기초하여 적당하게 설정하면 된다. 고속 액체크로마토그래피를 행한 후, 얻어진 획분은 각종의 검출기를 이용하여 검출·정량할 수 있다. 예를 들면, 자외 흡광도 검출기, 가시 흡광도 검출기 등의 흡광도 검출기나, 각종 선광도 검출기, 형광 검출기 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 자외 흡광도 검출기를 사용하면 간편하고 정량의 정밀도도 높다.
시료 중의 갈락토올리고당의 검출·정량 방법으로서는 예를 들면, 다음 수단이 열거된다. 우선, 4'-GL 함량이 판명되어 있는 갈락토올리고당을 포함하는 시료에 물 등의 용매를 가해서 용해한 후, 내부 표준 물질을 적량 가하고, 시료 용액을 조제한다. 별도, 동일한 갈락토올리고당과 내부 표준 물질울 물 등에 용해하고, 표준 시험액을 조제한다. 표준 시험액은 단계 희석하고, 예를 들면 10, 20, 40배 희석한 것을 준비한다. 이어서, 시료 용액과 표준 시험액을 PMP 등의 유도체화 시약으로 유도체화한다. 유도체화 후의 시료 용액과 표준 시험액은 각각 고속 액체크로마토그래피에 제공하고, 검출기에 의해 크로마토그램을 얻는다. 고속 액체크로마토그래피의 조건은 상기에 나타낸 바와 같다.
얻어진 표준 시험액의 결과로부터, 검량선을 작성한다. 단계 희석한 각 표준 시험액에 대해서, 갈락토올리고당의 함유량을 가로축, 4'-GL과 내부 표준 물질의 면적비를 세로축으로 하여, 최소 제곱법에 의해 검량선을 구하고, 다음 식(검량선)을 얻을 수 있다.
면적비(y)=정수(a)×갈락토올리고당 함유량(x)
다음에 시료 용액의 결과로부터, 4'-GL과 내부 표준 물질의 면적비를 산출하고, 그 면적비를 상기의 검량선에 대입함으로써 시료 중의 갈락토올리고당 함유량을 산출하는 것이 가능해진다. 전처리 단계에서의 시료의 희석률 등에 입각하여 적당 산출 결과에 보충의 계산을 행함으로써 정확한 갈락토올리고당 함유량이 정량 된다.
이하, 실시예를 들어서 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 하등 제약되지 않는다.
실시예
비교예 1: 겔여과 크로마토그래피를 사용한 4'-GL의 정량
(1) 시료 용액의 조제
갈락토올리고당 액당(올리고메이트 55N: Yakult Pharmaceutical Industry)을 갈락토올리고당 함량으로서 2.3g/100g의 비율로 포함하고, 말토덱스트린을 1.5g/100g의 비율로 포함하는 육아용 조제 분유 2.6g을 칭량하고, 소량의 온수를 가해서 용해 후, 실온이 될 때까지 방치하고, 증류수를 가해서 20ml로 하여 용해유(溶解乳)를 제작했다. 용해유 4ml를 메스 플라스크에 넣고, 내부 표준 물질을 0.1% 함유하는 수용액 2ml를 정확하게 가하고, 증류수로 20ml로 하여 시료 용액(분유 101(GOS 첨가))으로 했다. 용해유 20ml당의 갈락토올리고당 함량은 2.6g×2.3/ 100=0.0598g이기 때문에, 100ml당에서는 0.299g이 된다.
또한, 육아용 조제 분유는 원재료로서, 유당, 훼이단백질 소화물, 팜유, 전분유, 팜핵 분별유, 대두백교유, 갈락토올리고당 액당, 카제인 칼슘, 말토덱스트린(전분 당화물), 정제 어유, 탄산 Ca, 염화 Mg, 레시틴, 인산 K, 염화 K, 인산 Na, 수산화 K, 락토페린, V.C, 염화 Ca, 피로인산철, 타우린, V.E, 황산 아연, 시스틴, 시티딜산 Na, 나이아신, 판토텐산 Ca, V.A, 황산동, 이노신산 Na, 우리딜산 Na, 구아닐산 Na, V.B1, 5'-AMP, V.B6, V.B2, 엽산, 카로텐, V.D, V.B12를 포함하고, 그 영양 성분은 표 1과 같다. 표 1의 탄수화물은 유당, 갈락토올리고당, 덱스트린, 단당을 포함한다.
Figure pct00001
(2) 플라세보 시료 용액의 조제
갈락토올리고당을 포함하지 않는 육아용 조제 분유로서, 분유 101(GOS 첨가)과 같은 조제 공정을 행하고, 플라세보 시료 용액(분유 102(플라세보))을 조제했다. 조제에 사용한 육아용 조제 분유는 갈락토올리고당 액당을 포함하지 않고, 말토덱스트린을 6.2g/100g의 비율로 포함하는 것 이외는, 원재료의 조성은 시료 용액(분유 101(GOS 첨가))을 작성한 육아용 조제 분유와 같은 것이다. 분유 101(GOS 첨가)에는 갈락토올리고당 액당 유래의 유당, 갈락토올리고당, 단당이 합계로 4.7g/100g 포함되어 있고, 분유 101(GOS 첨가)과 분유 102(플라세보)는 탄수화물량이 동일하다.
(3) 갈락토올리고당 표준 시험액의 조제
갈락토올리고당 액당(올리고메이트 55N: Yakult Pharmaceutical Industry)을 갈락토올리고당 액당으로서 2.0g/100ml이 되도록 50ml 용적 메스 플라스크에 칭량하고, 내부 표준 물질을 1% 함유하는 수용액 1ml를 정확하게 가하고, 증류수를 가해서 50ml로 하여 표준 시험액(OM55N)으로 했다.
(4) 말토덱스트린 표준 시험액의 조제
상기 육아용 조제 분유의 제조에 사용한 말토덱스트린 액당(하이 말토스 시럽)을 말토덱스트린 용액으로서 2.0g/100ml이 되도록 50ml 용적 메스 플라스크에 칭량하고, 내부 표준 물질을 1% 함유하는 수용액 1ml를 정확하게 가하고, 증류수를 가해서 50ml로 하여 표준 시험액(말토덱스트린)으로 했다.
(5) 필터 처리
시험 용액, 플라세보 시험 용액, 갈락토올리고당 표준 시험액 및 말토덱스트린 표준 시험액을 0.45㎛ 필터로 여과하고, 이하의 HPLC 조건으로 분석했다.
(6) HPLC 분석
Column : GPC(KS-802)(8.0×300mm)
Eluent : 증류수
Flow rate : 0.5ml/min
Detector : RI 검출기(Shodex SE-201)
Column temp : 80℃
그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 말토덱스트린에 포함되는 3당(말토트리오스:Mal-3)과 표준 시험액(OM55N)에 포함되는 3당의 4'-GL은 동일한 유지 시간에서 컬럼으로부터 용출하고 있고, 겔여과 크로마토그래피에서는 말토덱스트린 중의 말토트리오스와 갈락토올리고당 중의 4'-GL의 피크가 중복되어버려, 4'-GL을 정량할 수 없었다.
실시예 1: C30 컬럼을 사용한 PMP 유도체-HPLC 역상 크로마토그램
비교예 1과 동일하게 육아용 조제 분유의 시료 용액, 플라세보 시료 용액, 갈락토올리고당 표준 시험액, 말토덱스트린 표준 시험액을 조제했다. 갈락토올리고당 표준 시험액은 증류수로 10, 20, 40배 희석한 희석액을 더 제작했다. 희석액의 갈락토올리고당 액당의 농도는 각각 0.2g/100ml, 0.1g/100ml, 0.05g/100ml이다.
(1) PMP 유도체화
시료 용액, 갈락토올리고당 표준 시험액, 말토덱스트린 표준 시험액의 각각 100㎕를 나사구 시험관에 취하고, 0.6M NaOH 수용액을 100㎕ 가하고 교반했다. 이어서, 0.5M PMP 메탄올 용액을 200㎕ 가하고 교반했다. 70℃에서 30분 가열하고, PMP 유도체화했다. 실온까지 냉각한 후, 0.1M HCl 수용액 0.7ml를 가해서 약산성으로 하고 클로로포름으로 추출해서 과잉의 시약을 제거했다. 즉, 클로로포름 약 1ml를 가하고, 30초 이상 교반하고, 2500rpm, 5분간 원심 분리해서 하층의 클로로포름을 제거했다. 같은 조작을 2회 반복했다. 수층을 0.45㎛ 필터로 여과하고, 이하의 HPLC 조건으로 분석했다.
(2) HPLC 분석 조건
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)(C30)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
그 결과, 도 2의 점선으로 나타내는 바와 같이, 시료 용액(분유 101)으로 검출된 4'-GL의 피크는 플라세보 시료 용액(분유 102)에서는 검출되고 있지 않고, PMP에서의 유도체화 후, C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 고속 액체크로마토그래피에 제공함으로써, 4'-GL과 말토트리오스를 분리할 수 있는 것이 확인되었다.
(3) 갈락토올리고당 함량의 산출
갈락토올리고당 표준 시험액으로부터 제작한 희석액에 대해서, 상기와 동일한 분석 조건에서 HPLC에 제공하고, 내부 표준 물질과 4'-GL의 면적비를 이용하여, 갈락토올리고당 액당의 검량선을 작성했다. HPLC 분석의 결과는 표 2와 같다.
Figure pct00002
갈락토올리고당 액당의 함유량을 x, 면적비를 y로 하고, 최소 제곱법에 의해 검량선을 구하면, 검량선은 y=3.9909x이었다. 이 검량선의 y로서, 시료 용액 중의 내부 표준 물질과 4'-GL의 면적비(0.5526)를 대입하고, 시료 용액의 희석률 등을 감안하여 시료 중의 갈락토올리고당량을 산출했다(표 3). 구체적으로는 검량선 y=3.9909x에 y=0.5526을 대입하면, x(시료 용액 중의 갈락토올리고당 액당 농도)는 0.138(g/100ml)이 되었다. 시료 용액은 용해유를 5배 희석한 것이므로, 용해유 중의 갈락토올리고당 액당량은 0.138×5=0.690(g/100ml)이 된다. 액당 중의 고형분 함량은 75%, 고형분 중의 갈락토올리고당 함량은 56.4%이므로 용해유 중의 갈락토올리고당 함량은 0.690×0.75×0.564=0.292(g/100ml)이 된다. 용해유 중의 육아용 조제 분유의 농도는 2.6g/20ml이므로, 용해유 100ml에는 13g의 육아용 조제 분유가 포함되어 있고, 그 중에 0.292g/100ml의 갈락토올리고당이 포함되어 있기 때문에, 육아분유 100g당, 2.25g/100g의 갈락토올리고당이 포함되어 있는 것이 산출되고, 갈락토올리고당의 배합량(2.3g/100g)과 거의 일치했다.
Figure pct00003
비교예 2: C8, C18의 컬럼을 사용한 PMP 유도체-역상 HPLC 크로마토그램
갈락토올리고당 액당(올리고메이트 55N: Yakult Pharmaceutical Industry)을 갈락토올리고당 함량으로서 2.3g/100g의 비율로 포함하고, 말토덱스트린을 1.5g/100g의 비율로 포함하는 육아용 조제 분유 5g을 정밀하게, 소량의 온수를 가해서 용해 후, 실온이 될 때까지 방치했다. 내부 표준 물질을 1% 함유하는 수용액 1ml를 정확하게 가하고, 증류수를 가해서 50ml로 하고 시료 용액(분유 101(GOS 첨가))으로 했다.
또한, 갈락토올리고당을 포함하지 않는 육아용 조제 분유로서, 분유 101(GOS첨가)과 동일한 조제 공정을 행하고, 플라세보 시료 용액(분유 102(플라세보))을 조제했다. 조제에 사용한 육아용 조제 분유는 갈락토올리고당을 포함하지 않고, 말토덱스트린을 6.2g/100g의 비율로 포함하는 것 이외는 원재료의 조성은 시료 용액(분유 101(GOS 첨가))을 작성한 육아용 조제 분유와 같은 것이다.
갈락토올리고당 액당을 갈락토올리고당으로서 3.0g/100ml가 되도록 50ml 용적 메스 플라스크에 칭량하고, 내부 표준 물질을 1% 함유하는 수용액 1ml를 정확하게 가하고, 증류수를 가해서 50ml로 하고, 갈락토올리고당 표준 시험액으로 했다.
상기 육아용 조제 분유의 제조에 사용한 말토덱스트린 액당(하이 말토스 시럽)을 말토덱스트린 용액으로서 2.0g/100ml가 되도록 50ml 용적 메스 플라스크에 칭량하고, 내부 표준 물질을 1% 함유하는 수용액 1ml를 정확하게 가하고, 증류수를 가해서 50ml로 하고, 표준 시험액(말토덱스트린)으로 했다.
PMP 유도체화
시료 용액, 갈락토올리고당 표준 시험액, 말토덱스트린 표준 시험액의 각각 100㎕을 나사구 시험관에 취하고, 0.6M NaOH 수용액을 100㎕ 가하고 교반했다. 이어서, 0.5M PMP 메탄올 용액을 200㎕ 가하고 교반했다. 70℃에서 30분 가열하고, PMP 유도체화했다. 실온까지 냉각한 후, 0.1M HCl 수용액 0.7ml를 가해서 약산성으로 하고, 클로로포름으로 추출해서 과잉의 시약을 제거했다. 즉, 클로로포름 약 1ml를 가하고, 30초 이상 교반하고, 2500rpm, 5분간 원심 분리해서 하층의 클로로포름을 제거했다. 동일한 조작을 2회 반복했다. 수층을 0.45㎛의 필터로 여과하고, 하기의 2개의 HPLC 조건으로 분석했다.
HPLC 분석 조건
(1) C18 컬럼을 사용한 HPLC
Column : Inertosil ODS-3(4.6×250mm)(C18 역상 컬럼)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate : 1.0ml/min
Detectoion : UV 245nm
Column temp : 35℃
(2) C8 컬럼을 사용한 HPLC
Column : Imtakt UK-8(4.6×150mm)(C8 역상 컬럼)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate : 1.0ml/min
Detector : UV 245nm
Column temp : 35℃
그 결과, C18 역상 크로마토그래피용 컬럼에서는 4'-GL과 말토트리오스(Mal-3)는 분리하고 있지만, 4'-GL과 다른 갈락토올리고당 성분의 피크가 중복되어 있고, 4'-GL을 분리할 수는 없었다. 즉, 도 3에 나타내는 바와 같이, 갈락토올리고당표준 시험액(OM55N)과 시료 용액(분유 101)의 결과에 있어서, 4'-GL의 피크에서는 정점부의 좌측에 다른 물질의 피크가 중복되고, 단이 되어버리고 있었다.
C8 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 경우, 4'-GL과 말토트리오스(Mal-3)는 분리하고 있지만, 4'-GL과 다른 갈락토올리고당 성분의 피크가 중복되고, 분리될 수 없는 것이 확인된다(도 4). 즉, C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 경우(도 2)와 비교하면, 도 2에서는 4'-GL의 좌측에 인접하게 다른 갈락토올리고당 성분의 피크가 있는 것에 반해, 도 4에서는 상기 피크가 4'-GL의 피크와 중복되고, 결과적으로 피크가 높게 되고 있다. 이러한 결과로부터, C8, C18 컬럼 중 어느 것을 사용한 경우에도, 4'-GL을 분리, 정량할 수 없는 것이 나타내어졌다.
실시예 2: HPLC에 있어서의 용출액의 검토
비교예 2와 마찬가지로, 시료 용액(분유 101(GOS 첨가), 분유 102(플라세보)), 갈락토올리고당 표준 시험액 및 말토덱스트린 표준 시험액을 조제하고, 각각을 비교예 2와 동일하게 PMP 유도체화하여 이하 6종류의 HPLC 조건으로 분석했다.
(1) 완충액 pH4의 조건 하에서의 HPLC
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH4)/CH3CN(78/22)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
(2) 완충액 pH5의 조건 하에서의 HPLC
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH5)/CH3CN(79/21)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
(3) 완충액 pH7의 조건 하에서의 HPLC
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH7)/CH3CN(81/19)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
(4) 완충액 pH7의 조건 하에서의 HPLC
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH7)/CH3CN(82/18)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
(5) 완충액 pH8의 조건 하에서의 HPLC
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH8)/CH3CN(82/18)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
(6) 완충액 pH8의 조건 하에서의 HPLC
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH8)/CH3CN(83/17)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
실시예 1의 결과로부터, pH6의 인산 칼륨 완충액을 사용한 경우에는 4'-GL을 분리할 수 있고 있어, 갈락토올리고당의 정량이 가능했다. 이에 대하여 도 5, 7∼10에 나타내는 바와 같이, pH4, 7, 8의 인산 칼륨 완충액을 사용한 경우에는 4'-GL과 다른 갈락토올리고당 성분의 피크가 중복되어 버려, 4'-GL을 분리·정량할 수 없었다. 즉, 도 2에서는 4'-GL의 좌측에 인접하게 다른 갈락토올리고당 성분의 피크가 있는 것에 반해, pH4의 인산 칼륨 완충액을 사용한 경우에는 OM55N의 크로마토그램에서는 그 피크가 1개이고 4'-GL을 분리할 수 없다(도 5).
또한, 인산 칼륨 완충액(pH7)과 CH3CN을 81/19의 비율로 한 용출액을 사용한 경우(도 7), OM55N의 크로마토그램에서는 4'-GL의 피크의 정점부의 우측에 인접하게 다른 갈락토올리고당 성분의 피크가 중복되고, 결과적으로 4'-GL의 피크의 면적이 넓어지고 있다.
인산 칼륨 완충액(pH7)과 CH3CN을 82/18의 비율로 한 용출액을 사용한 경우(도 8), OM55N의 크로마토그램에서는 본래 4'-GL의 좌측에 인접하게 검출되는 피크가 없고, 그 피크와 4'-GL의 피크가 중복되어 있다.
인산 칼륨 완충액(pH8)과 CH3CN을 82/18의 비율로 한 용출액을 사용한 경우(도 9) 또는 83:17의 비율로 한 용출액을 사용한 경우(도 10), OM55N과 말토덱스트린의 크로마토그램을 비교하면, 4'-GL은 말토트리오스, 그 밖의 올리고당 성분과 분리할 수 있지만, OM55N과 플라세보 시료 용액(분유 102)의 크로마토그램을 비교하면, 4'-GL의 피크와, 분유 102에 포함되어 있는 성분의 피크가 일치하고 있어 4'-GL만을 분리할 수 없는 것이 확인된다.
한편, 인산 칼륨 완충액(pH5)과 CH3CN을 79/21의 비율로 한 용출액을 사용한 경우(도 6), 4'-GL은 말토트리오스 및 다른 갈락토올리고당 성분과 분리할 수 있었다.
실시예 3: 영양 식품을 시료로 한 경우의 PMP 유도체-역상 HPLC 크로마토그램(C30)
표 4에 나타내는 원재료를 혼합하고, 영양 식품을 조제했다. 이 영양 식품 10g에 증류수를 가해서 50ml로 한 후, 20000g×30분으로 원심 분리하고, 또한 20000g×30분으로 원심 분리했다. 원심 분리 후에는 영양 식품은 하층, 중간층, 상층의 3층으로 분리하고 있었다. 그 중간층을 분취하고, 그 분취한 시료를 0.45㎛의 필터로 여과했다. 별도, 표준 시료로서 갈락토올리고당 표준 시험액을 올리고메이트 55(Yakult Pharmaceutical Industry)를 이용하여, 비교예 1과 마찬가지로 조제했다. 여과한 시료와 갈락토올리고당 표준 시험액의 각각 100㎕를 나사구 시험관에 취하고, 감압 건고했다. 내부 표준 물질을 0.02% 함유하는 수용액 100㎕를 가하고, 0.5M의 PMP 메탄올 용액을 200㎕ 가하여 교반했다. 이어서, 70℃에서 30분 가열하고, PMP 유도체화하고, 이하의 HPLC 조건으로 분석했다.
Figure pct00004
HPLC 분석 조건
Column : Develosil RPAQUEOUS(4.6×250mm)
Eluent : 인산 칼륨 완충액(pH6)/CH3CN(80/20)
Flow rate : 1.0ml/min
Detection : UV 245nm
Column temp : 35℃
그 결과, 도 11에 나타내는 바와 같이, 4'-GL의 피크는 유지 시간 24.324분으로 출현하고, 샘플에 포함되는 그 밖의 성분으로부터 분리된 것이 판명되었다. 또한, 4'-GL의 피크는 유지 시간 24.324분에서 출현하는 것은 동일한 HPLC 분석 조건에서, 갈락토올리고당 표준 시험액을 분석하고, 확인 완료되었다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명의 검출·정량 방법에 의하면, 시료 중의 갈락토올리고당과 다른 성분을 간이하고, 저비용으로 분리하고, 정확하게 갈락토올리고당의 정량을 행할 수 있기 때문에, 상기 시료 중에 포함되는 갈락토올리고당의 양을 정확하게 관리할 수 있음과 아울러, 각종 유효성 시험 데이터의 취득, 표시 등을 정확하게 행하는 것이 가능해진다.

Claims (9)

  1. 갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료 중의 갈락토올리고당을 검출·정량하는 방법으로서, 상기 시료를 유도체화 시약과 반응시키고, 시료 중의 덱스트린 및 갈락토올리고당을 유도체화하고, 이어서 C30 역상 크로마토그래피용 컬럼을 사용한 고속 액체크로마토그래피에 의해 상기 시료 중의 갈락토올리고당 성분을 분리하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    고속 액체크로마토그래피에서 사용하는 용출액으로서, 완충액과 극성의 유기용매의 혼합액을 사용하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 완충액으로서, pH5∼6의 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 혼합액의 완충액과 극성의 유기 용매의 혼합비(vol/vol)가 완충액/극성의 유기 용매=79/21∼80/20인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합액의 조제에 사용하는 완충액으로서, 인산 칼륨 완충액, 시트르산 칼륨 완충액, 포름산 암모늄 완충액 및 아세트산 칼륨 완충액에서 선택되는 적어도 1종을 사용하고, 극성의 유기 용매로서 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올에서 선택되는 적어도 1종을 사용하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    갈락토올리고당과 덱스트린을 포함하는 시료는 음식품인 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    분리되는 갈락토올리고당 성분은 4'-갈락토실락토오스인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    유도체화 시약으로서, 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론, 2-아미노피리딘, 2-아미노벤즈아미드, 3-아미노퀴논, 4-아미노벤조산 에틸, 4-아미노벤조산 부틸, 4-트리메틸암모늄아닐린에서 선택되는 1종을 사용하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    C30 역상 크로마토그래피용 컬럼은 이중 결합이 있는 시스형의 알킬기를 갖는 고정상을 구비하는 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 검출·정량 방법
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